張楊波,蘭時(shí)樂,董新榮,黃建安,4,劉仲華,4,*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院,湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南長沙 410128; 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長沙 410128; 3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,湖南長沙 410128; 4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院,國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心,湖南長沙 410128)

紫甘薯是一類新型經(jīng)濟(jì)糧食作物[1],含有豐富的花色苷類色素。花色苷具有清除自由基、抗氧化、抗突變、改善肝功能、降低心血管疾病等多種生理活性[2-3]。紫甘薯花色苷類色素被世界衛(wèi)生組織列為不限量食品添加劑,色澤鮮艷,市場容量巨大[4],在食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)應(yīng)用廣泛[5]。目前,工業(yè)上常以酸水解或酸性醇溶液浸提紫甘薯花色苷[6-8],存在酸用量大、淀粉資源浪費(fèi)以及環(huán)境污染等問題。紫甘薯色素粗提液中含有雜質(zhì),會(huì)降低色素的穩(wěn)定性,一般采用大孔樹脂對(duì)色素進(jìn)行純化,具有工藝簡單、再生方便、成本低廉的特點(diǎn)[9]。紫甘薯中含有豐富的淀粉[10],人們?cè)谄渚C合利用方面進(jìn)行了有益的探索[11],利用淀粉含量高的特點(diǎn)發(fā)酵生產(chǎn)紫甘薯酒等[12-13]。但是,紫甘薯酒的市場有限。

紫甘薯花色苷類色素具有保健與著色的雙重作用,市場需求量大。目前,紫甘薯色素的提取過程中僅利用了含量相對(duì)很低的色素,而忽略了含量極高的淀粉的綜合利用。本文以綜合利用紫甘薯資源為出發(fā)點(diǎn),以α-淀粉酶處理紫甘薯獲得含花色苷的糖化溶液[14],再用大孔樹脂分離紫甘薯色素和糖化液,糖化液進(jìn)一步結(jié)合微生物法發(fā)酵生產(chǎn)乙醇,為紫甘薯的高附加值綜合利用提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫甘薯 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東之源超市;α-淀粉酶(2000 U/g) 邢臺(tái)思倍特生物公司;大孔樹脂HPD400 河北寶思公司;其余均為分析純?cè)噭?國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;釀酒酵母(Saccharomycesserevisiae) 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院提供;新鮮麥芽汁培養(yǎng)基 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院提供;種子培養(yǎng)基 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院提供。

DK-S24電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;250D恒溫培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;BSD-YX3600恒溫?fù)u床振蕩器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;LDZX-30KBS高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;UNICO 2000可見分光光度計(jì) 尤尼柯上海有限公司;PHS-3B pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;AX-200型萬分之一電子天平 日本Shimadzu Philippines公司;Vis-7220可見分光光度計(jì) 北京瑞麗分析儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程圖

1.2.2 紫甘薯酶解糖化液的制備 參考課題組已有方法[14]，將新鮮紫甘薯碾碎,稱取一定量碾碎的紫甘薯,按照α-淀粉酶添加量35 mg/g、料液比1∶5 (g/mL)在80 ℃水浴鍋中酶解1.0 h,共提取2次,合并濾液,待用。

1.2.3 紫色素與糖液的分離 HPD400分離紫色素和糖液參考文獻(xiàn)[15]。HPD400大孔樹脂60 g濕法裝入樹脂柱,用3倍體積的pH4.00總糖濃度為57.16～60.72 mg/L紫甘薯α-淀粉酶酶解液沖洗柱子,流速為1 BV/h通過樹脂,每隔30 min分管收集流出液,測定各管色素吸光值,直至在流出液中檢測出色素,樹脂達(dá)到吸附飽和。將上述吸附飽和樹脂用水洗至流出液無色,再依次用30%、50%、70%乙醇以0.5 BV/h流速通過樹脂柱洗脫色素,每隔30 min分管收集流出液,測定各管中溶液的吸光值,直至吸光值基本不變。分別回收溶劑,獲得紫甘薯色素流浸膏。流出糖液按100 g鮮紫甘薯濃縮至100 mL后于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 糖液發(fā)酵生產(chǎn)乙醇

1.2.4.1 酵母的純化與種子液的配制 菌種活化:將保存于4 ℃冰箱中的釀酒酵母接種于新鮮麥芽汁培養(yǎng)基斜面上,28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，備用。菌液培養(yǎng):將培養(yǎng)好的釀酒酵母接種于種子液培養(yǎng)基中,30 ℃、160 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)24 h,備用。

1.2.4.2 糖液發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的單因素實(shí)驗(yàn) 考察不同種類氮源對(duì)乙醇含量的影響:分別將0.91 g脲、0.07 g酵母粉、0.07 g豆餅粉、2.98 g蛋白胨、2.00 g(NH4)2SO4(氮的質(zhì)量均為0.21 g)加入100 mL濃縮糖液中,菌液接種量2.0 mL,在培養(yǎng)箱中發(fā)酵5 d后,測定發(fā)酵液中乙醇含量;考察(NH4)2SO4添加量對(duì)乙醇含量的影響:以(NH4)2SO4氮源,依次加入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g(N的質(zhì)量依次為0.10、0.21、0.31、0.42、0.53 g)于100 mL濃縮糖化液中,加入酵母種子液2.0 mL,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d,測定發(fā)酵液中乙醇含量;考察酵母接種量對(duì)乙醇含量的影響:以(NH4)2SO4氮源,其添加量為3.0 g/100 mL,依次加入濃度為1×108CFU/mL酵母種子液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d,測定發(fā)酵液中乙醇含量;考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)乙醇含量的影響:以(NH4)2SO4氮源,其添加量為3.0 g,依次加入酵母種子液1.5 mL,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3、4、5、6、7 d后,測定發(fā)酵液中乙醇含量。

1.2.5 乙醇發(fā)酵的正交及驗(yàn)證試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以乙醇含量為考察指標(biāo),用(NH4)2SO4用量、酵母接種量、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素與水平表如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

在正交優(yōu)化條件下,進(jìn)行三組平行實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證試驗(yàn)的可靠性。

1.2.6 分析方法

1.2.6.1 糖液檢測方法 總糖含量測定參考硫酸-蒽酮法[14]。取總糖稀釋液1 mL,加1 mL蒸餾水,搖勻后于冰水浴中加入8.00 mL硫酸-蒽酮,搖勻后放入沸水浴中加熱8 min,取出,冷卻至室溫后在590 nm下測定吸光值。帶入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算總糖濃度。計(jì)算公式如下:

C=(A-0.09043)/0.04207×n

式中:C:總糖濃度mg/L;A:測定吸光值;n:稀釋倍數(shù)。

1.2.6.2 色素及色價(jià)測定方法 紫甘薯色素的測定方法參考文獻(xiàn)[14]。移取3.00 mL提取液于10 mL容量瓶中,用3%檸檬酸溶液定容,搖勻。在530 nm處測定其吸光值。以吸光值的大小反應(yīng)色素的吸附效果,流出液的吸光值越小,吸附效果越好。

紫甘薯紫色素測定方法參考文獻(xiàn)[15]。稱取一定量的紫色素樣品溶于100 mL檸檬酸-磷酸氫二鈉的緩沖液中(pH=3.0),定容,搖勻。在530 nm下測定吸光值。具體計(jì)算公式如下:

式中:A為吸光值;m為樣品質(zhì)量(g)。

1.2.6.3 乙醇含量的測定 乙醇含量采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.48-2003測定,比重計(jì)法,以乙醇體積分?jǐn)?shù)計(jì)[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013對(duì)單因素進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,Origin 8.0制圖軟件制圖,SPSS 23.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花色苷與糖液的分離

在大孔樹脂靜態(tài)篩選及動(dòng)態(tài)吸附的基礎(chǔ)上(因受版面限制數(shù)據(jù)未列出),以HPD400大孔樹脂吸附紫甘薯酶解液中的紫色素至飽和后,再依次用30%、50%、70%乙醇洗脫色素,結(jié)果如圖2所示。

圖2 動(dòng)態(tài)洗脫曲線Fig.2 Dynamic elution curve

圖1 紫甘薯綜合利用流程圖Fig.1 Flow chart of comprehensive utilization of purple sweet potato

根據(jù)大孔樹脂上樣液與流出液中糖濃度分析結(jié)果顯示,上樣液中糖液濃度為56.1 mg/L,流出液中糖液濃度為55.5 mg/L,回收率達(dá)到94.93%。

2.2 糖液發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 氮源篩選 氮是發(fā)酵過程中微生物生長代謝所需的營養(yǎng)源,分為有機(jī)氮源和無機(jī)氮源?？疾炝瞬煌磳?duì)乙醇含量的影響,結(jié)果如圖3所示。

圖3 氮源對(duì)乙醇產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on yield of ethanol

2.2.2 氮源含量的確定 以(NH4)2SO4作為氮源,考察不同添加量對(duì)乙醇含量的影響,結(jié)果如圖4所示。

圖4 硫酸銨添加量對(duì)乙醇產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of the dosage of ammonium sulfate on yield of ethanol

由圖4可以看出,隨著(NH4)2SO4用量的增加,濃縮糖液發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的含量增高。(NH4)2SO4用量較低時(shí),提供的營養(yǎng)不夠,易生長雜菌,發(fā)酵得到的乙醇含量低。當(dāng)(NH4)2SO4用量為3.0 g/100 mL時(shí),乙醇含量最高,為7.5%vol。說明硫酸銨添加3.0 g/100 mL時(shí),為酵母發(fā)酵提供了最適宜的發(fā)酵環(huán)境。隨后,乙醇含量隨著(NH4)2SO4用量增加反而呈下降趨勢,發(fā)酵效果不好,這可能是由于發(fā)酵液pH過低,不宜酵母生長代謝[20]。因此,選用3.0 g/100 mL用量為最佳。

2.2.3 酵母接種液加入量對(duì)乙醇發(fā)酵的影響 濃度為1×108CFU/mL的酵母作為接種液,考察不同添加量對(duì)乙醇含量的影響,結(jié)果如圖5所示。

圖5 酵母接種量對(duì)乙醇產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of the dosage of yeast inoculation on yield of ethanol

在發(fā)酵過程中,酵母接種量是一個(gè)重要的變量。若用量少,易生長雜菌,同時(shí)發(fā)酵所需的時(shí)間延長,成本高;反之,酵母濃度過高,相互競爭,抑制發(fā)酵,還導(dǎo)致發(fā)酵液中的營養(yǎng)在前期被大量消耗,產(chǎn)酒量下降[21]。由圖5可知,酵母接種量為1.5 mL時(shí),乙醇含量最高，為9.0%vol。因此,選用1.5 mL為最佳酵母接種量。

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)乙醇發(fā)酵的影響 在其他因素的最佳條件下,考察不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)乙醇含量的影響,結(jié)果如圖6所示。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)乙醇產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of fermentation time on yield of ethanol

發(fā)酵過程中,發(fā)酵時(shí)間起著至關(guān)重要的作用。發(fā)酵時(shí)間短,會(huì)造成發(fā)酵不完全,不能得到足夠的發(fā)酵產(chǎn)物;發(fā)酵時(shí)間長,造成設(shè)備的能源浪費(fèi),不符合大規(guī)模生產(chǎn)的實(shí)際要求。由圖6可知,隨著發(fā)酵時(shí)間的增加,發(fā)酵所得酒精的乙醇含量呈現(xiàn)顯著(p<0.05)上升的趨勢,在第6 d達(dá)到最大值,為12.5%vol。發(fā)酵時(shí)間為7 d時(shí),乙醇含量隨時(shí)間的變化并沒有顯著變化。在發(fā)酵前期,糖液中營養(yǎng)充足,促使酵母生長繁殖迅速,發(fā)酵所產(chǎn)酒精量增長快。因此,發(fā)酵時(shí)間為6 d為宜。

2.3 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以酒精度為考察指標(biāo),以(NH4)2SO4用量、酵母接種量、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行三因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn),結(jié)果如表2所示。

表2 發(fā)酵產(chǎn)乙醇正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiments for production of ethanol by fermentation

由表2可知,影響發(fā)酵產(chǎn)乙醇的因素為:發(fā)酵時(shí)間>酵母接種量>(NH4)2SO4用量。發(fā)酵產(chǎn)乙醇的優(yōu)化條件為:A2B2C3即(NH4)2SO4用量為3.0 g/100 mL、酵母接種量為1.5 mL、發(fā)酵時(shí)間為7 d,此時(shí)乙醇含量為13.0%vol。

3 結(jié)論