王占一,廖成斌,公金艷,張 卓,湯銳睿,戴 博

(1.棗莊學(xué)院食品科學(xué)與制藥工程學(xué)院,山東棗莊 277160; 2.空軍總醫(yī)院藥學(xué)部,北京 100142)

石榴(PunicagranatumL.)是石榴科石榴屬多年生木本植物,全球各地區(qū)均有廣泛分布[1]。石榴作為一種常見的果樹,結(jié)果率高,尤其在成年樹上,結(jié)果過多,養(yǎng)分供不應(yīng)求,不僅影響果實(shí)的正常發(fā)育,形成許多小果、次果,還會削弱樹勢,易受凍害和感染病害,并使翌年減產(chǎn)造成小年。因此,除了由于果樹本身的調(diào)節(jié)能力,使發(fā)育不良的花和幼果自然脫落外,還需摘除多余的花或幼果,才能滿足生產(chǎn)上的要求[2]。疏果下樹的“石榴幼果”經(jīng)常作為廢物被丟棄,造成資源浪費(fèi)。近年來,大量研究證明黃酮類成分廣泛存在于植物幼果中,而且含量極其豐富,例如椪柑幼果[3]、桑葚幼果[4]、蜜楝幼果[5]等。而石榴幼果中是否含有黃酮類成分,國內(nèi)外鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。高文秀等[6-7]研究發(fā)現(xiàn),采用復(fù)合酶法提取植物中黃酮類成分,具有提取效率高、條件溫和、操作簡單、環(huán)境友好等諸多優(yōu)點(diǎn)。但是,有關(guān)復(fù)合酶法提取石榴幼果中黃酮類成分領(lǐng)域的研究,國內(nèi)還未見文獻(xiàn)報(bào)道。

近年來,隨著世界人口老齡化,糖尿病逐漸成為一種嚴(yán)重影響人類健康的常見病、多發(fā)病。因而,積極尋找糖尿病治療藥物早已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[8-9]。在臨床上,α-葡萄糖苷酶活性抑制劑發(fā)揮著重要作用,一直作為一線藥物來應(yīng)用,防止餐后高血糖的發(fā)生。植物中黃酮類成分具有顯著抑制α-葡萄糖苷酶活性,國內(nèi)學(xué)者在這方面的研究較多,例如陳浙江等[10]對41味中藥進(jìn)行體外抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性研究,馬錦錦等[11]考察了葛根異黃酮類化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用及構(gòu)效關(guān)系,均取得了較好的陽性結(jié)果。因此,本研究以魯南地區(qū)產(chǎn)石榴幼果為試驗(yàn)材料,纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶作為復(fù)合酶組成,通過D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)中的單純形質(zhì)心設(shè)計(jì)結(jié)合正交試驗(yàn)法,優(yōu)化復(fù)合酶提取石榴幼果總黃酮的最佳工藝條件,并對提取產(chǎn)物進(jìn)行抑制α-葡萄糖苷酶活性的初步研究,為石榴資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴幼果 采自魯南地區(qū)嶧城“萬畝石榴園”核心產(chǎn)區(qū),經(jīng)棗莊學(xué)院李思健副教授鑒定為正品石榴科石榴(PunicagranatumL.)的幼果,石榴幼果材料在50 ℃條件下干燥72 h,粉碎,過24目篩,備用;蘆丁對照品(含有量>98%,批號:100080-201602)、阿卡波糖對照品(含有量>99%,批號:100808-201203) 中國食品藥品檢定研究院;纖維素酶(酶活≥20000 U/g)、果膠酶(酶活≥50000 U/g)、木瓜蛋白酶(酶活≥200000 U/g) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;α-葡萄糖苷酶(酶活約為25000 U/g) 西安沃爾森生物技術(shù)有限公司;D101大孔吸附樹脂 上海源葉生物科技有限公司;4-硝基苯-a-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)、對硝基苯酚(PNP)、無水乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸鈉等 天津市大茂化學(xué)試劑廠;蒸餾水 棗莊學(xué)院生物學(xué)省級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心提供。

SYNERGYH1型全功能酶標(biāo)儀 美國柏騰儀器有限公司;759型紫外-可見分光光度計(jì) 上海奧譜勒儀器有限公司;BP211DAG電子天平 德國Satorius公司;FW135型多功能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 鞏義予華儀器有限責(zé)任公司;RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;SHB-B95A型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;PHS-3C型數(shù)顯酸度計(jì) 杭州奧利龍儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 石榴幼果中總黃酮的提取和純化方法 精密稱取石榴幼果粉末5.0 g,置于250 mL干燥錐形瓶中,按照試驗(yàn)設(shè)計(jì),加入一定配比的復(fù)合酶(纖維素酶-果膠酶-木瓜蛋白酶)至一定的加酶量,再加入一定pH的磷酸鹽緩沖液至一定的料液比例,用保鮮膜封住瓶口。于一定溫度的水浴鍋中,不停攪拌,酶解反應(yīng)至一定的時間。反應(yīng)結(jié)束后,立即在沸水中滅酶10 min,抽濾,濾液定容至100 mL(如果濾液超過100 mL,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至90 mL,再定容)。取濾液適量用D-101大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附,75%乙醇洗脫后,用0.45 μm微孔濾膜過濾,減壓蒸干后得到石榴幼果總黃酮固形物,稱重,備用。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 單因素實(shí)驗(yàn)中,復(fù)合酶選用等比例混合酶(纖維素酶-果膠酶-木瓜蛋白酶=1∶1∶1)[6-7],其他固定不變的條件為:加酶量為3.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、料液比1∶15、介質(zhì)pH4.5、酶解溫度50 ℃、酶解時間4.0 h?？疾旒用噶?1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%)、料液比(1∶9、1∶12、1∶15、1∶18、1∶21 g/mL)、介質(zhì)pH(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)、酶解溫度(30、40、50、60、70 ℃)和酶解時間(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h)對石榴幼果總黃酮提取效果的影響。

1.2.3 D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)優(yōu)化復(fù)合酶配比 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用D-混料設(shè)計(jì)中的單純型質(zhì)心設(shè)計(jì)[12-13],優(yōu)化3種酶(纖維素酶-果膠酶-木瓜蛋白酶)的最佳比例。D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)試驗(yàn)中,設(shè)定加酶量3.0%、料液比1∶15、介質(zhì)pH4.5、酶解溫度50 ℃,酶解時間4.0 h。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化 分析D-最優(yōu)混料試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果,結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以料液比(A)、介質(zhì)pH(B)、酶解溫度(C)和酶解時間(D)作為自變量,進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),優(yōu)化復(fù)合酶提取石榴幼果總黃酮的最佳提取工藝條件[14-15]。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中,設(shè)定復(fù)合酶組成為D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果所得到的數(shù)值,加酶量為3.0%。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Vairbles and levels of orthogonal experimental design

1.2.5 黃酮含量的測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定:參照文獻(xiàn)[16]的方法,略有改動。精密稱取蘆丁對照品10.0 mg,用75%乙醇溶解并定容至50 mL容量瓶中,即得200 μg/mL的蘆丁對照品溶液。依次稀釋成100、50、25、12.5、6.25、0 μg/mL,加入5% NaNO2、10%Al(NO3)3和4% NaOH溶液,靜置20 min,在510 nm 波長處測定吸光度,以吸光度(A)對濃度(C)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程A=0.008C-0.0017(r=0. 9995),在0～200 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

準(zhǔn)確稱取精制后的石榴幼果總黃酮5.0 mg,用75%乙醇定容至25 mL,作為樣品溶液,測定A值,計(jì)算樣品中總黃酮得率及純度。

式(1)

式(2)

1.2.6 石榴幼果總黃酮抑制α-葡萄糖苷酶活性

1.2.6.1 PNP(P-Nitrophenol,對硝基酚)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參考文獻(xiàn)[17]試驗(yàn)方法,略有改動。用PBS緩沖液(pH6.8)配制PNP母液,并依次稀釋成2.4、1.2、0.6、0.3、0.15、0 mmol/L濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0 mL,加入1 mol/L的Na2CO3溶液1.0 mL,混勻后靜置1 min,用酶標(biāo)儀在405 nm波長下測定吸光度。以吸光度(A)對濃度(C)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求得回歸方程為:A=0.3426C-0.0015(r=0.9994,n=6),線性范圍為:0～1.2 mmol/L。

1.2.6.2 抑制率的測定 參考文獻(xiàn)[18]試驗(yàn)方法,略有改動。在96孔板中加樣,將試驗(yàn)分成5組(n=3):樣品組:依次加入160 μL PBS緩沖液(pH6.8),20 μLα-葡萄糖苷酶溶液(6 U/mL)和20 μL樣品溶液,37 ℃恒溫15 min,加入40 μL PNPG(P-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷)溶液(4.8 mmol/L),37 ℃恒溫30 min,加入80 μL Na2CO3溶液(1.5 mol/L)中止反應(yīng),在405 nm波長下,應(yīng)用酶標(biāo)儀測定吸光度。樣品空白組:以PBS緩沖液代替酶液,其它試劑同樣品組。陰性對照組:以PBS緩沖液代替樣品溶液,其它試劑同樣品組?？瞻捉M:以PBS緩沖液代替酶液和樣品溶液,其它試劑同樣品組。阿卡波糖組:以與樣品溶液相同濃度梯度的阿卡波糖代替樣品溶液,其它試劑同樣品組。根據(jù)公式(3)計(jì)算石榴幼果總黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制率,并計(jì)算抑制劑對底物的IC50值。

式(3)

式中:A1、A2、A3和A4分別為樣品組、樣品空白組、陰性對照組和空白組的吸光度。

1.2.6.3 酶抑制動力學(xué)分析 大量預(yù)實(shí)驗(yàn)得知,反應(yīng)體系α-葡萄糖苷酶反應(yīng)初速率維持時間≥32 min。固定樣品溶液濃度(1.50 mg/mL)和底物PNPG濃度(4.8 mmol/L),α-葡萄糖苷酶濃度依次設(shè)定為2、4、6、8、10 U/mL,分為2組進(jìn)行試驗(yàn),一組加入石榴幼果總黃酮5 mL,另一組以PBS溶液代替石榴幼果總黃酮,作為陰性對照,分別測定兩組反應(yīng)初速率(V)[19-21]。以加入反應(yīng)體系前的α-葡萄糖苷酶濃度為橫坐標(biāo),初速率為縱坐標(biāo)作圖,確定石榴幼果總黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制是否屬于可逆性抑制類型。

分別以濃度遞增的PNPG(1.6、3.2、4.8、6.4、8.0 mmol/L)為底物,加入不同濃度(0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mg/mL)的石榴幼果總黃酮,分別測定其在25 min時的吸光度。以加入反應(yīng)體系前底物PNPG濃度的倒數(shù)(1/[S])為橫坐標(biāo),反應(yīng)速率的倒數(shù)(1/V)為縱坐標(biāo)作圖,確定石榴幼果總黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制反應(yīng)的類型[19]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)采用Design-Expert 8.0.5統(tǒng)計(jì)分析軟件,圖形制作采用Excel和OriginPro 8.0數(shù)據(jù)處理軟件(n=3)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 加酶量 由圖1可知,加酶量在1.0%～3.0%范圍內(nèi),隨著加酶量的增大,石榴幼果總黃酮得率逐漸提高。當(dāng)加酶量超過3.0%后,繼續(xù)增大加酶量,總黃酮得率不再發(fā)生明顯變化,考慮生產(chǎn)成本問題,確定加酶量為3.0%左右。

圖1 加酶量對石榴幼果總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on the yield of total flavonoids

2.1.2 料液比 由圖2可知,料液比1∶15左右,石榴幼果總黃酮得率最高,繼續(xù)增大料液比,總黃酮得率反而略有降低,原因是溶劑量過大,在后續(xù)處理中,有效成分會有損失,因此,確定料液比為1∶15左右。

圖2 料液比對石榴幼果總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of solid/liquid ratio on the yield of total flavonoids

2.1.3 介質(zhì)pH 由圖3可知,隨著介質(zhì)pH的升高,石榴幼果總黃酮得率逐漸提高,當(dāng)介質(zhì)pH為4.5時,總黃酮得率達(dá)到最大值。介質(zhì)pH超過4.5后,總黃酮得率呈下降趨勢。原因是復(fù)合酶只有在最佳pH條件下,才能發(fā)揮最佳效應(yīng),因此確定介質(zhì)pH4.5左右。

圖3 介質(zhì)pH對石榴幼果總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of medium pH on the yield of total flavonoids

2.1.4 酶解溫度 由圖4可知,酶解溫度為50 ℃時,總黃酮得率達(dá)到最大值。低于或者高于50 ℃,總黃酮得率相對較低。原因是復(fù)合酶只有在最佳酶解溫度下,才能發(fā)揮最佳效應(yīng),因此酶解溫度應(yīng)控制在50 ℃左右。

圖4 酶解溫度對石榴幼果總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of enzyme hydrolysis temperature on the yield of total flavonoids

2.1.5 酶解時間 由圖5可知,酶解時間在2.0～4.0 h之間時,隨著酶解時間的延長,石榴幼果總黃酮得率不斷提高,超過4.0 h后,繼續(xù)延長酶解時間,總黃酮得率升高趨勢不明顯,考慮到實(shí)際生產(chǎn)問題,控制酶解時間為4.0 h左右。

圖5 酶解時間對石榴幼果總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of enzyme hydrolysis time on the yield of total flavonoids

2.2 D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)

采用Design-Expert 8.0.5軟件給定的試驗(yàn)方案安排實(shí)驗(yàn),優(yōu)化復(fù)合酶中纖維素酶(X1)、果膠酶(X2)和木瓜蛋白酶(X3)的最優(yōu)配比,以石榴幼果總黃酮得率(Y)作為預(yù)測響應(yīng)值,每個試驗(yàn)號平行試驗(yàn)3次,取平均值作為試驗(yàn)結(jié)果,試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2,因素方差分析結(jié)果見表3。

表2 D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Arrangement and corresponding results of D-optimal mixture design

表3 D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis for D-optimal mixture design

對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,得到石榴幼果總黃酮得率(Y)的回歸方程為:

Y=2.25X1+2.00X2+1.83X3+3.30X1X2+2.73X1X3+0.66X2X3

式(4)

圖6為3個自變量之間交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖,響應(yīng)面圖開口向下,說明石榴幼果總黃酮得率的最大響應(yīng)值存在于曲面上,能夠得到3種酶最佳配比值。纖維素酶(X1)和果膠酶(X2)、纖維素酶(X1)和木瓜蛋白酶(X3)之間交互作用極顯著(p<0.01)。從回歸方程一次項(xiàng)系數(shù)可以看出,3種酶對于石榴幼果總黃酮得率的影響先后順序?yàn)?X1>X2>X3,而這種影響直接體現(xiàn)在復(fù)合酶最優(yōu)配比上。

圖6 復(fù)合酶配比對總黃酮得率的三角曲面圖與等高線圖Fig.6 Triangular surface and contour plot for complex enzyme ratio on the yield of total flavonoids

通過統(tǒng)計(jì)分析得到復(fù)合酶最優(yōu)配比為:纖維素酶44.2%、果膠酶31.6%、木瓜蛋白酶24.2%。在上述最優(yōu)復(fù)合酶配比條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn),得到石榴幼果總黃酮平均得率為3.19%±0.01%,與模型預(yù)測值3.25%較為接近,說明應(yīng)用D-最優(yōu)混料試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的復(fù)合酶最優(yōu)配比是可信、可靠的。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)和D-最優(yōu)混料試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)基礎(chǔ)上,固定加酶量為3.0%,選擇料液比(A)、介質(zhì)pH(B)、酶解溫度(C)和酶解時間(D)為考察因素,采用正交設(shè)計(jì)安排試驗(yàn),試驗(yàn)安排及結(jié)果見表4,方差分析結(jié)果見表5。

表4 正交試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 4 Arrangement and corresponding results of orthogonal experimental design

表5 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 5 Results of variance analysis for orthogonal experimental design

方差分析表明,影響石榴幼果總黃酮得率的因素主次順序?yàn)槊附鉁囟?C)>酶解時間(D)>介質(zhì)pH(B)>料液比(A),C具有極顯著性,而A、B和D無顯著性影響,得出最佳提取工藝為A3B3C2D2。即:料液比1∶18,介質(zhì)pH5.0,酶解溫度50 ℃,酶解時間4.0 h。

2.4 最佳工藝條件的驗(yàn)證

稱取3份干燥石榴幼果粉末各5 g,按照最優(yōu)混合酶比例以及優(yōu)化工藝提取,總黃酮得率平均值為3.38%±0.015%,RSD為0.444%,表明提取工藝穩(wěn)定可靠。

2.5 石榴幼果總黃酮抑制α-葡萄糖苷酶活性

應(yīng)用公式(2)計(jì)算得出純化后的石榴幼果總黃酮固體物質(zhì)純度約為66.5%,通過含量換算,將該純化物依次配制成濃度為0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1 mg/mL的石榴幼果總黃酮樣品溶液,用于抑制α-葡萄糖苷酶活性測定,以阿卡波糖作為陽性對照。以加入反應(yīng)體系前抑制劑的濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)的抑制率為縱坐標(biāo),繪制抑制曲線,見圖7。

圖7 石榴幼果總黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制作用濃度效應(yīng)曲線Fig.7 Concentration-effect curve about anti-α-glucosidase activity of total flavonoids

由圖7可知,在0.15～1.5 mg/mL范圍內(nèi),隨著濃度的增加,石榴幼果總黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制率明顯增加,當(dāng)濃度達(dá)為1.5 mg/mL時,抑制率達(dá)到63.9%。石榴幼果總黃酮濃度與對α-葡萄糖苷酶的抑制率之間存在著一正相關(guān)性,擬合方程為y=37.41x+10.40,決定系數(shù)R2=0.989。通過擬合方程算出石榴幼果總黃酮對PNPG抑制作用的IC50=1.059 mg/mL[22]。同理,阿卡波糖對PNPG抑制作用的IC50=0.490 mg/mL,石榴幼果總黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制活性低于阿卡波糖。

圖8和圖9為酶抑制動力學(xué)曲線。由圖8可知,加入石榴幼果總黃酮組與其陰性對照組,所得到的兩條酶濃度-反應(yīng)初速率曲線均近似通過了原點(diǎn),說明石榴幼果總黃酮對α-葡萄糖苷酶的抑制類型屬于可逆性抑制。由圖9可知,石榴幼果總黃酮抑制α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk曲線,不同濃度各組均在X軸負(fù)半軸幾乎交于一點(diǎn),說明底物濃度升高不能降低石榴幼果總黃酮的抑制活性,具備非競爭性抑制作用特點(diǎn)[23]。以PNPG為底物測定天然產(chǎn)物抑制α-葡萄糖苷酶活性的大小是目前最常用的α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選方法。在判斷酶抑制類型時,Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖分析是一種非常有效的方法,作圖后如果得到一組相較于Y軸的直線,則為競爭性抑制,如果得到一組相交于X軸的直線,則為競爭性抑制,如果得到一組平行的直線,則為反競爭性抑制,如果得到一組相交于第二或第三象限的直線,則為混合型抑制[24-25]。石榴幼果中總黃酮對α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖交于X軸負(fù)半軸,屬于非競爭性抑制。

圖8 酶濃度-反應(yīng)初速率曲線Fig.8 Enzyme concentrate-initial reaction rate curve

圖9 石榴幼果總黃酮的Lineweaver-Burk曲線Fig.9 Lineweaver-Burk curve of total flavonoids

3 結(jié)論

本試驗(yàn)將D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)應(yīng)用于復(fù)合酶(纖維素酶-果膠酶-木瓜蛋白酶)的比例優(yōu)化,得到纖維素酶44.2%、果膠酶31.6%、木瓜蛋白酶24.2%的復(fù)合酶,進(jìn)而得到石榴幼果總黃酮的最佳提取條件為:料液比1∶18 (g/mL)、介質(zhì)pH5.0、酶解溫度50 ℃、酶解時間4.0 h,石榴幼果總黃酮得率為3.38%,其濃度為1.5 mg/mL時,對α-葡萄糖苷酶抑制率達(dá)到63.9%,總黃酮與其對α-葡萄糖苷酶抑制效果之間呈現(xiàn)一定的正相關(guān)關(guān)系,其抑制機(jī)理屬于可逆性抑制和非競爭性抑制。現(xiàn)有臨床應(yīng)用的α-葡萄糖苷酶抑制劑降血糖作用機(jī)制表明,抑制劑往往是通過在小腸中和α-葡萄糖苷酶底物競爭性地結(jié)合到催化活性位點(diǎn),來達(dá)到減少底物的分解以降低血糖的目的,其作用機(jī)制是明顯的競爭性抑制。但是,這種抑制往往受到底物濃度的影響,如果存在高濃度的底物時,這種抑制作用非常弱,甚至達(dá)不到抑制的效果,因此,應(yīng)用這類競爭性抑制劑控制餐后血糖時,還要嚴(yán)格控制飲食的攝糖量[18]。而石榴幼果中總黃酮對于底物的抑制,屬于非競爭性抑制類型,底物濃度升高不能降低石榴幼果總黃酮的抑制活性,抑制作用與其自身濃度有關(guān),而與底物濃度關(guān)系較小。治療糖尿病時,可以通過增大自身劑量來增強(qiáng)抑制效果。石榴幼果總黃酮具有作為新一代α-葡萄糖苷酶抑制劑的潛在開發(fā)價(jià)值,后續(xù)研究可以追蹤相應(yīng)的活性單體成分,并對其抑制機(jī)理作進(jìn)一步深入研究。