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        酪蛋白酶解物的分離及其抗氧化活性

        2019-06-24 08:05:02楊繼濤王元元王萬超
        食品工業(yè)科技 2019年9期
        關鍵詞:解液抗氧化性酪蛋白

        韓 娜,楊 敏,楊繼濤,王元元,張 雪,王萬超

        (甘肅農(nóng)業(yè)大學理學院,農(nóng)業(yè)資源化學與應用研究所,甘肅蘭州 730070)

        酪蛋白是乳中一大類蛋白質(zhì)的總稱,又稱干酪素,含量約為乳中蛋白質(zhì)的80%[1]。酪蛋白含有人體必需的8種氨基酸,有著較高的營養(yǎng)價值和良好的功能特性,廣泛應用于食品、化學和醫(yī)藥工業(yè)[2-4]。酪蛋白也是生物活性肽的良好來源,已從酪蛋白中分離得到多種生物活性肽,如阿片樣肽、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽、抗菌肽、免疫調(diào)節(jié)肽、磷酸肽等[5-11]。

        近年來,眾多學者研究了酪蛋白酶解物的分離及其抗氧化性。研究表明,酪蛋白的胃蛋白酶水解物分子量在913~2951 Da的肽段具有較好的自由基清除能力[12]。α-酪蛋白經(jīng)高壓、紫外輻照、遠紅外輻照處理后,DPPH自由基清除能力和還原力增強[13]。牦牛乳酪蛋白經(jīng)中性蛋白酶和胰蛋白酶復合酶解后,產(chǎn)物抗氧化性最高[14]。羊乳酪蛋白的堿性蛋白酶水解物自由基清除力和亞鐵螯合力較未酶解酪蛋白強[15]。中性蛋白酶酶解后,酪蛋白的DPPH清除活性最強[16]。由此可見,酪蛋白酶解后產(chǎn)生的肽段抗氧化活性強于未酶解酪蛋白。胃蛋白酶和胰蛋白酶是生物體內(nèi)主要的蛋白水解酶,而酪蛋白的胃蛋白酶和胰蛋白酶連續(xù)水解物的抗氧化性研究鮮有報道。

        眾多學者分別采用超濾[17]、凝膠過濾色譜[18]、離子交換[19]、Sephadex G-15凝膠層析和DEAE-52樹脂分離技術獲得了具有高抗氧化活性的肽段[20],而且證明采用不同分離技術所得肽段的抗氧化性具有差異[19]。綜上所述,酪蛋白酶解物不同片段具有不同抗氧化活性,高活性肽段的分離純化是酪蛋白抗氧化性肽制備的關鍵,而不同樹脂分離機理不同,因而所獲得的酪蛋白肽的分子量、氨基酸組成、凈電荷等均有差異,從而表現(xiàn)出不同的活性[21-22]。已有文獻多采用陰離子交換樹脂或大孔樹脂對酪蛋白酶解物進行分離,而采用陽離子樹脂分離的相關研究鮮有報道。

        本論文采用胃蛋白酶和胰蛋白酶對牛乳酪蛋白進行連續(xù)水解,采用成本低廉的001陽離子交換樹脂對酶解物進行分離,系統(tǒng)分析酪蛋白多肽的抗氧化性,獲得具有較高抗氧化性的多肽,旨在為酪蛋白抗氧化肽的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)尋求簡單的分離工藝、廉價的分離材料。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        荷斯坦牛乳 蘭州源生奶牛養(yǎng)殖專業(yè)合作社牛奶廠;001樹脂陽離子交換樹脂 上海匯珠樹脂有限公司;透析袋(100~500 Da) 上海源葉生物科技有限公司;胃蛋白酶(10 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg) 電泳純,上海源葉生物科技有限公司;鹽酸、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)、鄰苯二甲醛(OPA)、四硼酸鈉 天津市化學試劑三廠;賴氨酸、抗壞血酸 天津市光復精細化工研究所;大豆卵磷脂 鄭州萬博食品配料有限公司;2-硫代巴比妥酸、β-巰基乙醇、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、無水乙醇 天津醫(yī)藥化學有限公司;氯化亞鐵、三氯乙酸、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、三氯化鐵 天津市凱信化學工業(yè)有限公司;鐵氰化鉀、菲洛嗪 天津市光復科技發(fā)展有限公司;2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚 薩恩化學技術有限公司;上述試劑均為分析純。

        3K-15高速冷凍離心機 德國Sigma公司;JJ224BC型電子天平 常熟市雙杰測試儀器廠;PHS-3C pH計 上海三信儀器廠;恒溫水浴磁力攪拌器 金壇市順華儀器有限公司;TGL-16G臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;TU-1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;FD-1A-50冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;FSJ-A03D1粉碎機 小熊電器股份有限公司。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 酪蛋白的提取 參考楊敏等[23]的方法,將新鮮荷斯坦牛乳在高速冷凍離心機中離心15 min(溫度4 ℃,轉(zhuǎn)速6000 r/min),棄去上層脂肪,取其下清液逐滴加入1 mol/L的HCl,并且緩慢攪拌使其沉降,靜置4 h后用紗布過濾,用蒸餾水洗滌沉淀4次,即得鹽酸沉淀酪蛋白;將其置于冷凍干燥機中于-40 ℃冷凍干燥48 h。將干燥好的酪蛋白粉碎,裝袋后置于冰箱4 ℃冷藏備用。

        1.2.2 酪蛋白的水解

        1.2.2.1 胃蛋白酶與胰蛋白酶先后連續(xù)水解制備酶解液(P+T) 準確稱取1.0 g酪蛋白,加入30 mL蒸餾水溶解,45 ℃加熱磁力攪拌,溶解過程中加1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH始終控制在2.0左右,直到酪蛋白溶解后用蒸餾水定容至50 mL。向酪蛋白溶液中加入300 μL質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的胃蛋白酶,在pH2.0的條件下恒溫水浴37 ℃磁力攪拌3 h,酶解結束后在沸水浴中5 min滅酶活性,冷水中迅速冷卻。然后用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH,控制在7.0左右,再加入400 μL質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的胰蛋白酶,在37 ℃ pH7.0的條件下磁力攪拌(2000 r/min)水解3 h,酶解結束后置于沸水浴5 min滅酶活性,冷水中迅速冷卻。

        1.2.2.2 胃蛋白酶酶解液(P)制備 準確稱取1.0 g酪蛋白,加入30 mL蒸餾水溶解,45 ℃加熱磁力攪拌,溶解過程中加1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH始終控制在2.0左右,直到酪蛋白溶解后,用蒸餾水定容至50 mL。向酪蛋白溶液中加入300 μL質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的胃蛋白酶,在pH2.0的條件下恒溫水浴37 ℃磁力攪拌(2000 r/min)水解3 h,酶解結束后置于沸水浴5 min滅酶活性,冷水中迅速冷卻。

        1.2.2.3 胰蛋白酶水解液(T)制備 準確稱取1.0 g酪蛋白,加入30 mL蒸餾水溶解,45 ℃加熱磁力攪拌,溶解過程中加1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH始終控制在7.0左右,直到酪蛋白溶解后,用蒸餾水定容至50 mL。向酪蛋白溶液中加入400 μL質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的胰蛋白酶,在37 ℃,pH7.0的條件下磁力攪拌(2000 r/min)水解3 h,酶解結束后置于沸水浴5 min滅酶活性,冷水中迅速冷卻。

        1.2.3 酪蛋白水解度的測定

        1.2.3.1 賴氨酸標準曲線的繪制 OPA試劑的配制(現(xiàn)配現(xiàn)用):準確稱取40 mg OPA溶于1.00 mL 95%乙醇溶液中,移取pH9.5的0.1 mol/L四硼酸鈉緩沖溶液25.00 mL、20%(W/V)的SDS溶液2.50 mL、100 μLβ-巰基乙醇混合均勻,用蒸餾水定容至50 mL[24]。

        稱取賴氨酸0.0500 g,用蒸餾水定容至100 mL,配成濃度為500 μg/mL的溶液。分別移取適量賴氨酸溶液,稀釋成對應濃度400、300、200、100、50 μg/mL。取上述賴氨酸溶液400 μL,用pH7.0的磷酸鹽緩沖液稀釋至7.5 mL;取上述溶液200 μL,加入6.00 mL OPA試劑,混合均勻后室溫下暗室放置5 min,以200 μL蒸餾水和6.00 mL OPA試劑混合液為空白對照,測定340 nm下的吸光度;以賴氨酸濃度(c)作為橫坐標,吸光度值作為縱坐標,繪制標準曲線[24]。

        1.2.3.2 水解度的測定 取400 μL酪蛋白的胃蛋白酶(P)、胰蛋白酶(T)以及胃蛋白酶結合胰蛋白酶(P+T)酶解液或未加酶的酪蛋白溶液(20 mg/mL),用pH7.0的磷酸鹽緩沖液稀釋至7.5 mL;取200 μL上述酶解液,加入6.00 mL OPA試劑,混合均勻后室溫下暗室放置5 min,以200 μL蒸餾水和6.00 mL OPA試劑混合液為空白對照,測定樣品在340 nm下的吸光度。酪蛋白水解度公式[24]如下。

        水解度(%)=[(A-A0)/A0]×100

        式中:A0:未加酶樣品的吸光值;A:酶解后樣品的吸光值。

        1.2.4 酪蛋白多肽的分離

        1.2.4.1 離子交換樹脂的預處理 飽和食鹽水浸泡:稱取250 g 001樹脂置于燒杯中,倒入飽和食鹽水,使飽和食鹽水完全浸沒樹脂,并不斷攪拌以除去氣泡,使之充分混合,靜置24 h。

        水洗:將泡好的樹脂裝入分離柱中,用2倍柱體積的飽和食鹽水緩慢沖洗樹脂,然后用蒸餾水洗至無黃色液體流出。

        堿洗:用5倍柱體積4%的NaOH溶液浸泡,再用蒸餾水沖洗至中性。

        酸洗:用5倍柱體積4%的HCl浸泡,再用蒸餾水沖洗至中性。

        1.2.4.2 多肽的分離 鑒于胃蛋白酶和胰蛋白酶共同酶解的程度較高,產(chǎn)生的多肽較多,因此本文只針對兩種酶的共同酶解物(P+T)進行了分離。在室溫條件下,將(P+T)酶解液50 mL流過001陽離子交換樹脂層析柱,采用氯化鈉梯度洗脫,氯化鈉濃度為0~3%,洗脫液總體積為1500 mL,分管收集分離出的液體,每管收集15 mL,洗脫液用紫外-可見分光光度計在280 nm處測定吸光度。以體積為橫坐標,洗脫液吸光度為縱坐標繪制洗脫曲線。

        根據(jù)洗脫曲線,合并同一洗脫峰,置于透析袋(100~500 Da)中透析24 h,采用冷凍干燥機于-40 ℃冷凍干燥48 h,即得酪蛋白多肽。

        1.2.5 抗氧化性測定

        1.2.5.1 還原力的測定 參考Gu等[25]的方法,準確稱取適量酪蛋白肽,用蒸餾水配制成1.0 mg/mL的溶液;將不同酶解液稀釋至濃度為1.0 mg/mL,備用;分別取上述溶液1 mL,與1.0 mL 0.2 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.6)和1.0 mL 1%的鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]混合。將反應混合物在50 ℃水浴中溫育20 min,冷卻至室溫后加入1.0 mL 10%三氯乙酸,混合液25 ℃ 4000 r/min離心10 min。取離心后上清液2.0 mL,加入2.0 mL蒸餾水和400 μL 0.1% FeCl3混勻。使用紫外-可見分光光度計在700 nm下測量反應混合物的吸光度。用700 nm處的吸光度表示還原力。

        1.2.5.2 DPPH自由基清除活力的測定 參考Benjakul等[26]的方法,將2.0 mL 1.0 mg/mL的多肽溶液或酶解液加入到4.0 mL 0.1 mmol/L DPPH的乙醇溶液中。將溶液劇烈混合,并在室溫下于黑暗中靜置20 min。將混合物在4000 r/min下離心10 min。使用紫外-可見分光光度計在517 nm測量上清液的吸光度,記為A1;用等體積乙醇溶液替代DPPH溶液,吸光值記為A2,等體積水代替樣品溶液,吸光值記為A0;等體積水和乙醇混合溶液調(diào)零。DPPH自由基清除力計算如下:

        清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

        1.2.5.3 Fe2+螯合力的測定 將2.0 mL 濃度為1.0 mg/mL的多肽或酶解液與3.7 mL蒸餾水和0.1 mL濃度為2.0 mmol/L的FeCl2混合,將混合物在室溫下靜置30 s;加入0.2 mL濃度為5 mmol/L菲洛嗪并混合,在室溫下靜置10 min,于4000 r/min離心5 min;用紫外-可見分光光度計測定562 nm處的吸光度,記為A1。用水代替樣品作為空白,以相同的方式進行測定,記為A2。Fe2+螯合力計算公式[25]如下:

        螯合率(%)=(1-A1/A2)×100

        1.2.5.4 脂質(zhì)過氧化抑制力的測定 參考Yi等[27]的方法,將卵磷脂懸浮于磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L,pH7.4)中,配制成濃度為10.0 mg/mL的溶液,標記為LLS。將15 g三氯乙酸(TCA)、0.37 g硫代巴比妥酸(TBA)和 2 mL濃HCl加入到蒸餾水中,將體積調(diào)節(jié)至100 mL,標記為TCA-TBA-HCl。將1 mL LLS、1.0 mL 400 μmol/L FeCl3、1.0 mL 400 μmol/L抗壞血酸和1.0 mL 1.0 mg/mL的多肽或酶解液依次混合。將溶液在37 ℃黑暗的水浴中放置60 min,再加入2.0 mL TCA-TBA-HCl?;旌弦涸?0~100 ℃水浴加熱15 min后用冰水冷卻。將溶液以750 r/min離心10 min,采用紫外-可見分光光度計于532 nm處測定上清液的吸光度,記為As。用1.0 mL蒸餾水替代樣品,吸光度記為Ac。脂質(zhì)過氧化抑制力按下式計算:

        抑制力(%)=(Ac-As)/Ac×100

        1.3 數(shù)據(jù)處理

        各組數(shù)據(jù)均為3次實驗的平均值±標準偏差,采用SPSS 18.0進行顯著性分析,采用Origin 8.5作圖。

        2 結果與分析

        2.1 酪蛋白水解度

        賴氨酸標準曲線如圖1所示。經(jīng)線性擬合,得到賴氨酸標準曲線方程為y=0.00101x+0.03978,方程擬合度R2為0.9998,可以滿足實驗要求。

        圖1 賴氨酸標準曲線Fig.1 Standard curve of lysine

        經(jīng)標準曲線方程計算得知,酪蛋白的胃蛋白水解程度為60.64%±2.36%,酪蛋白胰蛋白酶的水解度為84.40%±1.70%,雙酶連續(xù)水解程度為138.20%±5.74%。

        2.2 酪蛋白多肽的分離

        圖2為(P+T)酪蛋白酶解液經(jīng)001陽離子交換樹脂分離的洗脫曲線。001陽離子交換樹脂對(P+T)的分離效果較好,在30~90 mL處出現(xiàn)一個峰,標記為P1;在105~210 mL處出現(xiàn)第二個峰,標記為P2;在300~330 mL處出現(xiàn)第三個峰,標記為P3;在600~1110 mL處出現(xiàn)多個小峰,合并后標記為P4;在1200 mL之后出現(xiàn)的峰極小,棄去。

        圖2 酪蛋白(P+T)酶解液洗脫曲線Fig.2 Elution curve of casein enzymatic hydrolysate(P+T)

        2.3 酪蛋白多肽的抗氧化活性

        2.3.1 還原力 對分離獲得的4種酪蛋白多肽和不同酶解液進行還原力測定,結果見圖3。由圖3可以看出,與分離所得的酪蛋白肽相比,P和(P+T)酶解液的還原力最低,且差異不顯著(p>0.05);T的還原力約為0.026,是P和(P+T)兩種酶解液的兩倍;多肽P4的還原力最大,其還原力為0.165;P1略低于P4,為0.151;P2和P3的還原力差異不顯著(p>0.05)。酪蛋白多肽的還原力順序為P4>P1>P3>P2。(P+T)酶解液經(jīng)過分離后獲得的酪蛋白肽在相同濃度下還原力顯著強于酶解液(p<0.05),可見經(jīng)過001樹脂分離,棄去了還原力較差的多肽,實現(xiàn)了還原力較高的多肽的富集。

        圖3 酪蛋白酶解液及多肽的還原力Fig.3 Reducing powers of casein enzymatic hydrolysate and peptides注:不同字母表示差異顯著,p<0.05;圖4~圖6同。

        多肽的抗氧化性是多種因素綜合作用的結果,如氨基酸組成、氨基酸序列、分子量、空間結構等。酪蛋白酶解液成分復雜,不同酶的水解位點不同,酶解產(chǎn)生的多肽C端和N端氨基酸類型不同,致使不同酶解液的還原力不同。據(jù)報道,甲硫氨酸殘基因含有硫原子而具有供電子能力,從而表現(xiàn)出較強的還原力;甘氨酸側鏈上的氫原子使多肽具有較好的構象柔性;脯氨酸的吡咯烷環(huán)可以阻止多肽的α-螺旋結構生成,這些氨基酸的存在有利于多肽中其他氨基酸殘基抗氧化性的發(fā)揮[28-31]。

        2.3.2 DPPH自由基清除活力 對分離獲得的4種酪蛋白多肽和不同酶解液進行DPPH自由基清除活力測定,結果見圖4。由圖4可以看出,幾種酶解液中,P的DPPH自由基清除活性最高,且與其它酶解液差異顯著(p<0.05);(P+T)酶解液的DPPH自由基清除活性最差。分離所得的4個肽段DPPH自由基清除活力較酶解液高。多肽P4的自由基清除率為19.03%±0.41%。P2和P3的自由基清除活性差異不顯著(p>0.05)。

        圖4 酪蛋白酶解液及多肽的DPPH自由基清除力Fig.4 DPPH radical scavenging activity of casein enzymatic hydrolysate and peptides

        DPPH法測定多肽的抗氧化性是基于單電子轉(zhuǎn)移機理,評價的是多肽供電子能力,即還原性[32-33]。研究證明,組氨酸、半胱氨酸具有供電子能力,從而表現(xiàn)出自由基清除活性[34-35]。據(jù)此推斷,P4中組氨酸和半胱氨酸百分含量可能較高。

        2.3.3 Fe2+螯合能力 對(P+T)酶解液分離獲得的4種酪蛋白多肽和不同酶解液進行Fe2+螯合力的測定,結果見圖5。由圖5可以看出,不同酪蛋白酶解液的Fe2+螯合力約為31%~33%,差異不顯著(p>0.05)。經(jīng)陽離子交換樹脂分離所得的酪蛋白肽P1、P2、P3不具備Fe2+離子螯合能力,而P4的Fe2+螯合力為94.95%±0.07%。

        圖5 酪蛋白酶解液及多肽的Fe2+螯合力Fig.5 Fe2+ chelating activity of casein enzymatic hydrolysate and peptides

        研究表明,組氨酸的咪唑基團可以螯合金屬離子;酸性氨基酸如谷氨酸、天門冬氨酸帶負電的側鏈具有較好的金屬螯合能力;堿性氨基酸賴氨酸也具有金屬螯合能力[36]。胰蛋白酶的酶切位點為精氨酸和賴氨酸的羧基,從而使賴氨酸位于肽鏈的一端,有利于其金屬螯合能力的發(fā)揮。賴氨酸含量較高的多肽具有較多的凈電荷,在陽離子樹脂上具有較好的吸附能力,采用高濃度的鹽才能將其置換下來,所以洗脫峰越靠后,越有可能表現(xiàn)出金屬螯合力,P4的出峰順序證明了這一推斷。另外,DPPH自由基清除能力測定結果顯示,P4中組氨酸、半胱氨酸含量可能較高,而組氨酸具有較好的金屬螯合能力,這是P4表現(xiàn)出極好地金屬螯合能力的另一個可能原因,但是有待進一步證明。

        2.3.4 脂質(zhì)過氧化抑制力 3種(P+T、P、T)酶解液和4種酪蛋白多肽的脂質(zhì)過氧化抑制力見圖6。由圖6可以看出,P表現(xiàn)出較好的脂質(zhì)過氧化抑制力,抑制率為51.78%±0.06%;T的脂質(zhì)過氧化抑制力為14.83%±0.12%;(P+T)酶解液的抑制力極低,為0.39%±0.0029%。就多肽而言,僅有P4具有極低的抑制力,為0.89%±0.0067%,可忽略。

        圖6 酪蛋白酶解液及多肽的脂質(zhì)過氧化抑制力Fig.6 Inhibition on lipid peroxidation of casein enzymatic hydrolysate and peptides

        疏水性氨基酸具有較好的脂溶特性,如亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸等,從而易表現(xiàn)出較好的脂質(zhì)過氧化抑制能力[37-38]。胃蛋白酶的酶切位點為苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸殘基,使其位于多肽鏈的一端,因而表現(xiàn)出較好的脂質(zhì)過氧化抑制力。當上述多肽再次被胰蛋白酶酶切后,多肽分子量和氨基酸組成均發(fā)生了很大變化,且其親水性增強,所以抑制力降低。雖然P4表現(xiàn)出較好地還原力、DPPH自由基清除力和金屬螯合力,但因其親水性較強,所以脂質(zhì)過氧化抑制力極弱。

        3 結論

        以牛乳酪蛋白為原料,經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶連續(xù)水解后通過001陽離子交換樹脂分離,獲得4個肽段,分離效果較好。對酪蛋白的胃蛋白酶酶解液、胰蛋白酶酶解液、胃蛋白酶+胰蛋白酶連續(xù)酶解液和分離所得的4個肽段分別進行抗氧化性研究發(fā)現(xiàn),分離所得酪蛋白肽的還原力和DPPH自由基清除能力遠高于3種酶解液。就Fe2+螯合力而言,混合多肽P4表現(xiàn)出極高的Fe2+螯合能力,螯合率高達94.95%,3種酶解液的Fe2+螯合能力相當,而酪蛋白肽P1、P2、P3不具備Fe2+螯合能力。在脂質(zhì)過氧化抑制方面,酪蛋白的胃蛋白酶酶解液表現(xiàn)出較好的抑制力,其次為胰蛋白酶酶解液,多肽及胃蛋白酶+胰蛋白酶連續(xù)酶解液幾乎不具有脂質(zhì)過氧化抑制力。

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