李圓圓,田晨穎,劉曉美,李 婷,王 笑,高 鵬,代 龍

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,山東濟(jì)南 250300)

豆類營(yíng)養(yǎng)活性高、保健功能強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)豐富、藥食俱佳[1]。但它質(zhì)地堅(jiān)硬、不易消化、且嚼之有苦澀味[2]。大多數(shù)研究主要是通過(guò)發(fā)酵黑豆來(lái)轉(zhuǎn)化其中的營(yíng)養(yǎng)成分,但發(fā)酵工藝相對(duì)比較復(fù)雜。研究表明,發(fā)芽處理后的黑豆口感好風(fēng)味佳,更易于被人體吸收利用,具有廣闊的開發(fā)前景和消費(fèi)市場(chǎng)[3]。

黑豆中主要含有異黃酮、氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽和植酸等成分,主要的活性成分是異黃酮[4]。黑豆中異黃酮苷成分主要是大豆苷和染料木苷,苷元成分主要是大豆苷元和染料木素[5]。黑豆中的異黃酮成分具有預(yù)防更年期綜合征、骨質(zhì)疏松、降低膽固醇、抗氧化、抗癌等功能[6]。研究表明,只有游離型的苷元才是主要活性成分,但黑豆中大部分以糖苷形式存在[7]。翟瑋瑋[8]研究發(fā)現(xiàn),發(fā)芽能激發(fā)黑豆自身β-葡萄糖苷酶的活性,促進(jìn)異黃酮糖苷向異黃酮苷元轉(zhuǎn)化。黑豆中植酸屬于抗?fàn)I養(yǎng)因子,不僅能與鈣、鐵、鋅、鉀等許多金屬離子形成不溶性的螯合物,還能與蛋白質(zhì)結(jié)合,降低蛋白質(zhì)的生物效價(jià)和功能特性,也能抑制淀粉酶、胰蛋白酶的活性,嚴(yán)重破壞體內(nèi)正常的生理活動(dòng)[9]。

近年來(lái),學(xué)者們開始重視微量元素對(duì)黑豆中各成分含量的影響。李菊艷等[10]研究發(fā)現(xiàn),B、Mn、Cu、Zn、Mo、Fe 微量元素的復(fù)合使用更有利于大豆異黃酮含量的積累。李冬梅等[11]研究發(fā)現(xiàn),Mg、B、Mn、Cu、Fe五種微量元素的含量在一定范圍內(nèi)時(shí),大豆中染料木素等異黃酮含量最高。在發(fā)酵豆粕的過(guò)程中添加無(wú)機(jī)鹽或向經(jīng)過(guò)發(fā)酵處理的豆粕中添加無(wú)機(jī)鹽共熱都能使發(fā)酵豆粕中富含微量元素鰲合物,如微量元素螯合鋅、銅等[12]。但是黑豆添加微量元素發(fā)芽,是否使黑豆中異黃酮、多肽和氨基酸等累計(jì)卻鮮有報(bào)道。本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)考察黑豆發(fā)芽和添加微量元素發(fā)芽過(guò)程中異黃酮、異黃酮苷元、異黃酮苷、多肽、游離氨基和植酸的含量變化,并測(cè)定了微量元素的轉(zhuǎn)化率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石油醚 天津市富宇精細(xì)化工有限公司;乙醇 天津市富宇精細(xì)化工有限公司;染料木素(KS0924CA14)、大豆苷元(Y08N7Y104)、大豆苷(Y18J8H40159)、染料木苷(20131106)、甘氨酸(J16S8R43981) 上海源葉生物科技有限公司;硫酸鋅 天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心;硫酸錳 天津博迪化工股份有限公司;硫酸銅 天津市鼎盛鑫化工有限公;硫酸亞鐵 天津市福晨化學(xué)試劑廠;磷酸氫二鈉 天津市大茂化學(xué)試劑廠;磷酸二氫鉀 天津市鼎盛鑫化工有限公司;黑豆 黑龍江牡丹江某市場(chǎng);以上試劑均為分析純。

FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;DKS-16型恒溫水浴鍋 嘉興市中興醫(yī)療儀器有限公司;TDL-5-A低速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱 林茂科技(北京)有限公司;FA22048電子天平 上海佑科儀器儀表有限公司;CN-A320B型豆芽機(jī) 佛山市順德區(qū)嘉壕實(shí)業(yè)有限公司;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;RE-52系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;LC-2030 高效液相色譜儀、UV-1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑豆清水發(fā)芽樣品的制備及指標(biāo)的檢測(cè)

1.2.1.1 黑豆清水發(fā)芽樣品的制備 挑選飽滿、色澤正常的黑豆40 g,平均分成5份,用去離子水洗凈表面,用75%乙醇溶液消毒10 min,用去離子水洗至無(wú)乙醇味,加入5倍量去離子水于25 ℃避光條件下浸泡6 h,取出,再次用去離子水將泡發(fā)的黑豆種子清洗干凈,料液置于豆芽機(jī)中(豆芽機(jī)用前置于10%～20%(v/v)的硝酸溶液中浸泡24 h,然后用去離子水沖洗干凈),25 ℃環(huán)境溫度下發(fā)芽,以去離子水噴灑,每24 h為豆芽機(jī)更換一次去離子水,并對(duì)豆芽機(jī)和黑豆進(jìn)行清洗。測(cè)量黑豆芽長(zhǎng),選取2、4、6、8、10、12、14、16 cm芽長(zhǎng)的黑豆,用去離子水清洗其表面后,置于50 ℃烘箱中烘干5 h。然后粉碎,過(guò)40目篩,置索氏提取器中,用石油醚(60～90 ℃)抽提5小時(shí)脫脂,豆粕揮去石油醚,即黑豆清水發(fā)芽樣品,備用。

1.2.1.2 芽長(zhǎng)的測(cè)定 黑豆發(fā)芽72 h時(shí),用最小刻度為0.1 cm的直尺測(cè)定芽最頂端到最底端的距離。

1.2.2 微量元素添加量對(duì)黑豆發(fā)芽的影響

1.2.2.1 硫酸鋅濃度對(duì)黑豆生長(zhǎng)特性的影響 將黑豆按照1.2.1.1進(jìn)行清洗處理,分別加入5倍量20、25、30、35、40 mg/L濃度的ZnSO4溶液,于25 ℃避光條件下浸泡6 h,取出,再次用去離子水將泡發(fā)的黑豆種子清洗干凈,料液置于豆芽機(jī)(處理方法見(jiàn)1.2.1.1)中,25 ℃環(huán)境溫度下發(fā)芽,以濃度分別為20、25、30、35、40 mg/L的ZnSO4溶液噴灑,每24 h為豆芽機(jī)更換一次溶液,并對(duì)豆芽機(jī)和黑豆進(jìn)行清洗。記錄并計(jì)算黑豆發(fā)芽率及芽長(zhǎng)。

1.2.2.2 硫酸錳濃度對(duì)黑豆生長(zhǎng)特性的影響 將硫酸鋅溶液換為硫酸錳溶液,硫酸錳濃度換為10、15、20、25、30 mg/L,其余同1.2.2.1。

1.2.2.3 硫酸銅濃度對(duì)黑豆生長(zhǎng)特性的影響 將硫酸鋅溶液換為硫酸銅溶液,硫酸銅濃度換為5、10、15、20、25 mg/L,其余同1.2.2.1。

1.2.2.4 硫酸亞鐵濃度對(duì)黑豆生長(zhǎng)特性的影響 將硫酸鋅溶液換為硫酸亞鐵溶液,硫酸亞鐵濃度換為10、15、20、25、30 mg/L,其余同1.2.2.1。

1.2.2.5 添加微量元素發(fā)芽黑豆樣品的制備 同1.2.1.1將去離子水改為硫酸鋅30 mg/L、硫酸錳20 mg/L、硫酸銅10 mg/L、硫酸亞鐵20 mg/L的混合溶液。選取2、4、6、8、10、12、14、16 cm芽長(zhǎng)的黑豆,用去離子水清洗其表面后,置于50 ℃烘箱中烘干5 h。然后粉碎,過(guò)40目篩,置索氏提取器中,用石油醚(60～90 ℃)抽提5小時(shí)脫脂,豆粕揮去石油醚,即黑豆添加微量元素發(fā)芽樣品,備用。

1.2.3 黑豆中總異黃酮的含量測(cè)定 以染料木素為對(duì)照品,用70%乙醇配制濃度為0.05 mg/mL的對(duì)照品溶液。分別移取0、0.08、0.16、0.24、0.32、0.4 mL,加70%乙醇補(bǔ)足至5 mL,搖勻在260 nm處測(cè)定吸光度,分別以染料木素濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為y=124.75x+0.0018(R2=0.9997)。準(zhǔn)確量取1.2.4.1項(xiàng)下的黑豆異黃酮提取液0.1 mL,用70%乙醇稀釋,在260 nm處測(cè)定吸光度[13]。

1.2.4 高效液相色譜法測(cè)發(fā)芽黑豆中異黃酮苷元和異黃酮苷的含量

1.2.4.1 黑豆芽溶液的制備 取黑豆清水發(fā)芽和添加微量元素發(fā)芽樣品適量,精密稱定,加入20倍量60%乙醇,70 ℃下超聲提取30 min,得異黃酮提取液,抽濾,將濾液置于4 ℃下冷藏48 h后,4500 r/min離心10 min,取上清液,進(jìn)樣10 μL,按1.2.4.2方法進(jìn)行大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素含量測(cè)定。

1.2.4.2 異黃酮苷元含量的測(cè)定 異黃酮苷元含量采用含量占比大的大豆苷、染料木苷含量之和表示。大豆苷、染料木苷標(biāo)準(zhǔn)品混合儲(chǔ)備液,稀釋配成濃度0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.00、1.20 mg/mL的對(duì)照品溶液,色譜條件為大豆苷元和染料木素的測(cè)定:TSK gel ODS-100V色譜柱(4.6 mm×25 cm,5 μm);甲醇:0.5%磷酸(60∶40)為流動(dòng)相;254 nm下檢測(cè),進(jìn)樣量20 μL。以峰面積為橫坐標(biāo)、濃度為橫縱坐標(biāo)作圖,得到以下線性方程:

大豆苷:y=2635.8x+102.4(R2=0.9997),線性范圍:0.05～1.2 mg/mL。

染料木苷:y=1972.8x-89.6(R2=0.9998),線性范圍:0.05～1.2 mg/mL。

待測(cè)黑豆芽溶液中經(jīng)過(guò)HPLC上樣測(cè)定得到峰面積,代入回歸方程中得到大豆苷和染料木苷的含量。

黑豆中異黃酮苷含量(mg/g)=大豆苷含量(mg/g)+染料木苷含量(mg/g)

1.2.4.3 異黃酮苷含量的測(cè)定 異黃酮苷含量采用含量占比大的大豆苷元和染料木素之和表示。大豆苷元和染料木素標(biāo)準(zhǔn)品混合儲(chǔ)備液,稀釋配成濃度0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2 mg/mL的對(duì)照品溶液,色譜條件為流動(dòng)相換為甲醇:0.5%磷酸(40∶60,V/V),其余同異黃酮苷元。以峰面積為橫坐標(biāo)、濃度為橫縱坐標(biāo)作圖,得到以下線性方程:

大豆苷元:y=3356.3x-1123.5(R2=0.9997),線性范圍:0.05～1.2 mg/mL。

染料木素:y=2018.4x+86.3(R2=0.9999),線性范圍:0.05～1.2 mg/mL。

待測(cè)黑豆芽溶液中經(jīng)過(guò)HPLC上樣測(cè)定得到峰面積,代入回歸方程中得到大豆苷元和染料木素含量。

黑豆中異黃酮苷元的含量(mg/g)=大豆苷元含量(mg/g)+染料木素含量(mg/g)

1.2.5 多肽和氨基酸的含量測(cè)定

1.2.5.1 多肽和氨基酸的提取 取黑豆清水發(fā)芽和添加微量元素發(fā)芽樣品粉末適量,精密稱定,按料液比1∶20 g/mL加入去離子水,用1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH=8,搖勻,于55 ℃水浴中提取1 h,取出,5000 r/min離心10 min,取上清液,用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH=4.5,搖勻后靜置20～30 min,5000 r/min離心15 min,傾出上清液,備用。

1.2.5.2 多肽的測(cè)定 精密稱取牛血清白蛋白對(duì)照品適量,加入去離子水溶解,制成0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,分別加水至1.0 mL,再分別加入堿性銅試液1.0 mL,混勻,加入福林酚試液4.0 mL后立即混勻,置55 ℃水浴中反應(yīng)5 min,取出,置冷水浴中冷卻10 min,以無(wú)牛血清添加為空白,在650 nm波長(zhǎng)處迅速測(cè)定吸光度。以牛血清白蛋白濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度值縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為y=2.947x+0.0605(R2=0.9994)[14]。精密移取1.2.5.1中提取的多肽溶液0.05 mL按上述方法測(cè)得吸光度,計(jì)算1.2.5.1中樣品的多肽含量。

1.2.5.3 游離氨基酸含量測(cè)定 精密稱取甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)品適量,加去離子水制成0.2 mg/mL的甘氨酸溶液,精密量取0.0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL甘氨酸溶液,分別置25 mL具塞試管中,加去離子水至1.0 mL,再加入pH=8.0的磷酸鹽緩沖液0.5 mL和2%茚三酮顯色劑0.5 mL,混勻后置沸水浴中加熱15 min,冷卻后用去離子水定容至25 mL后放置10 min,在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,以甘氨酸濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為y=5.7575x-0.2387(R2=0.999)[15]。精密移取1.2.5.1中提取的多肽溶液0.05 mL,相同方法測(cè)定570 nm下的吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中游離氨基酸含量。

1.2.5.4 高效凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定發(fā)芽前后肽分子量分布 取牛血清白蛋白(66430 Da),低分子肝素鈉(3700 Da),人血管緊張素Ⅱ(1045.5 Da)、乙氨酰乙氨酰乙氨酸(189.1 Da)對(duì)照品適量,精密稱定,用流動(dòng)相配制成 1 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液,以TSK gel G2000 SWXL(300 mm×7.8 m)為色譜柱;0.1 mol/L PBS+0.1 mol/L Na2SO4(pH=6.7)為流動(dòng)相;流速為0.5 mL/min,280 nm檢測(cè)條件下進(jìn)樣10 μL,得到混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖[16]。然后將1.2.5.1中提取的多肽溶液也在該色譜條件下進(jìn)樣20 μL,得到供試品色譜圖。

1.2.6 黑豆發(fā)芽樣品中微量元素含量的測(cè)定

1.2.6.1 發(fā)芽樣品中Zn、Cu和Fe含量的測(cè)定 取黑豆清水發(fā)芽和添加微量元素發(fā)芽過(guò) 粉末樣品各0.2 g,精密稱定,分別置于微波消解罐中,加入硝酸20 mL,旋緊旋塞放置1 h后,按表1進(jìn)行消解,消解完冷卻后取出,在通風(fēng)櫥中緩慢打開旋塞排氣,用少量水沖洗內(nèi)蓋后,超聲脫氣5 min,將消解液轉(zhuǎn)移至50 mL 的容量瓶中,用水定容至刻度,搖勻備用,同時(shí)制備空白試驗(yàn)[17-19]。采用火焰原子吸收光譜法測(cè)定消解液中Zn、Cu和Fe的吸光度,得到其工作曲線。并根據(jù)Zn、Cu和Fe的工作曲線計(jì)算含量,儀器工作條件見(jiàn)表2。

表1 微量元素梯度消化數(shù)據(jù)Table 1 Data on gradient digestion of trace elements

表2 火焰原子吸收光譜的工作條件Table 2 Working conditions of flame atomic absorption spectrum

Zn:y=0.24710x+0.0025,R2=0.9996;

Cu:y=106527.4615x+17343.3326,R2=0.9965;

Fe:y=0.03382x+0.0012,R2=0.9996。

1.2.6.2 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測(cè)定Mn的含量 樣品消解方法同1.2.6.1。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測(cè)定消解液中Mn的吸光度,得到其工作曲線y=0.09772x+0.0020,R2=0.9997。并根據(jù)Mn的工作曲線計(jì)算含量,儀器工作條件見(jiàn)表3。

表3 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀的工作條件Table 3 Working conditions of the inductively coupled plasma mass spectrometer

1.2.6.3 微量元素轉(zhuǎn)化率的計(jì)算 有機(jī)微量元素是指金屬元素與蛋白質(zhì)、小肽、氨基酸、有機(jī)酸、多糖衍生物等配位體通過(guò)共價(jià)鍵或離子鍵結(jié)合而形成的絡(luò)合物或螯合物[20]。

有機(jī)微量元素轉(zhuǎn)化率(%)=(供試品中微量元素含量-種子中微量元素含量)×100/發(fā)芽過(guò)程中微量元素吸收量

1.2.7 植酸的含量測(cè)定

1.2.7.1 供試品溶液的制備 取黑豆清水發(fā)芽和添加微量元素發(fā)芽粉末樣品適量,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,加入10倍量硫酸鈉-鹽酸提取溶液,振蕩提取2 h,提取液于5000 r/min 離心5 min,收集全部上清液并用硫酸鈉-鹽酸提取溶液定容至25 mL。

1.2.7.2 植酸的測(cè)定 取植酸鈉對(duì)照品適量,精密稱定,以去離子水為溶劑,制得0.1 mg/mL的對(duì)照品溶液。準(zhǔn)確吸取上述對(duì)照品溶液 0.0、0.04、0.1、1.0、2.0、5.0 mL于具塞試管中,分別用去離子水稀釋至5 mL,加入反應(yīng)溶液4.0 mL(三氯化鐵-磺基水楊酸反應(yīng)溶液,使用前用水稀釋15倍),混勻靜置20 min后,于500 nm處測(cè)定吸光度,分別以植酸濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程y=-2.8297x+0.7734(R2=0.9998)[21]。取1.2.7.1制備樣品0.05 mL,使用該方法測(cè)定500 nm吸光度,根據(jù)回歸方程計(jì)算植酸含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性分析,應(yīng)用Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 微量元素添加量的確定

由表4可知,硫酸鋅濃度為35 mg/L、硫酸亞鐵濃度為25 mg/L時(shí),豆芽芽體有褐變,芽長(zhǎng)也變短,且與黑豆清水發(fā)芽組相比差異極顯著(p<0.01),因此選擇硫酸鋅30 mg/L、硫酸亞鐵20 mg/L作為最適濃度;當(dāng)硫酸錳濃度為30 mg/L、硫酸銅濃度為25 mg/L時(shí),對(duì)豆芽的狀態(tài)無(wú)明顯影響,但與黑豆清水發(fā)芽組差異極顯著(p<0.01)。考慮到黑豆發(fā)芽過(guò)程中對(duì)不同微量元素富集能力的大小和人體對(duì)微量元素的吸收能力[22],選擇硫酸鋅30 mg/L、硫酸錳20 mg/L、硫酸銅10 mg/L、硫酸亞鐵20 mg/L作為最適添加濃度。

表4 微量元素濃度對(duì)黑豆生長(zhǎng)特性的影響Table 4 Effects of microelement concentration on growth characteristics of black beans

2.2 黑豆發(fā)芽過(guò)程中異黃酮含量

由圖1可以看出,在黑豆清水發(fā)芽過(guò)程中總異黃酮含量先增加后減少,芽長(zhǎng)12 cm時(shí)達(dá)到最大值,為5.54 mg/g,比未發(fā)芽黑豆異黃酮總量增長(zhǎng)89.73%。添加微量元素發(fā)芽過(guò)程中,總異黃酮含量先急速增加后緩慢減少,在芽長(zhǎng)6 cm時(shí)達(dá)到最大值,為4.45 mg/g,與未發(fā)芽的經(jīng)過(guò)微量元素處理的黑豆相比增長(zhǎng)52.40%。黑豆清水和添加微量元素發(fā)芽后,異黃酮總含量增加,原因是黑豆發(fā)芽過(guò)程中呼吸作用加強(qiáng),酶的種類和數(shù)量明顯增加,促進(jìn)了異黃酮的合成[23]。但是黑豆添加微量元素發(fā)芽異黃酮含量較清水少,原因可能為添加的微量元素可能會(huì)抑制某些異黃酮的合成,從而使異黃酮總量降低,具體原因還需要試驗(yàn)進(jìn)一步證明。

圖1 黑豆發(fā)芽過(guò)程中總異黃酮含量變化Fig.1 Change of total isoflavones in black bean during the germination process

2.3 黑豆發(fā)芽過(guò)程中異黃酮苷元和黃酮苷的含量

由圖2、圖3可看出,在發(fā)芽過(guò)程中異黃酮苷元及異黃酮苷含量的變化趨勢(shì)相同,均在芽長(zhǎng)為12 cm時(shí)達(dá)到最大值。發(fā)芽過(guò)程中清水發(fā)芽異黃酮苷元含量最高為0.10 mg/g,添加微量元素發(fā)芽為0.19 mg/g,與未發(fā)芽的黑豆相比增長(zhǎng)率分別為566.67%、1160.00%;異黃酮苷含量最大時(shí),清水發(fā)芽為1.11 mg/g,添加微量元素發(fā)芽為1.02 mg/g,增長(zhǎng)率分別為123.64%、106.46%,這些變化與申海進(jìn)等[24]研究結(jié)果一致。添加微量元素發(fā)芽的黑豆苷元含量增長(zhǎng)更為明顯,原因可能為微量元素為某種輔酶因子中的必要成分,能夠促進(jìn)苷元向苷的轉(zhuǎn)化[25]。

圖2 黑豆發(fā)芽過(guò)程中異黃酮苷元含量變化Fig.2 Changes of isoflavone aglycones content during black bean germination process

圖3 黑豆發(fā)芽過(guò)程中異黃酮苷含量變化Fig.3 Changes of isoflavone glycosides in black bean during germination process

2.4 黑豆發(fā)芽過(guò)程中多肽及氨基酸的含量

2.4.1 黑豆發(fā)芽過(guò)程中多肽含量 由圖4可以看出,黑豆發(fā)芽后多肽含量逐漸增加,清水發(fā)芽過(guò)程中,芽長(zhǎng)14 cm時(shí)，多肽含量最高為130.61 mg/g,隨后逐漸降低;添加微量元素發(fā)芽的黑豆則是在12 cm時(shí)達(dá)到最大為95.50 mg/g,此時(shí)多肽含量增加了33.84%,之后呈下降趨勢(shì)。分析原因可能為,在發(fā)芽初期,在酶的激發(fā)作用下,一些大分子蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為多肽,使多肽含量增加,這與其他學(xué)者報(bào)道一致[26]。黑豆清水發(fā)芽較添加微量元素發(fā)芽含量高,原因可能為微量元素更快地促進(jìn)多肽向游離氨基酸的轉(zhuǎn)化,還有可能是因?yàn)槲⒘吭匾种颇撤N多肽的合成,從而使多肽總含量降低。

圖4 黑豆發(fā)芽過(guò)程中多肽含量變化Fig.4 Changes of polypeptide content during black bean germination process

2.4.2 黑豆發(fā)芽過(guò)程中游離氨基酸的含量 由圖5可以看出,未發(fā)芽的黑豆種子中游離氨基酸含量很少,約為3.37 mg/g。隨著芽長(zhǎng)的增長(zhǎng)游離氨基酸含量均大幅度增加。發(fā)芽前期,清水發(fā)芽與添加微量元素發(fā)芽相當(dāng),發(fā)芽后期,添加微量元素發(fā)芽游離氨基酸含量高于清水發(fā)芽。芽長(zhǎng)12 cm時(shí),清水發(fā)芽中游離氨基酸含量為34.06 mg/g,添加微量元素發(fā)芽含量為63.79 mg/g,與未發(fā)芽的黑豆相比,清水、添加微量元素發(fā)芽中游離氨基酸含量分別增加了1003.34%、1835.48%?？赡茉?yàn)榘l(fā)芽過(guò)程中酶活性增強(qiáng),將蛋白質(zhì)和多肽等分解成氨基酸,使氨基酸含量增加,但隨著發(fā)芽時(shí)間的增長(zhǎng),氨基酸需要給胚根提供能量,同時(shí)酶活性變?nèi)?使氨基酸含量降低,這也與之前的文獻(xiàn)報(bào)道一致[27]。李新華等[28]稱總游離氨基酸含量增加也是大豆發(fā)芽的主要好處之一,這有利于人體必需氨基酸的攝入和快速補(bǔ)充。但黑豆添加微量元素發(fā)芽比清水發(fā)芽氨基酸含量高,原因可能為氨基酸和微量元素螯合生成螯合物,穩(wěn)定性較好,能夠提高游離氨基酸的沉積率[29]。

圖5 添加微量元素黑豆發(fā)芽過(guò)程中游離氨基酸的含量變化Fig.5 Changes of free amino acids during black bean germination with trace elements added

2.4.3 黑豆發(fā)芽過(guò)程中肽分子量分布 圖7中,牛血清白蛋白(66430 Da)、低分子肝素鈉(3700 Da)、人血管緊張素Ⅱ(1045.5 Da)、乙氨酰乙氨酰乙氨酸(189.1 Da)。黑豆中多肽分子量主要分布在2500～189 Da之間,發(fā)芽后,小分子質(zhì)量的肽類、

圖6 相對(duì)分子標(biāo)記物凝膠排阻色譜圖Fig.6 Gel exclusion chromatography of relative molecular markers注:1:牛血清白蛋白(12.509 min);2:低分子肝素鈉(19.419 min);3:血管緊張素Ⅱ(21.367 min); 4:乙氨酰乙氨酰乙氨酸(24.644 min)。

圖7 發(fā)芽前后黑豆蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量分布Fig.7 Relative molecular mass distribution of black bean protein before and after germination process注:a為黑豆添加微量元素發(fā)芽12 cm時(shí)G2000圖譜, b為黑豆清水發(fā)芽12 cm時(shí)G2000圖譜, c為黑豆G2000圖譜。

氨基酸含量明顯增加,大分子蛋白質(zhì)水解為相對(duì)分子質(zhì)量較小的小分子物質(zhì),且添加微量元素發(fā)芽比清水發(fā)芽更明顯,說(shuō)明添加微量元素的發(fā)芽更有利于大分子向小分子的轉(zhuǎn)化。這與上述所研究的黑豆發(fā)芽后游離氨基酸和多肽含量增加一致。

2.5 黑豆中鋅、錳、銅、鐵微量元素含量變化

由表6可以看出,黑豆中Zn、Mn、Cu、Fe含量很低,無(wú)法達(dá)到人體對(duì)微量元素的需求量,添加微量元素發(fā)芽后,黑豆中有機(jī)態(tài)的Zn、Mn、Cu、Fe含量高于未發(fā)芽黑豆、清水發(fā)芽黑豆,說(shuō)明黑豆添加微量元素發(fā)芽后,微量元素含量均有增加的趨勢(shì)。黑豆添加微量元素發(fā)芽后,有機(jī)鋅的轉(zhuǎn)化率為123.29%,有機(jī)錳的轉(zhuǎn)化率為2.31%,有機(jī)銅的轉(zhuǎn)化率為69.40%,有機(jī)鐵的轉(zhuǎn)化率為9.03%。黑豆添加微量元素發(fā)芽比清水發(fā)芽有機(jī)微量元素的轉(zhuǎn)化率高,原因是微量元素和黑豆中的氨基酸、小肽、有機(jī)酸和多糖衍生物等形成絡(luò)合物或螯合物,提高了有機(jī)微量元素的轉(zhuǎn)化率。

表6 黑豆中鋅、錳、銅、鐵微量元素含量變化Table 6 Changes of trace elements of Zn、Mn、Cu and Fe in black beans

2.6 黑豆發(fā)芽和添加微量元素發(fā)芽過(guò)程中植酸含量變化

由圖8可知,發(fā)芽過(guò)程中,植酸含量降低。添加微量元素發(fā)芽的黑豆,植酸由12.2 mg/g變成10.1 mg/g;清水發(fā)芽植酸含量則由原來(lái)的12.2 mg/g變成7.9 mg/g。黑豆發(fā)芽過(guò)程中植酸含量下降,原因可能為植酸酶活性增強(qiáng),分解植酸,這與郭鸰等[30]研究結(jié)果一致。添加微量元素發(fā)芽中植酸含量較清水發(fā)芽含量多,原因可能是植酸的磷酸基團(tuán)和金屬離子螯合成鹽,難以被酶降解[31],具體原因還需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖8 黑豆發(fā)芽和添加微量元素發(fā)芽過(guò)程中植酸含量變化Fig.8 Changes of phytic acid content during germination of black bean

3 結(jié)論

通過(guò)添加微量元素發(fā)芽提高黑豆的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。與清水發(fā)芽黑豆相比,添加微量元素發(fā)芽黑豆異黃酮苷元含量增加了1160.00%,多肽含量增加了33.84%,游離氨基酸含量增加了1835.48%;并且微量元素被黑豆吸收,其中有機(jī)鋅的轉(zhuǎn)化率為123.29%,有機(jī)錳的轉(zhuǎn)化率為2.31%,有機(jī)銅的轉(zhuǎn)化率為69.40%,有機(jī)鐵的轉(zhuǎn)化率為9.03%。本研究通過(guò)添加鋅、錳、銅、鐵四種微量元素,創(chuàng)新發(fā)芽方式,既提高了黑豆中異黃酮苷元的含量,又增加了微量元素的攝入量,提升了黑豆的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。但添加微量元素發(fā)芽能使黑豆中異黃酮、多肽和游離氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分含量增加的原因還有待進(jìn)一步的研究。