宋春艷,李彥林,張 蔚,李曉玉,曹 鈺,*

(1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122; 2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無錫 214122)

啤酒糟(Brewer’s spent grain,BSG)是啤酒生產(chǎn)過程中的主要副產(chǎn)物,約占所有副產(chǎn)品總量的85%,每生產(chǎn)1 t啤酒就產(chǎn)生約0.25 t的BSG(濕重≥80%)[1]。目前,BSG主要被用作飼料,未能得到充分開發(fā)利用。BSG包含大量纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等,其中蛋白質(zhì)約占24.2%,纖維素占17%,半纖維素占28%,木質(zhì)素占28%[2]。BSG也包含有0.4%的阿魏酸,阿魏酸主要通過酯鍵與低聚木糖相連,形成阿魏酰低聚糖(FOs)[3-4],是制備FOs的原料之一。

FOs兼具阿魏酸和低聚糖的生理功能,具有抗氧化[5]、抗血栓[6]、抑制糖化[7]、降低膽固醇[8]和益生元[9]等生理活性。林奇齡等[10]從玉米麩皮中分離得到的FOs在濃度為10 mmol/L時(shí)對(duì)羥自由基的清除率達(dá)72.9%;Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)來自于麥麩中的FOs能改善細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng);Ou等[12]研究了來自于小麥麩皮中的FOs對(duì)患有糖尿病大鼠的影響,發(fā)現(xiàn)FOs可顯著提高總抗氧化水平以及谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性,與此同時(shí),患有糖尿病的大鼠的黃嘌呤氧化酶活性、血糖和丙二醛水平均有降低。尤夢(mèng)竹等[13]研究了從玉米秸稈中獲得的FOs對(duì)乳酸片球菌的增殖作用,發(fā)現(xiàn)FOs的增殖作用優(yōu)于低聚木糖和葡萄糖。但目前,FOs的制備多從玉米秸稈、麥麩等中獲得,Fry等[14]首次從菠菜葉中分離得到了FOs,杜鵑等[15]酶解玉米皮渣獲得FOs,Wang等[16]從麥麩中制備獲得FOs,李向菲等[17]用酶法從米糠中獲得FOs,然而國(guó)外研究者還沒有以BSG為原料制備FOs的。

本研究以BSG為原料,酶解制備FOs,通過大孔吸附樹脂對(duì)酶解液進(jìn)行分離純化,制備得到FOs,并對(duì)FOs的體外抗氧化活性進(jìn)行研究,研究結(jié)果將有助于開發(fā)生產(chǎn)以BSG為原料的新產(chǎn)品,提高BSG的附加值,促進(jìn)BSG多元化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

BSG(濕重≥80%) 青島啤酒上海松江有限公司;VALIDASE TRL(纖維素酶酶活:4.01 U/mL;木聚糖酶酶活:979.07 U/mL)、Methaplus L100(纖維素酶酶活:16.91 U/mL;木聚糖酶酶活:1080.82 U/mL) 帝斯曼(中國(guó))有限公司;木聚糖酶(酶活:214000 U/g) 白銀賽諾生物科技有限公司;中性蛋白酶(酶活:200000 U/g) 江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司;阿魏酸(純度≥98%) Sigma公司;低聚木糖(干物質(zhì)含量≥70%) 山東龍力生物科技股份有限公司;大孔吸附樹脂D101、NaOH、HCl、碳酸鈣、甲醇等 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

TU-1810型紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Chromaste CM5110高效液相色譜儀 日本日立公司;Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm) 美國(guó)安捷倫科技有限公司;Nexus470傅立葉變換紅外光譜儀 美國(guó)尼高力儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 去蛋白啤酒糟制備 根據(jù)王萍等[18]的方法,稍作修改。將BSG(干重≥95%)刀片粉碎,過30目篩。稱取30 g粉碎過篩的BSG,加入到300 mL濃度為0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH7.0),加入2400 U/g BSG的中性蛋白酶,50 ℃水浴攪拌,持續(xù)反應(yīng)2 h,煮沸滅酶10 min,10000 r/min離心5 min,棄上清,BSG殘?jiān)?0～70 ℃的熱水重復(fù)洗滌,直至懸浮液澄清后,結(jié)束洗滌,冷卻,10000 r/min離心5 min,BSG濾渣攤開放于40 ℃烘箱,烘至干燥即得到去蛋白BSG,用作酶解制備FOs的實(shí)驗(yàn)底物。

1.2.2 阿魏酰低聚糖的制備 商品酶用MOPS緩沖液(100 mmol/L,pH6.5)溶解或稀釋成所用酶液,酶解條件為:pH6.0,溫度40 ℃,BSG濃度15 g/L,酶解時(shí)間10 h,加酶量VALIDASE TRL 150 U/g底物,Methaplus L100 120 U/g底物,木聚糖酶150 U/g底物(按商品酶中所含木聚糖酶活力添加)。酶解結(jié)束后100 ℃煮沸滅酶10 min,所得的酶解液6000 r/min離心10 min,棄殘?jiān)?上清再用中性濾紙過濾獲得上清液。上清液通過大孔吸附樹脂D101進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附,上清液以1 mL/min上樣吸附,用3倍柱體積的蒸餾水洗脫,再用50%乙醇進(jìn)行解吸附,洗脫流速為1.5 mL/min,洗脫體積為4倍柱體積,將洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),除去乙醇,剩余溶液冷凍干燥,獲得FOs固體樣品。

1.2.3 阿魏酰低聚糖的組成分析

1.2.3.1 FOs及阿魏酸含量測(cè)定 所得酶解液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后,用HPLC測(cè)定其中游離阿魏酸的含量[19];另取酶解液2 mL于試管中,添加2 mL濃度為1 mol/L的氫氧化鈉溶液(含1%(w/v)抗壞血酸),于100 ℃水解90 min,冷卻后用1 mol/L的鹽酸溶液中和至中性,HPLC測(cè)定其中總阿魏酸的含量?？偘⑽核岷颗c游離阿魏酸含量之差即為FOs含量[20]。

1.2.3.2 總糖測(cè)定 總糖含量測(cè)定參照GB/T 15672-2009,用苯酚硫酸法測(cè)定[21]。

1.2.3.3 水分和蛋白的測(cè)定 水分按照國(guó)標(biāo)GB/T 6435-2014測(cè)定[22];蛋白質(zhì)根據(jù)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。

1.2.3.4 FOs的單糖組成 FOs固體樣品用蒸餾水溶解(料液比:1∶500),取2 mL樣品溶解液,加入2 mL NaOH溶液(1 mol/L),100 ℃反應(yīng)90 min,冷卻后用HCl(1 mol/L)調(diào)至中性。取2 mL去酯后的FOs溶液,加入3 mL 72% H2SO4,于30 ℃反應(yīng)60 min,再加入84 mL蒸餾水使得H2SO4濃度降至4%,于滅菌鍋中121 ℃反應(yīng)1 h,待滅菌鍋溫度降至室溫時(shí)拿出,加入適量碳酸鈣調(diào)pH至中性[23],取上清經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后用HPLC檢測(cè)單糖組成,以葡萄糖、木糖和阿拉伯糖為標(biāo)準(zhǔn)品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

液相色譜條件為:色譜柱Bio-Rad Aminex HPX-87H Ion Exdusion column,流動(dòng)相為5 mmol/L H2SO4,示差折光檢測(cè)器,檢測(cè)器35 ℃,柱溫30 ℃,流速0.4 mL/min,進(jìn)樣量10 μL。

1.2.4 阿魏酰低聚糖的紫外光譜分析 稱取適量冷凍干燥后的FOs固體樣品,用MOPS緩沖液溶解配制成溶液,置于石英比色皿中進(jìn)行波長(zhǎng)掃描,波長(zhǎng)掃描范圍:200～400 nm。

1.2.5 阿魏酰低聚糖的紅外光譜分析 稱取2 mg左右FOs固體樣品,加入100 mg干燥KBr粉末于研缽中一起研磨,直到完全研細(xì)均勻。將研磨好的粉末放入壓膜器內(nèi),抽真空壓片。將壓好的透明薄片置于樣品架上,進(jìn)行紅外光譜檢測(cè)。

1.2.6 阿魏酰低聚糖的抗氧化性測(cè)定

1.2.6.1 清除羥自由基 制備不同濃度的FOs樣品溶液,在試管中加入0.5 mL水楊酸-乙醇溶液(9 mmol/L)、2 mL樣品溶液、0.5 mL FeCl2溶液(9 mmol/L)、6.5 mL蒸餾水,最后加入0.5 mL H2O2溶液(8.8 mmol/L)開始反應(yīng),37 ℃反應(yīng)1 h,反應(yīng)結(jié)束后在510 nm 處測(cè)量樣品的吸光值A(chǔ);取0.5 mL蒸餾水代替FeCl2溶液所測(cè)得的吸光值為A0;取2 mL蒸餾水代替樣品溶液所測(cè)得的吸光值為A1[24]。并以阿魏酸和低聚木糖作對(duì)照。樣品對(duì)羥自由基的清除率P表示為:

1.2.6.2 清除DPPH自由基 配制0.5～8 mg/mL的FOs樣品溶液,在試管中加入2 mL的樣品溶液和2 mL 0.5 mmol/L的DPPH溶液(用95%乙醇配制),混勻,室溫下避光反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后用分光光度計(jì)在517 nm處測(cè)定吸光度A0。以95%乙醇溶液代替DPPH溶液為A1;以蒸餾水代替樣品溶液為A2[25]。并以阿魏酸和低聚木糖作對(duì)照。DPPH自由基的清除率P表示為:

1.2.6.3 清除超氧陰離子自由基 配制0.5～8 mg/mL的FOs樣品溶液,取1 mL,加入9 mL的0.05 mol/L pH8.0的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液,混勻,25 ℃水浴反應(yīng)15 min,反應(yīng)結(jié)束后,取3 mL該反應(yīng)液,加入45 mmol/L的0.1 mL鄰苯三酚(用0.01 mol/L的HCl配制),混勻,靜置反應(yīng)3 min,測(cè)定其在420 nm處的吸光度A1,同時(shí)檢測(cè)未加鄰苯三酚的混合物的吸光值A(chǔ)2;以蒸餾水代替樣品溶液,得到吸光值A(chǔ)3[26]。并以阿魏酸和低聚木糖作對(duì)照。超氧陰離子自由基的清除率P表示為:

1.2.6.4 還原力 配制0.5～8 mg/mL的FOs樣品溶液,向試管中加入1 mL樣品溶液、2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L,pH6.6)和2.5 mL 1%(w/v)鐵氰化鉀,混合均勻,50 ℃避光反應(yīng)20 min;加入2.5 mL 10%(w/v)三氯乙酸溶液以終止反應(yīng),3000 r/min離心10 min。取2.5 mL反應(yīng)上清液,加入2.5 mL蒸餾水、0.5 mL 0.1%(w/v)FeCl3溶液,混合均勻,室溫下反應(yīng)10 min。測(cè)定其在波長(zhǎng)700 nm處的吸光度,用蒸餾水調(diào)零[27]。并以阿魏酸和低聚木糖作對(duì)照。

表1 阿魏酰低聚糖的組成成分(%)Table 1 Composition of FOs sample(%)

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)采用Excel軟件和Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿魏酰低聚糖的組成分析

2.1.1 阿魏酰低聚糖的組成成分 用苯酚硫酸法測(cè)得的總糖占總質(zhì)量的65.50%(w/w，下同),蛋白質(zhì)含量為8.30%,水分含量為10.87%。FOs固體樣品中游離阿魏酸的含量為1.00%,總阿魏酸含量是4.06%,因此鍵合態(tài)的阿魏酸含量13.06%，占總阿魏酸含量的75.37%。此外,FOs固體樣品中還含有11.27%的其他物質(zhì),其可能是灰分、脂肪等物質(zhì)?？偘⑽核岷扛哂谟葔?mèng)竹等[13]從玉米秸稈中制備得到的FOs,但總糖含量略低。

2.1.2 阿魏酰低聚糖的單糖組成 酯化后的FOs固體樣品酸解后,木糖和阿拉伯糖的含量分別為362.32和272.48 μg/mg,而未酸解的FOs固體樣品中未檢測(cè)出木糖和阿拉伯糖,說明了FOs固體樣品中的低聚糖部分單糖組成成分是木糖和阿拉伯糖。

2.2 阿魏酰低聚糖的紫外光譜分析

將冷凍干燥的FOs固體樣品用MOPS緩沖液溶解,然后進(jìn)行紫外光譜掃描,波長(zhǎng)掃描范圍為200～400 nm,其紫外光譜圖如圖1所示。從圖1可以看出,FOs固體樣品在325 nm處的吸收值大于在286 nm處的吸收值,阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收峰在286 nm處,由此可以證明樣品中存在酯化了的阿魏酸[28]。

圖1 FOs樣品的紫外光譜圖Fig.1 Ultraviolet spectrogram of FOs sample

2.3 阿魏酰低聚糖的紅外光譜分析

圖2為FOs的紅外光譜圖。由圖2可知,該樣品結(jié)構(gòu)中具有糖酯的特征基團(tuán),其原因是3000～2800 cm-1為糖類的飽和的C-H伸縮振動(dòng)區(qū)域[28],故2926.98 cm-1處吸收為飽和C-H伸縮振動(dòng)吸收;3650～3200 cm-1處吸收為O-H的伸縮振動(dòng)區(qū)域[28],故3384.67 cm-1的吸收峰是O-H的伸縮振動(dòng);1400～1200 cm-1的吸收峰是C-H的變角振動(dòng)[29],1392.54 cm-1是C-H的吸收峰;在1042.72 cm-1處有一個(gè)較強(qiáng)的吸收峰,說明了阿拉伯糖基的存在[30];這些區(qū)域出現(xiàn)的吸收峰都是糖類的特征吸收峰。1300～1150 cm-1是C-O-C不對(duì)稱伸縮振動(dòng)區(qū)域[29],故1252.24 cm-1是C-O-C的吸收峰;1900～1650 cm-1是C=O伸縮振動(dòng)區(qū)域[31],故1651.03 cm-1的吸收峰是C=O。這兩種吸收峰都是酯類物質(zhì)的特征吸收峰。1519.28 cm-1處的吸收峰是苯環(huán)的骨架振動(dòng)[29]。綜上,該圖譜證明了FOs樣品為糖酯類物質(zhì)。

圖2 阿魏酰低聚糖的紅外光譜圖Fig.2 IR spectrum of feruloylated oligosaccharides

2.4 阿魏酰低聚糖的體外抗氧化性

2.4.1 清除羥自由基 Fe2+和H2O2反應(yīng)能生成羥自由基,羥自由基具有很高的反應(yīng)活性,但存在時(shí)間很短,與水楊酸結(jié)合能產(chǎn)生有色物質(zhì)二羥基苯甲酸,如果加入具有清除羥自由基的抗氧化劑,可減少有色物質(zhì)的產(chǎn)生[32]。該有色物質(zhì)在510 nm處有強(qiáng)吸收,通過測(cè)定有色物質(zhì)的吸光度計(jì)算抗氧化劑對(duì)羥自由基的清除率。不同濃度的FOs樣品清除羥自由基的結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同溶液對(duì)羥自由基的清除作用Fig.3 Scavenging activity of different solutions on hydroxyl radical

在濃度為0.5～8 mg/mL范圍內(nèi),FOs、阿魏酸和低聚木糖對(duì)羥自由基的清除能力均隨樣品濃度的升高而逐漸增強(qiáng)。同等濃度條件下,FOs的羥自由基的清除能力最大,阿魏酸次之,低聚木糖最小。在濃度為8 mg/mL時(shí),FOs對(duì)羥自由基的清除率為79.40%。曾鳳彩[33]從玉米麩皮中獲得的FOs,在10 mg/mL時(shí),對(duì)羥自由基的清除率為77.20%。表明了從BSG中獲得的FOs的清除率強(qiáng)于從玉米麩皮中獲得的FOs。

2.4.2 清除DPPH自由基 DPPH自由基在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的有機(jī)氮自由基,其溶液呈深紫色,在517 nm處有吸收。當(dāng)加入抗氧化劑后,DPPH自由基會(huì)接受一個(gè)氫原子或電子,生成穩(wěn)定的化合物,使得原來的深紫色溶液顏色變淺,吸收減弱[34]。通過測(cè)定吸光度可評(píng)價(jià)抗氧化劑對(duì)DPPH自由基的清除能力。樣品對(duì)DPPH自由基的清除效果如圖4。

圖4 不同溶液對(duì)DPPH·自由基的清除作用Fig.4 Scavenging activity of different solutions on DPPH·

由圖4可知,FOs具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基能力。在濃度小于4 mg/mL時(shí),清除率隨著濃度的增大而快速增大;濃度達(dá)到4 mg/mL后,對(duì)DPPH自由基的清除率增長(zhǎng)速度減緩,阿魏酸也表現(xiàn)出了類似的變化趨勢(shì)。在同等濃度下,低聚木糖的清除率明顯低于FOs和阿魏酸。當(dāng)濃度為8 mg/mL時(shí),FOs對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到了84.40%。

2.4.3 清除超氧陰離子自由基 超氧陰離子自由基為基態(tài)氧接受一個(gè)電子形成的第一個(gè)氧自由基,是生物體中產(chǎn)生量最多的一種氧自由基,其活潑性雖不大,但壽命較長(zhǎng),擴(kuò)散性強(qiáng),可引起核酸鏈斷裂、多糖解聚、不飽和脂肪酸過氧化,進(jìn)而引起膜的損傷,使某些酶失活并改變線粒體氧化磷酸化作用。同時(shí),它可轉(zhuǎn)化成為其它種類的氧自由基,對(duì)人體存在較大的損傷[35]。鄰苯三酚在堿性條件下能發(fā)生自氧化，生成有色中間產(chǎn)物和超氧陰離子自由基,自由基濃度越高，自氧化的催化反應(yīng)速度越強(qiáng),而抗氧化物能迅速捕捉超氧陰離子自由基,從而抑制鄰苯三酚自氧化反應(yīng)。FOs、阿魏酸和低聚木糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果如圖5。

圖5 不同溶液對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用Fig.5 Scavenging activity of different solution on

由圖5可知,FOs、阿魏酸和低聚木糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力都存在濃度依賴關(guān)系,隨著濃度的增加,對(duì)超氧陰離子自由基的清除率增加。在濃度低于6 mg/mL時(shí),FOs的清除能力明顯高于阿魏酸和低聚木糖,但FOs和阿魏酸相似,隨著濃度進(jìn)一步升高,FOs的清除能力基本持平。當(dāng)濃度達(dá)到8 mg/mL時(shí),FOs對(duì)超氧陰離子自由基的清除率達(dá)到59.40%,阿魏酸的清除率為52.20%,低聚木糖的清除率為21.50%。相同濃度下,李向菲等[17]從米糠中酶解得到的FOs的清除率為57.77%,與從BSG中獲得的FOs相接近。

2.4.4 還原力 抗氧化劑與鐵氰化鉀反應(yīng),將鐵氰化鉀還原為亞鐵氰化鉀,亞鐵氰化鉀再與Fe3+反應(yīng)生成亞鐵氰化鐵,在700 nm處有最大吸光度,因此通過測(cè)定吸光度來評(píng)價(jià)抗氧化劑的還原力,吸光度越大,則表明還原力越強(qiáng)。配制不同濃度的阿魏酸、FOs和低聚木糖溶液,測(cè)定這些樣品不同濃度時(shí)的還原力,其結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同溶液的還原力Fig.6 Reduction activity of different solutions

由圖6可知,在低濃度時(shí),FOs、阿魏酸和低聚木糖的還原力接近,隨著濃度的增加,三者之間的還原力差距越來越大。FOs的增長(zhǎng)速度最快,阿魏酸次之,低聚木糖隨著濃度的增加,還原力增加的較小。當(dāng)濃度為8 mg/mL時(shí)，F(xiàn)Os的還原力為1.22。表明FOs是良好的供電子體,對(duì)Fe3+有良好的還原能力。

3 結(jié)論

以BSG為原料制備的FOs,其總阿魏酸含量為4.06%(w/w),鍵合態(tài)阿魏酸含量占總阿魏酸含量的75.37%(w/w),總糖含量為65.50%(w/w),單糖組成主要為阿拉伯糖和木糖;FOs固體樣品經(jīng)紫外光譜分析和紅外光譜分析,證明是具有酯化阿魏酸的糖酯類物質(zhì);該物質(zhì)對(duì)羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除效果,還原力也較好,均好于相同濃度下的阿魏酸和低聚木糖。