祁亮亮 韋仕巖 藍(lán)桃菊 郎 寧

（廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所，廣西南寧530007）

云耳是云南、貴州和廣西等地特色的木耳屬食用菌，隸屬于木耳目（Auriculariales），木耳科（Auriculariaceae）。木耳屬真菌分布廣泛，主要生長在闊葉樹倒木或腐木上，偶見于腐朽的竹子上[1]，是重要的食藥用菌[2-4]。我國對木耳屬的研究始于1939年，鄧叔群記載了中國木耳屬真菌6種[5]；20世紀(jì)80年代后，國內(nèi)學(xué)者相繼發(fā)現(xiàn)報(bào)道了4個(gè)木耳屬新種[6-8]；近些年，基于形態(tài)學(xué)與分子系統(tǒng)學(xué)，諸多木耳屬新種被發(fā)現(xiàn)[9-13]。截至目前，木耳屬有效名稱75個(gè)[13]，中國有15個(gè)。云耳在廣西多個(gè)市縣有廣泛栽培。

從宋代起，廣西百色地區(qū)已開始人工栽培云耳。因此，云耳是廣西特有的種質(zhì)資源[14]，一般發(fā)生在桂西、桂西北[15]。據(jù)記載，野生云耳大多發(fā)生于櫟木腐木與麻櫟林交界的混交林中，偶有在米椎（Castanopsisspp.）等其他樹種上[14]，多被描述為廣西特有的木耳品種[16-19]，學(xué)名常寫作為Auricularia auricu-lar[14，19]或者A.auricular-judae[17]，但缺乏有力證據(jù)。在宏觀形態(tài)學(xué)上與云耳相似的物種多為近些年發(fā)表的新種或新記錄種，如闊葉樹木耳A.angiospermarumY.C.Dai，F(xiàn).Wu﹠D.W.Li、黑木耳A.heimuerF.Wu，B.K.Cui﹠Y.C.Dai、小木耳A.minutissimaY.C.Dai，F(xiàn).Wu﹠Malysheva、脆木耳A.fibrilliferaKobayasi等[12]。因此，筆者旨在通過比較云耳與其他相似種的形態(tài)學(xué)及分子系統(tǒng)學(xué)，完善廣西云耳的形態(tài)學(xué)特征，明確廣西云耳準(zhǔn)確的物種名稱及分類地位，對云耳的栽培育種及地方食用菌品種的保護(hù)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

研究材料為筆者從廣西天峨縣（云耳712：GXMRI_YE1、GXMRI_YE2、GXMRI_YE3、）、南丹縣（黑木 耳 916：GXMRI_ME1、GXMRI_ME2、GXMRI_ME3）、龍州縣（GXMRI_0613、GXMRI_0627）采集的8個(gè)木耳屬標(biāo)本，標(biāo)本存放于廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所（GXMRI）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)研究方法

采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)研究方法對新鮮及干標(biāo)本進(jìn)行宏觀形態(tài)及微觀顯微結(jié)構(gòu)的觀察并記錄。5%KOH溶液作為干標(biāo)本的浮載劑，剛果紅作為染色劑，Melzer試劑檢驗(yàn)標(biāo)本是否有淀粉質(zhì)反應(yīng)；測量30個(gè)成熟孢子的大小，得出所有孢子的長寬平均值，計(jì)算擔(dān)孢子的Q值。顏色描述的依據(jù)是《Color standards and color nomenclature》[20]以及《Methuen handbook of color》[21]。

1.2.2 分子系統(tǒng)學(xué)研究方法

1.2.2.1 DNA提取、PCR擴(kuò)增、測序

取干凈無污染的木耳屬干標(biāo)本提取總DNA，提取方法依據(jù)DNA提取試劑盒SK8224（上海生工生物工程股份有限公司）使用說明。ITS序列的引物為通用引物[22]，擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，包括1 μL模板，0.5 μL 正 反向引物 ，0.5 μL dNTP（10 mM），2.5 μL Tap Buffer，0.2 μL Tap 酶 ，20 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，94℃變性60 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72℃修復(fù)延伸10 min，4℃終止反應(yīng)[23]。PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司測序。測序結(jié)果經(jīng)驗(yàn)證后，上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫。

1.2.2.2 數(shù)據(jù)處理及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

基于NCBI數(shù)據(jù)庫，將目標(biāo)序列進(jìn)行BLAST比對，下載其Ident值高于97%的序列組成矩陣。運(yùn)用Bio Edit v.7.0.9[24]、CLUSTALX[25]和 PAUP 4.0[26]對 矩陣進(jìn)行比對和編輯、Modeltest v.3.7[27]計(jì)算最適的堿基替換模型，MrBayes v.3.1.2[28]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。最終當(dāng)運(yùn)行100萬代或分裂頻率的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差（Average standard deviation of split frequencies）低于0.01時(shí)停止運(yùn)行，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 云耳形態(tài)學(xué)

宏觀形態(tài)（圖1）：子實(shí)體新鮮時(shí)膠質(zhì)，不透明，耳狀，偶不規(guī)則，具3～5 mm短小菌柄，邊緣常具淺裂或偶具深裂，最寬處直徑可達(dá)5.5 cm，厚0.50～1.46 mm，干后易碎，耳基及周圍半透明（對光），耳緣不透明；不孕面淺黃褐色、深黃褐色，或木棕色（ⅩⅩⅤⅢ11″k），幼時(shí)具明顯淺黃色柔毛，老后具黃棕色柔毛，干后淺灰棕色；耳緣不具柔毛，顏色不同，煙褐色、深紅褐色，干后灰褐色；子實(shí)層光滑，具皺褶，幼時(shí)幾乎與耳緣同色，基部色淡；老后子實(shí)層淺橙黃色（4A2），干后中部木棕色至淡黃棕色，邊緣深灰色。

顯微結(jié)構(gòu)：擔(dān)孢子臘腸形，無色，薄壁，光滑，具1或2個(gè)液泡（圖2），非淀粉質(zhì)，無嗜藍(lán)反應(yīng)，（3.0～5.5）μm×（7.0～12.0）μm，平均長度 L=10.18 μm，平均寬度W=4.20 μm，長寬比Q=2.42。擔(dān)子棒狀，3橫隔，擔(dān)孢子梗少見，（25.0～57.0）μm×（2.0～3.5）μm。子實(shí)層末端無擬囊狀體。橫切面具髓層，偶不明顯，處于切面中間位置，無結(jié)晶體。柔毛單生或簇生，淺黃色，基部稍膨大，厚壁，具窄內(nèi)腔，頂部鈍圓，偶漸尖，大小為（46.0～99.0）μm ×（3.0～5.0）μm。菌絲具鎖狀聯(lián)合，在5%KOH試劑中菌絲寬度為1.5～3.5 μm。

圖1 云耳宏觀形態(tài)

圖2 云耳微觀結(jié)構(gòu)

在外觀形態(tài)學(xué)上，云耳與闊葉樹木耳、小孢木耳以及小木耳有很多相似之處，但是仍具有細(xì)微的差別（表1）。野生條件下，脆木耳很容易被誤認(rèn)為是云耳的野生物種，但是脆木耳新鮮時(shí)耳片較薄，易碎，呈半透明狀。

2.2 云耳分子系統(tǒng)學(xué)

共得到26條ITS序列（表2），18條序列下載于GenBank，其余8條序列是自測序列。經(jīng)對26條序列進(jìn)行編輯整理后，矩陣中每條ITS序列堿基數(shù)為508個(gè)（包含空位）。最適堿基替代模型為TIMef，經(jīng)過100萬代的運(yùn)行最終的分裂頻率約為0.009，停止運(yùn)行。貝葉斯方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。

表1 云耳與相似種的形態(tài)學(xué)比較

表2 供試標(biāo)本信息以及其GenBank登錄號與采集地

圖3 基于ITS運(yùn)用貝葉斯方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

運(yùn)用貝葉斯方法，對26條ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，其中15條序列是公認(rèn)的黑木耳Auricularia heimuer，2條序列為脆木耳A.fibrillifera，1條序列為外群截形黑耳Exidia truncataFr.。由系統(tǒng)發(fā)育樹可以明顯看出，基于ITS構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹將木耳屬序列分為兩個(gè)大的分支CladeⅠ和CladeⅡ。其中，0613、0627分布在CladeⅠ中，為脆木耳A.fibrillifera，屬廣西新記錄種。YE1、YE2、YE3、ME1、ME2、ME3聚在CladeⅡ分支上，均為黑木耳。但是采自廣西天峨縣的云耳和南丹縣的黑木耳并沒有具在同一個(gè)小的分支上，云耳與中國及俄羅斯的黑木耳關(guān)系較近（GroupⅠ），分支支持率為0.70，且分支長相似，系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系較近；而采自南丹的黑木耳標(biāo)本單獨(dú)形成一個(gè)小的分支（GroupⅡ）。因此可以確定采自天峨縣和南丹縣的6個(gè)標(biāo)本均屬于黑木耳A.heimuer，而并非是A.auricular或者A.auricularjudae。

3 小結(jié)與討論

廣西“百色云耳”具有悠久的栽培歷史，距今已經(jīng)1000余年。利用經(jīng)典形態(tài)學(xué)研究方法，發(fā)現(xiàn)云耳在形態(tài)學(xué)上具有較為獨(dú)特的特征，宏觀上，其耳緣顏色、柔毛等與黑木耳不同；微觀上，云耳的孢子、擔(dān)子和柔毛均略小于黑木耳。野外采集調(diào)查時(shí)，脆木耳很容易被誤認(rèn)為是云耳，因?yàn)槠渥訉?shí)體顏色十分接近，但新鮮脆木耳質(zhì)地較薄，采摘容易開裂；脆木耳在光線稍暗的情況下，子實(shí)體近白色。在分子系統(tǒng)學(xué)方面得到的結(jié)果與吳芳研究結(jié)果相似[12]。云耳與來自俄羅斯及中國的部分菌株均聚在一個(gè)大的組內(nèi)（GropeⅠ），但與俄羅斯的黑木耳在形態(tài)學(xué)上具有明顯的區(qū)別，后者新鮮時(shí)具有棕黃色至紅褐色的絨毛，干后黃綠色；擔(dān)子和孢子也較云耳略大[29]。另外，黑木耳常規(guī)栽培種黑山A（KM396782）以及在廣西的栽培種916（ME1-3）、云耳712（YE1-3）被分在不同的3個(gè)分枝上，由此可以推斷，基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹能較好地對現(xiàn)有部分黑木耳品種進(jìn)行區(qū)分[23]。另外，值得一提的是，AB615232是源于日本的黑木耳標(biāo)本，在系統(tǒng)樹中也能夠明顯的區(qū)分開來，可以推測出黑木耳種內(nèi)具有復(fù)雜的遺傳多樣性。

綜上所述，雖然在形態(tài)學(xué)上云耳與黑木耳存在部分差異，形成了廣西地方特有的木耳栽培品種，但是綜合形態(tài)學(xué)及分子系統(tǒng)學(xué)的觀點(diǎn)支持將廣西的云耳學(xué)名定為黑木耳Auricularia heimuerF.Wu，B.K.Cui﹠Y.C.Dai。另外，由于最初記載的云耳歷史久遠(yuǎn)且未有形態(tài)學(xué)原始描述，并未獲得野生子實(shí)體，故在子實(shí)體形態(tài)方面有待于今后進(jìn)一步補(bǔ)充研究。