王素云，盧 穎，蔡丹鳳，童 靜，成 鵬，余夕潮，李 育，卞慧敏

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 1. 藥學(xué)院、2. 江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、3. 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

近年來研究表明，心肌細(xì)胞在缺血缺氧狀態(tài)下，線粒體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量氧自由基，氧自由基生成及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)是心肌損傷的主要機(jī)制之一[1]，積累的活性氧(reactive oxygen species,ROS)可損傷線粒體。因此，適時(shí)地清除老化和發(fā)生損傷的線粒體對(duì)于細(xì)胞的正常生長(zhǎng)具有非常重要的作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)，自噬可以用來清除受損的細(xì)胞器，在自由基的刺激下，可被特異性的自噬過程降解，從而減少細(xì)胞氧化損傷[3-4]，因此，細(xì)胞通過基礎(chǔ)水平的自噬以維持胞質(zhì)內(nèi)線粒體的更新。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，梓醇(catalpol)是地黃中發(fā)揮藥理作用的主要活性成分之一，梓醇具有神經(jīng)保護(hù)、抗炎的作用，能提高腦缺血/再灌注動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)記憶能力，抑制細(xì)胞凋亡，減少神經(jīng)元死亡等[5-6]，但是梓醇對(duì)于心血管系統(tǒng)保護(hù)作用研究尚處于起步階段。前期研究中，利用分子對(duì)接技術(shù)，對(duì)地黃中單體進(jìn)行雌激素受體(estrogen receptor, ER)調(diào)節(jié)劑篩選時(shí)，發(fā)現(xiàn)梓醇與ERα、ERβ結(jié)合率較高，但是對(duì)于梓醇能否通過ER介導(dǎo)細(xì)胞自噬，抑制心肌損傷尚不明確。故本研究利用糖剝奪心肌細(xì)胞氧化損傷模型，探討梓醇對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 大鼠心肌細(xì)胞株H9c2，購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司。

1.1.2試劑 梓醇(貨號(hào)：L26D6Y8111)，購(gòu)自上海源葉生物科技公司；胎牛血清(貨號(hào)：1619679)、DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)：C11995500BT)、無糖培養(yǎng)基(貨號(hào)：1710161)，均購(gòu)自Gibco公司；LC3抗體(貨號(hào)：66139-1-1g)，購(gòu)自CST公司；Beclin-1抗體(貨號(hào)：1306-1-AP，Proteintech公司)；p62(貨號(hào)：ab91526)、Parkin(貨號(hào)：ab15954)、PINK1(貨號(hào)：ab23707)抗體、ERα抗體(貨號(hào)：ab32063)，ERβ抗體(貨號(hào)：ab92306)，均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；雌激素受體α抑制劑(MPP)(貨號(hào)：072M4702V)、雌激素受體β抑制劑(PHTPP)(貨號(hào)：065M4603V)，均購(gòu)自sigma公司；活性氧(ROS)試劑盒(貨號(hào)：S0033)，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(貨號(hào)：A001-1)、丙二醛(MDA)試劑盒(貨號(hào)：A003-1)，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；siNTC(貨號(hào)：Y007)、siERα(貨號(hào)：Y3512)，購(gòu)自上海和元生物技術(shù)有限公司。

1.1.3儀器 Synergy2酶標(biāo)儀(Bio-Tek公司)；熒光倒置顯微鏡(ZEISS公司)；5417R低溫超速離心機(jī)(Eppendorf公司)；蛋白電泳、轉(zhuǎn)移設(shè)備(Bio-Rad公司)；自動(dòng)曝光儀(Bio-Rad公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組H9c2心肌細(xì)胞于用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2、100%飽和濕度培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80% ～ 90%時(shí)，用胰蛋白酶消化，并用培養(yǎng)基配成細(xì)胞懸液，6孔板每孔鋪 1×106 cells/mL，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%時(shí)，吸去細(xì)胞上清，加入含藥培養(yǎng)基。雌激素抑制劑實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞分為 5 組：對(duì)照組、模型組、梓醇(28 μmol·L-1)+MPP(10 μmol·L-1)組、梓醇(28 μmol·L-1)+THTPP(10 μmol·L-1)組。慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞分為 7組：對(duì)照組、模型組、梓醇(28 μmol·L-1)、siNTC組、siNTC+梓醇組(28 μmol·L-1)、siERα組、siERα組+梓醇組(28 μmol·L-1)。以上均為藥物終濃度。于5% CO2、37℃下培養(yǎng)24 h后，糖剝奪6 h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行無糖饑餓處理，空白對(duì)照用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測(cè)H9c2細(xì)胞存活率待細(xì)胞長(zhǎng)至70%時(shí)，吸去細(xì)胞上清，加入含藥培養(yǎng)基。細(xì)胞分為對(duì)照組、不同濃度梓醇組(終濃度0.28、2.8、28、280、2 800 μmol·L-1)。于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h。24 h后，吸去細(xì)胞上清，PBS緩沖液洗滌3次，每孔加入完全培養(yǎng)基180 μL及MTT 20 μL，避光，37 ℃ 孵育4 h，每孔加150 μL DMSO溶解孔內(nèi)結(jié)晶物，避光，搖床上振蕩15 min，于酶標(biāo)儀490 nm下測(cè)吸光度(OD)值。

1.4 H9c2細(xì)胞ROS、MDA、SOD活力的檢測(cè)取出經(jīng)糖剝奪6 h及藥物作用24 h后的心肌細(xì)胞，按照ROS、MDA、SOD試劑盒說明書檢測(cè)。

1.5 電鏡觀察收集細(xì)胞，離心，經(jīng)2.5%戊二醛固定后送檢，透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞中自噬小體的結(jié)構(gòu)。

1.6 Western blot檢測(cè)自噬蛋白表達(dá)待細(xì)胞長(zhǎng)至70%時(shí)，吸去細(xì)胞上清，PBS洗3次，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、模型組、梓醇(0.28、2.8、28 μmol·L-1)組。于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h后，糖剝奪6 h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行無糖饑餓處理，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，離心后，上清用BCA法測(cè)定蛋白濃度，蛋白定量60 μg，煮沸5 min，上樣于10% SDS-PAGE膠，電泳1.5 h，全濕式電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下用含5%脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗(1 ∶1 000)、二抗(1 ∶1 000)，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)目的條帶，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察分析并拍照。用目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值之比計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.7 慢病毒轉(zhuǎn)染胰酶消化H9c2細(xì)胞配成細(xì)胞懸液，6孔板每孔鋪2×105cells/mL，24 h后匯合度30%左右(分組同“1.2”)，感染病毒siNTC和siERα，加polybrene，感染20 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入2 mL新鮮的培養(yǎng)基。感染72 h后，吸去細(xì)胞上清，加入含藥培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h后，糖剝奪6 h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行無糖饑餓處理，空白對(duì)照依然用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 梓醇對(duì)糖剝奪誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞氧化損傷的影響細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(Fig 1A)，當(dāng)梓醇終濃度超過280 μmol·L-1時(shí)，出現(xiàn)明顯抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。0.28、2.8、28 μmol·L-1的梓醇對(duì)糖剝奪誘導(dǎo)H9c2損傷均有保護(hù)作用(Fig 1B)，且呈劑量依賴性。糖剝奪后ROS的水平明顯升高(Fig 1C)，MDA含量明顯升高，SOD活性明顯降低(Fig 1D、1E)；給予梓醇處理后，能明顯降低心肌ROS的水平和MDA含量，升高SOD活性，且呈劑量依賴性。電鏡觀察顯示(Fig 1F)，與空白對(duì)照組比，糖剝奪組作用后能觀察到腫脹破損的線粒體；與糖剝奪組比，給予梓醇干預(yù)后出現(xiàn)明顯的自噬小體，典型的自噬小體中還可看到包含破損的線粒體。

Fig 1 Effect of catalpol on oxidative damage of H9c2 cells induced by glucose n=6)

A: Survival rate of H9c2 cardiomyocytes; B: Protective effect of catalpol on H9c2; C: Release of ROS; D and E: Release of MDA and SOD; F: Electron microscopic observation results. Arrows indicate autophagosome.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group.

2.2 梓醇對(duì)糖剝奪誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中ER的影響Fig 2結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，糖剝奪組ERα、ERβ表達(dá)明顯降低；不同濃度梓醇處理后，H9c2細(xì)胞中ERα、ERβ蛋白表達(dá)均升高，表明梓醇能提高受損心肌細(xì)胞的ER蛋白的表達(dá)量。

2.3 梓醇對(duì)糖剝奪誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用是通過ERα介導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(Fig 3A、3B)，梓醇能夠明顯增加SOD活性，降低MDA含量，加入MPP(ERα抑制劑)能明顯逆轉(zhuǎn)梓醇的作用(P<0.01)，而PHTPP(ERβ抑制劑)卻不能阻斷梓醇的作用。同時(shí)，MPP也能明顯逆轉(zhuǎn)梓醇對(duì)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3(Fig 3C、3D)，以及線粒體自噬相關(guān)蛋白Parkin、p62、PINK1(Fig 3E、3F)的調(diào)節(jié)作用(P<0.01)，同樣PHTPP卻沒有這種逆轉(zhuǎn)作用。說明ER介導(dǎo)的梓醇抗氧化、上調(diào)自噬的作用與ERα密切相關(guān)。

Fig 2 Effects of catalpol on estrogen receptors in H9c2 cells induced by glucose deprivation n=3)

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

2.4 siRNA ERα后梓醇對(duì)糖剝奪H9c2細(xì)胞自噬的影響為了進(jìn)一步驗(yàn)證ERα與自噬及線粒體自噬的關(guān)系，用慢病毒轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞干擾ERα表達(dá)。免疫熒光及Western blot鑒定ERα轉(zhuǎn)染結(jié)果表明(Fig 4A、4B)，當(dāng)MOI值達(dá)到60時(shí)，免疫熒光轉(zhuǎn)染率達(dá)到近80%，ERα表達(dá)明顯減少。慢病毒干擾ERα后，觀察梓醇對(duì)氧化損傷的影響，結(jié)果表明(Fig 4C、4D)，與SiNTC+catalpol相比，siERα干擾后給予梓醇能部分降低MDA含量，增加SOD的含量，抗氧化作用被部分逆轉(zhuǎn)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(Fig 4E、4F)，與SiNTC+catalpol相比，siERα干擾后能部分逆轉(zhuǎn)梓醇上調(diào)Beclin-1、LC3、Parkin表達(dá)，下調(diào)p62、PINK1表達(dá)的作用，說明ERα介導(dǎo)了梓醇調(diào)節(jié)自噬及線粒體自噬對(duì)抗糖剝奪誘導(dǎo)的心肌損傷。

3 討論

心肌缺血將造成心肌缺血供氧不足，不僅易引發(fā)心絞痛、冠心病、心衰等，甚至可能導(dǎo)致死亡。心肌細(xì)胞屬于終末細(xì)胞系，缺乏再生能力，減少心肌損傷以及修復(fù)損傷后的心肌細(xì)胞尤為重要。線粒體是機(jī)體內(nèi)源性自由基產(chǎn)生的主要部位，而損傷和功能失調(diào)的線粒體可產(chǎn)生大量的ROS，超出正常水平的ROS誘導(dǎo)氧化應(yīng)激會(huì)損害細(xì)胞，導(dǎo)致線粒體損傷及膜電位的降低[7]，進(jìn)一步加重心肌缺血。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給予梓醇處理后可降低心肌細(xì)胞氧化損傷，有效清除自由基，并且能明顯降低MDA含量，升高SOD活性，起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。

在心肌細(xì)胞中，抗霉素A(antimycin A,AMA)通過增加線粒體超氧化物產(chǎn)生，減少線粒體膜勢(shì)能及減少細(xì)胞內(nèi)呼吸作用，促進(jìn)心肌細(xì)胞損傷，而雷帕霉素通過mTOR途徑誘導(dǎo)自噬，提高線粒體功能，促進(jìn)受損線粒體清除，保護(hù)心肌細(xì)胞免受AMA的毒害作用[8]。此外，在酵母中,當(dāng)基因突變使線粒體無法維持跨膜電勢(shì)時(shí)，線粒體自噬水平明顯上調(diào)，損傷線粒體被特異性地清除[9]。多種心血管疾病(如心肌病、心臟缺血/再灌注損傷、心功能不全等)的存在心肌細(xì)胞自噬現(xiàn)象[10]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，梓醇能有效促進(jìn)自噬小體的形成，明顯增加自噬相關(guān)蛋白Beclin-1及LC3的蛋白表達(dá)，并能增加線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)，降低MDA水平，說明梓醇能通過增強(qiáng)糖剝奪誘導(dǎo)的心肌損傷中自噬水平，減輕氧化損傷，保護(hù)心肌細(xì)胞。

研究發(fā)現(xiàn)，植物雌激素能夠促進(jìn)自噬的發(fā)生[11-12]。在心肌肥厚模型中給予葛根素治療，可明顯上調(diào)自噬標(biāo)志性蛋白LC3表達(dá)，并在體外培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞中呈現(xiàn)濃度依賴的特點(diǎn)[13]。Duan等[14]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以通過激活SIRT3/AMPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)線粒體自噬，修復(fù)巨噬細(xì)胞氧化損傷；也可以上調(diào)缺血皮質(zhì)區(qū)腦組織LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)，發(fā)揮對(duì)缺血/再灌注大鼠神經(jīng)元的保護(hù)作用。因此推測(cè)，植物雌激素對(duì)自噬的調(diào)控是通過ER介導(dǎo)的。本實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)ERα被抑制后，自噬及線粒體自噬也被抑制。梓醇能有效調(diào)節(jié)ERα的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)自噬與線粒體自噬，發(fā)揮對(duì)糖剝奪誘導(dǎo)心肌損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，梓醇上調(diào)自噬發(fā)揮對(duì)心肌損傷保護(hù)的作用是由ERα調(diào)控的。本研究有助于揭示植物雌激素樣成分可通過ERα促進(jìn)自噬及線粒體自噬，為揭示植物雌激素樣成分抗心肌損傷的科學(xué)內(nèi)涵提供依據(jù)。

Fig 3 Effect of catalpol on oxidative damage autophagy induced by glucose deprivation in H9C2 cells after ERα and ERβ blockade

A and B: Release of MDA and SOD (n=6); C and D: Western blot results and the quantitative data of Beclin-1 and LC3(n=3); E and F: Western blot results and the quantitative data of p62, Parkin and PINK1 (n=3).*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vscatalpol group.

Fig 4 Effect of catalpol on glucoside deprivation H9c2 autophagy after siRNA ERα

A: Identification of siERα fluorescence in H9c2 cells; B: Western blot verified the successful ERα transfection (n=3); C and D: Release of MDA and SOD (n=6); E and F: Western blot results and quantitative data (n=3). 1:Control;2:Model; 3: catalpol;4:siNTC;5: siNTC+catalpol;6: siERα;7: siERα+ catalpol.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△P<0.05vssiNTC+ catalpol group.

(致謝：本課題在江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，特別感謝實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)老師及各位參與者！)