李 玲，張 波，盧芳國，蔡 亮，高 強，胡 玨，何谷良，吳 濤

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)1. 中醫(yī)學(xué)院、2. 醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208；3. 湖南省疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗科，湖南 長沙 410000；4. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，湖南 長沙 410208)

流感性感冒(簡稱流感)是目前尚未得到有效控制的全球性急性呼吸道傳染病，而A型流感病毒是人和動物流感的主要病原體[1-2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流感病毒入侵時會誘導(dǎo)宿主細胞產(chǎn)生自噬，進而加劇流感病毒的致病作用，因此，具有調(diào)節(jié)細胞自噬功能的藥物可能是流感治療的有效靶點[3-4]。中醫(yī)藥防治流感歷史悠久，優(yōu)勢明顯。源自東漢醫(yī)圣張仲景《傷寒論》的麻杏石甘湯是治療外感發(fā)熱肺熱證的常用方，更是近年廣泛用于治療證屬熱毒襲肺證和熱毒壅肺證流感的基本方[5]。

本課題組前期研究結(jié)果表明，麻杏石甘湯(Maxing Shigan decoction，MXSGD)能通過調(diào)節(jié)細胞因子的分泌等方式，發(fā)揮抗流感病毒作用，是較為理想的研究對象[6-8]。本研究將結(jié)合前沿的基礎(chǔ)研究成果和已開展的前期研究工作，從形態(tài)-功能-分子三方面，探討麻杏石甘湯是否通過調(diào)控流感病毒誘導(dǎo)的肺巨噬細胞自噬，最終實現(xiàn)干預(yù)流感病毒的致病作用及其效應(yīng)機制，部分揭示麻杏石甘湯抗流感病毒的新作用靶點，豐富中醫(yī)藥防治流感病毒感染的科學(xué)內(nèi)涵。

1 材料

1.1 藥物與試劑麻杏石甘湯(麻黃9 g、杏仁9 g、石膏18 g、炙甘草6 g)購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診藥房；磷酸奧司他韋膠囊(瑞士羅氏，批號B3017，每粒75 mg)；胎牛血清(Gibco)；自噬抑制劑3-MA(Selleck，S2767)；雷帕霉素(rapamycin，RAPA)(Sigma，553210)；麻黃堿對照品(批號：C15894)、偽麻黃堿對照品(批號：JA187615)、苦杏仁苷對照品(批號：B20687)、甘草酸銨鹽對照品(批號：B20418)，均購自上海源葉生物；甲醇、乙腈(色譜純，美國TEDIA)； LC3抗體(CST，4108)；β-actin抗體(Abcam，ab8227)；FTIC標(biāo)記的羊抗兔二抗(Proteintech，SA00003-2)；RIPA蛋白裂解液(CWBIO，CW2334S)；ECL發(fā)光檢測試劑盒(Thermo Fisher，35055)。

1.2 儀器3111 CO2細胞培養(yǎng)箱、1300生物安全柜(美國Thermo Scientific)；AE31倒置顯微鏡(廈門Motic)；CytExpert流式細胞儀(美國Beckman Coulter)；Tecnai G2 spirit透射電子顯微鏡(美國FEI)；A1R+激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon)；1525高效液相色譜儀(美國Waters)；Synergy2多功能酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek)。

1.3 細胞株小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW264.7，購于中國科學(xué)院細胞庫，由本室傳代培養(yǎng)后使用。

1.4 流感病毒株A型流感病毒(influenza A virus，IAV)，A/PR/8/34株，由湖南師范大學(xué)病毒研究室惠贈。經(jīng)10日齡雞胚尿囊腔接種培養(yǎng)傳代，血凝效價實驗測定效價在1 ∶640以上者供實驗用(本實驗感染復(fù)數(shù)，MOI=0.1)。置于冰袋中備用。

1.5 實驗動物成年健康新西蘭大白兔12只，♂，體質(zhì)量(1.8±0.2)kg，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK(湘)2015-0004。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

2 方法

2.1 制備含藥血清按動物體表面積劑量換算法，根據(jù)《方劑學(xué)》和《中藥藥理學(xué)》煎煮制備4倍臨床等效劑量的麻杏石甘湯水煎液[9]。同時用雙蒸餾水配制4倍臨床等效劑量的陽性藥物奧司他韋水溶液。分別灌胃新西蘭大白兔各6只，1次/日，連續(xù)7 d，末次給藥2 h后，兔心臟采血，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清，得到空白血清、麻杏石甘湯含藥血清和奧司他韋含藥血清，同組兔血清混合并56 ℃ 滅活，過濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ肏PLC檢測麻杏石甘湯和奧司他韋含藥血清主要成分含量穩(wěn)定，可用于后續(xù)實驗。

2.2 激光共聚焦顯微鏡檢測各組細胞的自噬情況常規(guī)培養(yǎng)RAW264.7細胞，以3×103個/孔接種于12孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)16 h,待細胞貼壁后，棄原培養(yǎng)液，加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細胞同步化到G0期后備用。實驗分組方式見Tab 1。加入上述相應(yīng)的干預(yù)因素，干預(yù)12 h后，處理細胞。進行如下操作：4%多聚甲醛固定30 min，冷0.01 mol·L-1PBS洗5 min×2次，5% BSA封閉30 min后，每孔加入一抗兔源LC3Ⅱ(1 ∶200)50 μL，4 ℃孵育過夜；室溫孵育1 h，棄液，洗5 min×3次；加入FITC標(biāo)記抗兔IgG(1 ∶200)，37 ℃避光孵育30 min，棄液，洗5 min×5次；抗熒光淬滅劑的封片劑封片。共聚焦顯微鏡下檢測。

2.3 透射電鏡技術(shù)檢測各組細胞的自噬情況和病毒顆粒分布情況常規(guī)培養(yǎng)RAW264.7細胞，以5×103個/孔接種于6孔板，實驗分組方式同前。加入上述相應(yīng)的干預(yù)因素，干預(yù)12 h后棄液，洗2次。消化重懸細胞并收集于EP管中。進行如下操作：1 000 r·min-1離心5 min，去上清，可見細胞沉淀，再慢慢滴入0.25%戊二醛，室溫放置1 h后，4 ℃保存；1%鋨酸后固定2 h，依次以50%、70%、90%、100%的丙酮脫水，包埋、染色；透射電子顯微鏡觀察單位面積細胞內(nèi)自噬體數(shù)目和形態(tài)。

Tab 1 Grouping and intervention

2.4 Western blot法檢測各組細胞自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表達細胞培養(yǎng)及干預(yù)方式同前，進行如下操作：吸去上清，PBS洗滌，刮下細胞，1 000 r·min-1離心5 min后，棄上清，加入100 μL RIPA裂解液(含1 mmol·L-1PMSF)，冰上充分混勻后靜置20 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清測定總蛋白濃度。取50 μg總蛋白上樣， SDS-PAGE電泳，濕法轉(zhuǎn)膜后封閉1 h，加入LC3和β-actin抗體(1 ∶1 000)，孵育過夜，二抗(1 ∶3 000)室溫孵育1 h，暗室加ECL化學(xué)發(fā)光劑，于化學(xué)發(fā)光儀成像，用圖像分析軟件Image Lab5.0對圖像進行信號分析，并計算靶蛋白/內(nèi)參蛋白的比值。

3 結(jié)果

3.1 麻杏石甘湯含藥血清對流感病毒誘導(dǎo)的細胞自噬的影響如Fig 1所示，激光共聚焦顯微鏡下可見細胞內(nèi)有綠色熒光(LC3)分布，用IPP6.0軟件對細胞內(nèi)綠色熒光聚集體的數(shù)量和強度進行IOD分析，結(jié)果顯示流感病毒能有效誘導(dǎo)巨噬細胞的自噬，與已被證明可以誘導(dǎo)自噬的陽性藥物RAPA組接近，與空白組和自噬抑制劑3-MA組比較，差異有顯著性(P<0.01)，且3-MA能有效抑制流感病毒誘導(dǎo)的細胞自噬。而各含藥血清亦能不同程度抑制流感病毒誘導(dǎo)的細胞自噬，其中麻杏石甘湯含藥血清濃度與LC3表達量(IOD值)呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.784，P=0.012。

3.2 麻杏石甘湯含藥血清對流感病毒誘導(dǎo)的細胞自噬和病毒顆粒分布的影響如Fig 2所示，透射電鏡下可觀察自噬體的形成：吞噬泡(phagophore)-自噬小體(autophagosome)-自噬溶酶體(autolysosome)。結(jié)果顯示，流感病毒能有效誘導(dǎo)巨噬細胞的自噬，不同階段的自噬體明顯增多，與已被證明可以誘導(dǎo)自噬的陽性藥物RAPA組接近，與空白組和自噬抑制劑3-MA組比較，差異有顯著性(P<0.01)，且3-MA能有效抑制流感病毒誘導(dǎo)的細胞自噬。而各含藥血清亦能不同程度抑制流感病毒誘導(dǎo)的細胞自噬，其中麻杏石甘湯含藥血清濃度與自噬泡數(shù)量呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.884，P=0.002。

3.3 麻杏石甘湯含藥血清對流感病毒誘導(dǎo)的細胞自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表達的影響如Fig 3所示，流感病毒能有效誘導(dǎo)巨噬細胞的自噬，自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ含量明顯升高，且LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加，與RAPA組接近，與空白組和自噬抑制劑3-MA組比較，差異有顯著性，且3-MA能有效抑制流感病毒誘導(dǎo)的細胞自噬。而各含藥血清亦能不同程度抑制流感病毒誘導(dǎo)的細胞自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加，其中麻杏石甘湯含藥血清濃度與LC3表達量(相對蛋白表達量)呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.962，P=0.000。

Fig1LC3expressionincellsofeachgroup(× 600) A:Control; B: RAPA; C: 3-MA; D: IAV; E: Positive control; F: Oseltamivir; G: L-MXSGD; H: M-MXSGD; I: H-MXSGD.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsIAV.

Fig2Ultrastructuralobservationofcellsineachgroup(×2 000)

A: Control; B: RAPA; C: 3-MA; D: IAV; E: Positive control; F: Oseltamivir; G: L-MXSGD; H: M-MXSGD; I: H-MXSGD.

Fig 3 Protein expression of LC3-Ⅰ and LC3Ⅱ

A: Control; B: RAPA; C: 3-MA; D: IAV; E: Positive control; F: Oseltamivir; G: L-MXSGD; H: M-MXSGD; I: H-MXSGD.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsIAV.

4 討論

自噬是潛在的流感病毒與宿主之間相互作用的一個重要機制，因此，近些年研究者開始關(guān)注流感病毒感染和自噬機制之間的復(fù)雜關(guān)系。越來越多的證據(jù)表明，流感病毒可以引起自噬，是流感病毒的復(fù)制的一個必要過程[10-14]。因此，細胞自噬在流感病毒感染誘導(dǎo)炎癥損傷中的作用機制是研究藥物防治流感病毒感染引起炎癥反應(yīng)的重要靶點之一。

麻杏石甘湯方中君藥辛溫宣肺之麻黃與辛甘大寒清肺熱之生石膏，兩藥合用相反相成，相制為用；臣藥苦降利肺氣之杏仁味，助君藥清肺熱定平喘；佐藥炙甘草益氣和中，調(diào)和諸藥。四藥合用，共成辛涼疏表，清肺平喘之功效。同時，在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，根據(jù)其配伍原則，該方前期研究顯示，其能通過多途徑、多靶點防治流感病毒感染引起的肺部炎癥[6-8]。

本研究結(jié)果顯示，不同濃度的麻杏石甘湯含藥血清能有效抑制流感病毒誘導(dǎo)的細胞自噬，表現(xiàn)在下調(diào)LC3Ⅱ的表達，糾正LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的平衡，減少自噬體的形成，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。為本課題組研究麻杏石甘湯防治流感病毒感染，找到了新的作用靶點，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展和研究的不斷深入，本課題組的后續(xù)研究將以此為基礎(chǔ)進行進一步的機制探討，以期找到麻杏石甘湯抑制流感病毒誘導(dǎo)的細胞自噬的作用機制，以及關(guān)鍵的效應(yīng)物質(zhì)。

綜上所述，麻杏石甘湯可能通過抑制流感病毒誘導(dǎo)的細胞自噬，最終調(diào)控流感病毒的致病作用，但其進一步的作用機制還需深入研究。