宋恭帥 張蒙娜 馬永鈞 周小敏 崔益瑋 戴志遠(yuǎn),3 沈 清,3,*

(1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院，浙江 杭州 310012； 2 浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司，浙江 舟山 316101； 3浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310012)

由于海況的變化和海上捕撈強(qiáng)度的不斷增加，沿岸和近海漁業(yè)資源的結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大變化。傳統(tǒng)海產(chǎn)資源不斷衰退，而金槍魚等遠(yuǎn)洋漁獲物品種的產(chǎn)量穩(wěn)定上升。近幾年世界金槍魚年產(chǎn)量穩(wěn)定在400萬t左右，產(chǎn)值達(dá)300多億美元[1]，金槍魚已成為我國(guó)海產(chǎn)品中加工出口的主要品種[2]。但由于缺乏先進(jìn)的高值化加工技術(shù)，在金槍魚等海洋生物資源加工處理過程中，可利用部分僅占50%～70%，金槍魚眼窩、內(nèi)臟等加工廢棄物得不到較好的利用，大部分被當(dāng)作飼料或直接丟棄[3]。這些廢棄物中含有大量的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物活性物質(zhì)，在食品、化工、保健品和化妝品等領(lǐng)域均有較大需求[4]。海洋生物加工廢棄物的綜合利用是現(xiàn)代食品加工的突出任務(wù)之一。近年來對(duì)海洋生物資源加工廢棄物綜合利用的研究越來越多，并取得了很多進(jìn)展，但整體應(yīng)用水平尚未得到顯著提高[5-6]。

隨著人們對(duì)魚油的營(yíng)養(yǎng)及保健功能的認(rèn)可，魚油提取開發(fā)成為水產(chǎn)品資源綜合利用的熱點(diǎn)之一。魚類內(nèi)臟廢棄物中富含人體所必需的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFA)，尤其是金槍魚，其內(nèi)臟中含有豐富的二十碳五烯酸(eicosapentenoic acid，EPA)、二十二碳六烯酸(docasahexenoic acid，DHA)、亞油酸及花生四烯酸等[7-8]。研究表明，EPA和DHA為水產(chǎn)生物所特有的脂肪酸組分，具有降低炎癥反應(yīng)、降低血脂、預(yù)防心臟血管疾病等生理保健功能，但二者生物和醫(yī)學(xué)功能有較大差別，DHA主要對(duì)腦神經(jīng)生產(chǎn)發(fā)育至關(guān)重要，而EPA具有降低人體中膽固醇和甘油三酯的含量、促進(jìn)體內(nèi)飽和脂肪酸代謝的作用，且高純度乙基EPA能有效治療精神性和神經(jīng)性疾病[9]。PUFA的富集純化主要是通過尿素包合、分子蒸餾、銀離子絡(luò)合及高效液相色譜等方法實(shí)現(xiàn)的。林文等[10]采用尿素包合法聯(lián)合分子蒸餾技術(shù)提純乙酯型魚油中的EPA和DHA，其純度高達(dá)78.90%，回收率為49.00%。張良等[11]以蛇鯔魚油為原料，利用硝酸銀硅膠柱色譜分離純化EPA和DHA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EPA和DHA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別從4.43%、13.94%提高至21.47%、70.13%，總質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)90.00%以上。目前，從魚類加工廢棄物中提取魚油的方法研究較多，王芳[12]采用復(fù)合蛋白酶水解法提取粗魚油，其提取率可達(dá)85.67%，且Ω-3系列PUFA含量較高；Sahena等[13]通過超臨界流體萃取法從魚內(nèi)臟中提取魚油，其PUFA含量在56.00%以上，且EPA和DHA含量分別為9.00%和10.00%。此外，微波提取油脂技術(shù)作為新型的提取方法也被廣泛應(yīng)用于各種油脂的提取[14]，而傳統(tǒng)的提取方法如蒸煮法，其提取率一般較低，品質(zhì)相對(duì)較差[15]。

本試驗(yàn)以金槍魚加工廢棄物為原料，通過響應(yīng)面法優(yōu)化酶輔助提取粗魚油的工藝條件，通過粗魚油精制、化學(xué)催化乙酯化、多級(jí)分子蒸餾和尿素包合初步純化、精餾高純化，以及合成銀離子功能材料螯合制備分離等一系列技術(shù)手段，制備高含量乙酯型EPA魚油，以期為魚類加工副產(chǎn)物的高值化利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金槍魚內(nèi)臟、眼窩等副產(chǎn)物購(gòu)自浙江興業(yè)集團(tuán)有限公司；脂肪酸乙酯混合標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自杭州邦沃森生物科技有限公司；胰蛋白酶(60 000 U·g-1)，北京Solarbio公司；甲醇(色譜純)，德國(guó)Merck公司；硅膠(300～400目)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；巰丙基三甲氧基硅烷偶聯(lián)劑(MPTS)和正丁胺(分析純)，中國(guó)西隴化工股份有限公司；超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)，Milli-Q純水系統(tǒng)制得；所有提取用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

RL-60B渦旋混勻器，北京金紫光公司；AL204電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮公司；7890A氣相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；Rotina 420R落地式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；Direct Q8超純水系統(tǒng)，法國(guó)Milli-Q公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 粗魚油的提取、精制與乙酯化 金槍魚副產(chǎn)物組織搗碎后加水調(diào)節(jié)料液比至1∶5(w/v)，并調(diào)節(jié)pH值至8.0，再向其加入2%胰蛋白酶，在45℃條件下酶解反應(yīng)3 h。待反應(yīng)結(jié)束后，在6 000 r·min-1條件下離心15 min，得到上層魚油，即粗魚油。

粗魚油精制過程參照Crexi等[16]的方法。脫膠工藝參數(shù)：溫度80℃，時(shí)間30 min，脫膠劑(85%磷酸)添加量為油重1%，磁力攪拌轉(zhuǎn)速500 r·min-1，待反應(yīng)結(jié)束，10 000 r·min-1離心10 min；堿法脫酸工藝參數(shù)：溫度40℃，時(shí)間20 min，堿液(20% NaOH)添加量與脫膠油的酸價(jià)(acid value, AV)有關(guān)(理論添加量W理論值=7.13×10-4×W脫膠油×AV；W超量堿=4%×W脫膠油；W總添加量=W理論值+W超量堿)，轉(zhuǎn)速500 r·min-1，待反應(yīng)結(jié)束，10 000 r·min-1離心10 min，再加入95℃熱水洗滌，每次用量約占油重10%，水洗至中性；吸附脫色工藝參數(shù)：溫度70℃，時(shí)間20 min，活性白土添加量占油重10%，轉(zhuǎn)速500 r·min-1，待反應(yīng)結(jié)束，10 000 r·min-1離心10 min；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫臭工藝參數(shù)：溫度220℃，時(shí)間60 min，壓力0.06 MPa，轉(zhuǎn)速70 r·min-1。

將200 g精制魚油置于裝有磁力攪拌、冷凝回流和溫度計(jì)的三頸燒瓶中，水浴加熱至70℃，并配制100 mL 2 mol·L-1的NaOH/MeOH溶液與粗魚油混合后振蕩搖勻。待皂化完全并冷卻至室溫后，將溶液移至分液漏斗，靜置分層，回收上層油相，并旋蒸除去多余乙醇，最后用80℃的飽和NaCl洗滌，直至下層洗滌液清澈透明，取上相在真空條件下脫水，即得到乙酯型魚油。

1.3.2 分子蒸餾和尿素包合 稱取200 g魚油乙酯加到分子蒸餾設(shè)備的進(jìn)料器，設(shè)置預(yù)脫氣溫度60℃、蒸餾刮板轉(zhuǎn)速250 r·min-1、冷卻溫度5℃，然后將一級(jí)蒸餾得到的物料重新加入進(jìn)料器，在不同的蒸餾壓力、溫度、蒸餾級(jí)數(shù)條件下進(jìn)行蒸餾分離。將尿素溶于95%乙醇中，65℃水浴攪拌至混合溶液澄清，再加入一定量魚油(魚油∶尿素=3∶2，w/w)，反應(yīng)0.5 h后停止加熱，低溫靜置一段時(shí)間后真空抽濾，濾液通過旋蒸去除，水洗魚油2～3次，真空脫水，即得到純化魚油。

1.3.3 精餾處理 稱取500 mL魚油加入塔釜中，打開低溫恒溫槽和真空泵，檢查系統(tǒng)氣密性后將塔釜加熱至150℃。待塔頂出現(xiàn)回流時(shí)，記錄塔釜溫度、真空度等參數(shù)，維持全回流并保持系統(tǒng)穩(wěn)定。打開回流比控制器，收集餾出物。當(dāng)蒸汽量減少時(shí)適當(dāng)提高塔釜溫度，當(dāng)物料過少時(shí)停止加熱，泄真空，清洗并關(guān)閉系統(tǒng)。

1.3.4 銀離子材料螯合 稱取100 g活化硅膠(300～400目)于沸水中活化24 h，干燥后置于盛有1 000 mL鄰二甲苯的錐形瓶中，經(jīng)充分?jǐn)嚢韬蠹尤?0 mL巰丙基三甲氧基硅烷偶聯(lián)劑與5 mL正丁胺。搭建加熱冷凝回流裝置，將其于氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱至150℃并反應(yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻、靜置、過濾得到巰丙基硅膠，分別用1 L甲苯、丙酮、超純水及甲醇洗滌2次，并于干燥箱內(nèi)60℃干燥16 h，合成巰丙基硅膠。稱取25 g硝酸銀攪拌溶解于1 000 mL甲醇水溶液(1∶1, v/v)，并向其加入100 g巰丙基硅膠，避光攪拌反應(yīng)2 h，靜置沉降后去除下層沉淀，分別用2 L甲醇和超純水洗滌2次，置于干燥箱內(nèi)60℃干燥16 h，即得到銀硫醇硅膠[17]。

所以如今在陶瓷藝術(shù)對(duì)公共空間的介入，不僅僅傳承了古代中國(guó)文化中的儀式感和宜物精神。更是在豐富人們的視覺，提高人們的審美情趣的同時(shí)，為公共空間的動(dòng)線起到引導(dǎo)的作用，并且為人們提供一個(gè)相遇的契機(jī)和互動(dòng)的機(jī)會(huì)。

將玻璃層析柱(200 mm×30 mm)垂直固定于鐵架臺(tái)，將固定相與正己烷混懸液(1∶4，w/w)快速倒入柱內(nèi)，半開底部活塞使流動(dòng)相緩慢流出；輕敲柱體使固定相沉積緊密，并在固定相頂部覆蓋少量石英砂。稱取1 g脂肪酸乙酯溶解于1 mL正己烷中，關(guān)閉活塞并將樣品緩慢加入石英砂表面，然后打開底部活塞使流動(dòng)相流出，待樣品完全進(jìn)入石英砂床層后，在層析柱頂部加一個(gè)恒壓漏斗，漏斗內(nèi)加入0.5%丙酮-正己烷流動(dòng)相，控制流動(dòng)相的流出速度約為1～1.2 mL·min-1進(jìn)行洗脫。每50 mL洗脫液收集1次，色譜檢測(cè)EPA乙酯純度。

1.3.5 氣相色譜條件 檢測(cè)條件：HP-88氰丙基色譜柱 (30 m × 0.25 mm, 0.20 μm)；載氣H2；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量1 μL；檢測(cè)溫度220℃。程序升溫：起始柱溫設(shè)定為70℃，以15℃·min-1升至120℃，保持1 min，再以5℃·min-1升至175℃，保持10 min；最后以5℃·min-1升至220℃，保持5 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

魚油粗提取試驗(yàn)中所得的5組平行數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2018進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差分析，并用Origin 8.0軟件作圖。氣相色譜分析中均使用歸一化法進(jìn)行定量分析。根據(jù)下式計(jì)算得率：

(1)

(2)

式中，m1為粗魚油質(zhì)量；mbp為副產(chǎn)物質(zhì)量；m2為純化產(chǎn)物質(zhì)量；C1為產(chǎn)品中EPA濃度；m3為原料魚油質(zhì)量；C2為原料魚油中EPA濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗魚油的提取

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level.圖1 各因素對(duì)金槍魚魚油提取率的影響Fig.1 Effect of different parameters on the yield of fish oil

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果 酶解法條件溫和，易于控制，有利于保護(hù)魚油的功能性成分，且提取率高，適用于提取大目金槍魚魚油[18]。由圖1-A可知，隨著酶解pH值的升高，大目金槍魚副產(chǎn)物魚油提取率隨之提高，當(dāng)pH值為8.5時(shí)魚油提取率達(dá)到峰值，隨后呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。催化酶通常具有最適pH值范圍，過酸或過堿條件均會(huì)導(dǎo)致酶活力下降或不可逆失活。本試驗(yàn)根據(jù)胰酶的最適pH值范圍進(jìn)一步優(yōu)化，確定最佳催化反應(yīng)pH值為8.5。由圖1-B可知，隨著酶解溫度的升高，魚油提取率顯著上升，當(dāng)酶解溫度大于40℃時(shí)，魚油提取率變化趨勢(shì)趨于平緩，并于45℃達(dá)到最高值，繼續(xù)升高溫度，魚油提取率顯著下降，表明溫度對(duì)酶活性的影響較為直接，升高溫度可加速分子熱運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)酶解反應(yīng)，但當(dāng)溫度過高時(shí)易導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)變性失活。因此，最佳的酶解溫度為45℃。由圖1-C可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，金槍魚油提取率逐步上升，當(dāng)酶解時(shí)間超過3 h后魚油提取率變化趨于平緩，繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間對(duì)魚油提取率的影響不大，且未出現(xiàn)部分文獻(xiàn)報(bào)道的因時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致的魚油被氧化分解的現(xiàn)象[19]。酶解時(shí)間過短會(huì)導(dǎo)致酶和底物反應(yīng)不充分，過長(zhǎng)則造成浪費(fèi)，因此以3 h為最佳酶解時(shí)間。

根據(jù)上述優(yōu)化得到的條件，在45℃、pH值8.5條件下酶解反應(yīng)3 h，得到的金槍魚粗魚油提取率為43.56%，這與前人結(jié)果相一致[20]。

2.1.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計(jì)原理，以酶解pH值(A)、酶解溫度(B)、酶解時(shí)間(C)為自變量，魚油提取率(Y)為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Design and factors of response surface methodology

表2 響應(yīng)面方案設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 RSM program design and the result

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見表2。利用Design Expert 8.0軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析及擬合，得到的魚油提取率回歸方程為：

Y=4.53-0.014A-0.026B+0.37C+0.005AB+0.002 5AC+0.028BC-0.15A2-0.11B2-0.19C2。

由表3可知，模型極顯著(P<0.001)，失擬項(xiàng)不顯著(P> 0.05)，且R2=0.995 5，表明該回歸方程與實(shí)際數(shù)據(jù)擬合度較高。本試驗(yàn)的變異系數(shù)較低，僅為6.62%。變異系數(shù)越低，試驗(yàn)的穩(wěn)定性越高，說明該方程的可信度較高。響應(yīng)面分析可知，一次項(xiàng)B具有顯著性(P<0.05)，一次項(xiàng)C及二次項(xiàng)A2、B2、C2具有極顯著性(P<0.001)。

經(jīng)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得出的最佳提取條件為：酶解pH值8.48、酶解溫度45.00℃、酶解時(shí)間3.48 h，此條件下提取率預(yù)測(cè)值為43.87%。由圖2可知，酶解時(shí)間超過3 h后對(duì)金槍魚魚油提取率的影響較小，為便于實(shí)際操作，將酶解條件調(diào)整為：酶解pH值8.5、酶解溫度45℃、酶解時(shí)間3 h，在該條件下進(jìn)行5次重復(fù)試驗(yàn)，驗(yàn)證得到粗魚油的實(shí)際提取率平均值為43.69%±0.61%，與預(yù)測(cè)值相差不大，表明此優(yōu)化條件有效。

2.2 魚油純化

將提取制備的粗魚油按照1.3.1中的方法處理，得到乙酯型魚油，再通過多級(jí)分子蒸餾法和尿素包合法純化魚油，最后用氣相色譜法對(duì)提取所得的精制魚油和純化魚油樣品進(jìn)行脂肪酸乙酯化試驗(yàn)，將試驗(yàn)得出的樣品中化學(xué)成分的氣相色譜圖和混和標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖進(jìn)行對(duì)比，用面積歸一化法定量分析各類脂肪酸的相對(duì)含量[21]。結(jié)果顯示，金槍魚油中共檢出19種脂肪酸乙酯分子，以精制魚油為例(圖3)，各個(gè)脂肪酸乙酯色譜峰分離度較高，其中信號(hào)響應(yīng)最強(qiáng)的為EPA和DHA，保留時(shí)間分別為19.24、23.05 min。

由表4可知，精制魚油中飽和脂肪酸(saturated fatty acids，SFA)、單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acids，MUFA)和PUFA含量較為相近，其中SFA占30.09%，SFA中主要以C16：0為主，其次為C18：0和C14：0；MUFA含量為36.15%，以C18：1和C16：1居多，分別為23.45%和8.25%；不同于普通淡水魚油脂，金槍魚油中PUFA含量較高，達(dá)到了33.76%，主要成分為EPA(6.73%)和DHA(21.54%)。通過分子蒸餾處理，C14：0、C16：0等完全脫除，SFA進(jìn)一步降低到1.25%，MUFA含量也有所下降，降至11.09%，而PUFA則提高至87.66%，其中包括EPA(46.34%)和DHA(34.58%)。經(jīng)尿素包合反應(yīng)后，SFA降低至11.33%，而PUFA提高至66.99%。

表3 回歸方程參數(shù)方差分析表Table 3 Regression equation parameter analysis of variance table

注:*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.001)。

Note:*indicates significant differences at 0.05 level.**indicates significant differences at 0.001 level.

圖2 魚油提取率的響應(yīng)面及等高線Fig.2 Response surface plot and contour lines of the fish oil yield

表4 精制和分子蒸餾、尿素包合處理后魚油的脂肪酸組成分析Table 4 The fatty acid ethyl esters of refined fish oil and the fish oil processed by molecular distillation and urea complexation

注: ND表示未檢出。

Note: ND indicates not detected.

2.3 精餾試驗(yàn)結(jié)果

精餾原料魚油中EPA含量為46.34%(表4)，上樣量為200 g。當(dāng)精餾塔頂溫度為130℃左右時(shí)開始出現(xiàn)回流，全回流1 h后開始收集餾分，每隔1 h對(duì)餾分進(jìn)行氣相色譜分析。由于原料魚油中本身EPA含量已經(jīng)較高，因此初期餾分中的EPA≥60%。隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，餾分中的EPA含量逐漸升高，2 h后即達(dá)到80%以上，4 h左右達(dá)到峰值85.3%。精餾后期階段，塔頂EPA含量開始下降，泄真空并停止精餾。將EPA含量≥80%的餾分合并，得到含量為82.40%的高EPA乙酯型魚油46.70g，得率為39.00%。

本試驗(yàn)比較了不同高度精餾柱(350、500、800 mm)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用350 mm的精餾柱時(shí)，由于塔板數(shù)相對(duì)較少，產(chǎn)物中EPA含量為僅為76.40%，得率為43.50%。隨著精餾柱高度的增加，產(chǎn)品EPA含量增加，得率降低。當(dāng)填料高度為800 mm，塔釜溫度升高至200℃以上時(shí)也未見塔頂組分餾出，原因可能是精餾柱過高導(dǎo)致壓降過大，同時(shí)自制的精餾設(shè)備保溫效果并不十分理想，若進(jìn)一步升高塔釜溫度，極易導(dǎo)致脂肪酸乙酯的聚合、異構(gòu)化等熱敏反應(yīng)[22]。因此，本試驗(yàn)選取500 mm的精餾柱用于魚油精餾純化。

2.4 EPA的純化

流動(dòng)相為經(jīng)精餾加工后EPA純度為82.40%的乙酯型魚油，以1 mL·min-1的流速通過銀硫醇硅膠柱進(jìn)行洗脫，餾分收集器設(shè)置為每管50 mL。每組餾分經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后使用氣相色譜檢測(cè)EPA純度。由圖4可知，前3 h中EPA未被洗脫，餾分中未能檢測(cè)出EPA信號(hào)，隨著進(jìn)一步洗脫，逐漸有EPA流出，7 h時(shí)EPA純度即達(dá)到了85.70%，8 h時(shí)EPA純度為91.00%，并隨著試驗(yàn)的進(jìn)行逐步提高，19 h時(shí)達(dá)到峰值96.30%后呈逐漸下降趨勢(shì)。鑒于目前美國(guó)阿瑪林公司的Vascepa產(chǎn)品中EPA ≥ 96.00%[23]，將收集的11～19 h的餾分混合后得到純度為96.30%的EPA乙酯，得率為32.90%。

3 討論

圖3 精制魚油氣相色譜圖Fig.3 The gas chromatogram of purified fish oil

圖4 銀離子功能材料螯合制備分離EPA乙酯Fig.4 Silver ion functionalized material for preparative separation of EPA

目前，水產(chǎn)品加工廢棄物中油脂的提取方法有很多種，如蒸煮法、溶劑法、酶解法等。其中，蒸煮法[24]屬物理方法，是利用油脂與水互不相容的原理。在蒸煮條件下，使細(xì)胞破裂，并以水作為溶劑，達(dá)到分離油脂的目的，此法操作簡(jiǎn)單，對(duì)試驗(yàn)設(shè)備要求低，但油脂的提取率和品質(zhì)不高。溶劑法多以正己烷、乙醚、異丙醇、石油醚等作為溶劑以提取油脂，但乙醚、石油醚極易揮發(fā)、易爆、易燃，存在一定的安全隱患和環(huán)境污染問題[25]。而酶解法因其操作條件溫和、酶解液可被進(jìn)一步利用等優(yōu)點(diǎn)被稱為提取動(dòng)物油脂的理想方法，其作用原理是通過蛋白酶酶解蛋白質(zhì)以破壞其與油脂的結(jié)合，從而得到油脂[26-27]。本試驗(yàn)通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到酶解法最佳工藝參數(shù)，該條件下魚油提取率為47%，而陶寧萍等[28]報(bào)道的酶解法提取黃鰭金槍魚眼窩肉魚油的提取率僅為20.68%，且需在50℃條件下酶解4 h。相比之下，本試驗(yàn)采用的酶解方法提取率更高、操作時(shí)間更短、能耗更省，且EPA與DHA含量高。

本研究采用分子蒸餾法和尿素包合法制備高純度乙酯型金槍魚油，其結(jié)果與傅紅等[29]、張蒙娜等[8]的研究結(jié)果相一致，這兩種富集方法制得魚油中PUFA含量差異較明顯，其主要原因是分子蒸餾能利用物質(zhì)分子間平均自由程的不同而實(shí)現(xiàn)組分分離，而魚油中的PUFA與SFA、MUFA間的分子平均自由程相差較大，故能極大提高富集率[30]。而尿素包合法無法將PUFA完全包合，易混入其他組分，無法分離EPA和DHA，且在操作過程中需消耗大量乙醇，并存在乙醇回收率低、環(huán)境污染等潛在問題。在實(shí)際生產(chǎn)過程中，尿素包合法常用于魚油富集工藝的預(yù)處理[31]。

隨著保健品行業(yè)與魚油制品加工技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)EPA乙酯純度的要求越來越高，而純度越高，對(duì)加工生產(chǎn)技術(shù)要求也就越高。目前，已報(bào)到的關(guān)于EPA乙酯純度大多數(shù)約為95.00%[31]。本研究采用銀硫醇硅膠柱制備得到的EPA純度高達(dá)96.30%。但本研究中魚油純化、精餾及EPA純化等工藝參數(shù)主要是參照相關(guān)文獻(xiàn)，未進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，可能會(huì)使試驗(yàn)結(jié)果有所差異。今后應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)的工藝參數(shù)優(yōu)化試驗(yàn)，進(jìn)一步完善魚油分離制備及EPA分離純化工藝。

4 結(jié)論

以大目金槍魚副產(chǎn)物為原料，通過響應(yīng)面優(yōu)化酶輔助提取粗魚油，得到最佳工藝參數(shù)為：酶解pH值8.5、酶解溫度45℃、酶解時(shí)間3 h，此條件下粗魚油提取率高達(dá)43.69%。采用化學(xué)催化乙酯化、多級(jí)分子蒸餾和尿素包合初步純化、精餾高純化，以及合成銀離子功能材料螯合制備分離等一系列精制加工技術(shù)可制備純化出EPA和DHA含量80.00%以上的魚油，獲得的EPA純度高達(dá)96.00%以上，達(dá)到了美國(guó)FDA注冊(cè)認(rèn)證藥物的含量要求(≥ 96.00%)。本試驗(yàn)方法可有效用于提取大目金槍魚副產(chǎn)物中的魚油成分。