高志遠(yuǎn) 胡亞亞 劉蘭服 王亞楠 焦偉靜 馬志民,* 木泰華

(1 河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所/河北省作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050035；2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；3 河北省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，河北 石家莊 050000)

甘薯[Ipomoeabatatas(L.)Lam.]具有抗旱耐脊、適應(yīng)性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)成分豐富等特點(diǎn)且用途廣泛，在我國(guó)糧食安全和能源安全中扮演著重要的角色[1-2]。然而，由于我國(guó)耕地面積的限制，甘薯主產(chǎn)區(qū)連作問(wèn)題突出，嚴(yán)重影響了甘薯的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前，關(guān)于連作障礙的研究已有大量報(bào)道，主要集中在玉米[3]、大豆[4]和黃瓜等[5]作物上，而關(guān)于甘薯連作障礙的研究尚鮮見報(bào)道。研究表明，土壤中微生物含量豐富，直接影響著土壤的結(jié)構(gòu)、肥力及養(yǎng)分轉(zhuǎn)化[6]。且連作障礙的發(fā)生與土壤微生物的種類和數(shù)量變化有著密切的關(guān)系[7]。

隨著生態(tài)環(huán)境保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)，生態(tài)手段防控技術(shù)逐漸受到人們的關(guān)注，明確連作障礙機(jī)理是開展甘薯連作障礙生態(tài)防控技術(shù)研究的基礎(chǔ)。商麗麗等[8]采用傳統(tǒng)稀釋平板計(jì)數(shù)法研究了煙薯25重茬對(duì)土壤微生物的影響。然而，大部分土壤微生物是不可培養(yǎng)或是非活性的，傳統(tǒng)方法分離鑒定的微生物僅占環(huán)境微生物總數(shù)的0.1%～10%[9-10]。隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的研究方法不斷增多。其中，磷脂脂肪酸(phospholipid fattyacid，PLFA)圖譜分析技術(shù)克服了傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)，可以對(duì)微生物群落進(jìn)行定量分析，是一種快捷、可靠的檢測(cè)方法[11]。PLFA法在研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)方面應(yīng)用廣泛。祁建軍等[12]利用PLFA法分析地黃根際土微生物結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)地黃根際真菌標(biāo)志磷脂C18：2 w6,9含量顯著高于非根際的對(duì)照土壤，這可能與根際病害發(fā)生有關(guān)。甘薯受連作影響明顯，但不同品種甘薯受連作影響的程度不同，目前，尚未見利用PLFA法分析甘薯連作根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的相關(guān)報(bào)道。本研究以耐連作徐薯18和不耐連作遺字138為試驗(yàn)材料，分別采集其連作2年間的栽植初期和收獲前期的根際土壤樣品進(jìn)行PLFA測(cè)定，分析其微生物群落結(jié)構(gòu)的差異，探究連作障礙主導(dǎo)因素，以期為解決甘薯連作障礙提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2015年在河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所藁城堤上試驗(yàn)站(37°56′24.62″N，114°42′46.96″E)進(jìn)行。年平均氣溫12.5℃，1月份最冷月平均氣溫 -3.5℃，7月份最熱月平均氣溫26.4℃。年平均降水量494 mm，7-8月份降水量最多，約占全年的56.2%。供試土壤基礎(chǔ)肥力為堿解氮85.83 mg·kg-1、速效磷24.08 mg·kg-1、速效鉀114.17 mg·kg-1、土壤pH值8.40。

1.2 試驗(yàn)材料

供試甘薯品種為徐薯18(X18)和遺字138(Y138)，均由河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所甘薯研究室自繁自育。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，重復(fù)3次。壟距85 cm，株距25 cm，5行區(qū)，小區(qū)長(zhǎng)度6 m，每個(gè)小區(qū)面積為25.5 m2，田間管理同常規(guī)。分別于栽后30 d和收前7 d采集根際土壤。參照孫敬祖等[13]的取樣方法，用采樣鏟分別將甘薯植株整個(gè)根系完整挖出，輕敲根系，使與根系粘附較松的土壤自然落下后棄去，采集與根系緊密粘附的土壤。在樣地以“S”形布點(diǎn)取樣，過(guò)2 mm孔徑篩子后，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PLFA的提取及測(cè)定方法

參照Frostegard等[14]的方法，準(zhǔn)確稱取8.0 g冷凍干燥的土樣進(jìn)行PLFA提取和分析，通過(guò)Agilent 6 850N(FID檢測(cè)器)氣相色譜儀(安捷倫科技有限公司，美國(guó))分析PLFA的組成及含量。

PLFA命名原則如下[15]：以總碳數(shù)、雙鍵數(shù)和雙鍵距離分子末端位置命名，c表示順式，t表示反式；a和i分別表示支鏈的反異構(gòu)和異構(gòu)；br表示不確定甲基的位置；10Me表示1個(gè)甲基基團(tuán)在距分子末端第10個(gè)碳原子上；環(huán)丙烷脂肪酸用cy表示。以C19:0為內(nèi)標(biāo)，根據(jù)脂肪酸的碳原子數(shù)目、雙鍵數(shù)目和位置確定不同的PLFA。根據(jù)文獻(xiàn)[8，12，16-21]確定表征不同微生物的PLFA(表1)。

表1 本研究所涉及的表征微生物的PLFATable 1 The PLFA that characterization of the microorganisms involved in this study

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件計(jì)算PLFA含量及其平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差，并進(jìn)行PLFA主成分分析，并應(yīng)用SPSS 21.0 進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種甘薯各采樣時(shí)期根際土壤PLFA組成及含量變化

分別于2015年、2016年采集徐薯18(X18)、遺字138(Y138)栽植初期和收獲前期的根際土壤樣品，對(duì)4次取樣的根際土壤樣品進(jìn)行PLFA提取，測(cè)定C10～C24的PLFA(圖1)。結(jié)果表明，所有根際土壤樣品中，i15：0、 a15：0、16：3 w6c、16：0、18：1 w9c、18：1 w7c、18：0、cy19：0 w7c這8種PLFA含量顯著高于其他種類PLFA含量(P<0.05)，說(shuō)明其在土壤中占優(yōu)勢(shì)。X18和Y138根際土壤中的PLFA含量存在差異。2015年栽植初期(栽植后30 d)，X18根際土壤的PLFA含量顯著高于Y138(P<0.05)，且16：1 w4c、17：1 w5c僅存在于X18中，而16：1 w6c、16：1 w3c、16：0 DMA、a17：1 w9c、17：1 w4c和18：1 w8c僅存在于Y138中。2015年收獲前期，X18根際土壤中新增16：1 w6c、16：1 w3c、16：0 DMA和a17：1 w9c；而Y138中新增16：1 w5c、16：1 w4c、16：0 10Me和17：1 w5c，同時(shí)i17：1 w9c、18：1 w9c和18：1 w7c的含量也有所增加，其中，18：1 w9c表征致病真菌[22]其含量顯著增加，這可能與Y138不耐連作有關(guān)。2016年栽植初期和收獲前期，X18和Y138根際土壤的PLFA含量差異不顯著，與2015年相比，18：1 w9c 含量在Y138中均顯著增加，表征叢枝菌根真菌的16：1 w5c[12]和表征放線菌的16：0 10Me含量均顯著增多(P<0.05)。結(jié)果表明，連作引起有害微生物增加的同時(shí)，有益微生物也會(huì)相應(yīng)增加，只是相對(duì)含量較少，未起到拮抗有害微生物的效果。2016年栽植初期和2015年收獲前期相比，X18、Y138根際土壤中12：0、 i14：0、14：0等表征細(xì)菌的PLFA含量均有所增加；表征叢枝菌根真菌的16：1 w5c也均有所增加，且在X18中的增加量是Y138的1.5倍，且差異顯著(P<0.05)，表明休閑期的X18根際土壤中有益微生物增加較多，這可能與其耐連作有關(guān)。

由圖2可知，與2015年相比，2016年的總PLFA含量整體呈升高趨勢(shì)。X18和Y138的總PLFA含量變化不同。2015年收獲前期，X18的總PLFA含量有所降低，經(jīng)過(guò)休閑期后到2016年栽植初期顯著升高；而Y138的總PLFA含量有所升高，但不顯著，經(jīng)過(guò)休閑期后其總PLFA含量增加顯著，表明休閑期對(duì)X18和Y138的總PLFA含量均有一定影響。在2016年收獲前期和栽植初期，X18和Y138的總PLFA含量差異均不顯著。

注：不同小寫字母表示同品種不同采樣時(shí)期的PLFA含量差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示不同品種相同采樣期的PLFA含量差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate the PLFA content of the same variety in different sampling period significant difference at 0.05 level. Different capital letters indicate the PLFA content of different varieties in the same sample period significant difference at 0.05 level. The same as following.圖2 不同采樣時(shí)期總PLFA含量變化Fig.2 Change of the total PLFA content in different sampling periods

2.2 甘薯根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析

由圖3可知，甘薯根際土壤中細(xì)菌含量最多。2015年栽植初期，X18根際土壤中的細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)、革蘭氏陰性菌(G-)、真菌、放線菌PLFA含量均高于Y138。與2015年栽植初期相比，2016年栽植初期Y138各類微生物的PLFA增加量均高于X18，特別是真菌和放線菌的PLFA含量增加顯著，分別是X18的3.5倍和1.24倍。表明真菌數(shù)目的增加可能會(huì)引發(fā)病害，是反映土壤性質(zhì)不良的指標(biāo)之一[23]。

2015年收獲前期，X18根際土壤中各類微生物PLFA含量均低于Y138，其中細(xì)菌和G+的PLFA含量顯著低于Y138(P<0.05)。到2016年栽植初期，經(jīng)過(guò)7個(gè)月休閑期，X18和Y138中各微生物的PLFA含量均有所增加，且X18的增加量高于Y138，表明休閑期對(duì)甘薯根際土壤微生物有一定影響，且休閑期對(duì)X18的作用較強(qiáng)。X18具有一定的抗病能力，其真菌PLFA含量有所增加，但病害較輕。在2016年收獲前期和栽植初期，X18和Y138主要根際土微生物的PLFA含量均無(wú)顯著性差異。

由圖4-A可知，與2015年栽植初期相比，2015年收獲前期X18的F/B值有所降低，而Y138的F/B值則顯著升高，表明真菌增加、細(xì)菌減少，真菌數(shù)目的增加會(huì)引起病害加重，而細(xì)菌數(shù)目的減少可能導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)循環(huán)效率降低。與2015年栽植初期相比，2016年栽植初期X18和Y138的F/B值均有所升高，表明連作對(duì)二者均有一定影響，但對(duì)Y138的影響較大，Y138的F/B值增加幅度為X18的2倍；與2015年收獲前期相比，2016年栽植初期X18的F/B值顯著升高，而Y138的F/B值略有降低，但不顯著；與2015年收獲前期相比，2016年收獲前期X18和Y138的F/B值均有所升高，但Y138變化不顯著，F(xiàn)/B值的變化趨勢(shì)與真菌相似；2016年收獲前期的F/B值高于2016年栽植初期和2015年栽植初期，表明連作對(duì)根際土壤真菌和細(xì)菌均有一定影響，破壞了根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響了甘薯的生長(zhǎng)。

從2015-2016年，X18 G+/G-值呈減小趨勢(shì)，Y138的G+/G-值呈先升高后下降的趨勢(shì)。G-更易生長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)豐富的土壤中，因此G+/G-值越小，表明有機(jī)質(zhì)越豐富[24]。這可能是由于甘薯連作，特別是不耐連作的Y138連續(xù)種植，導(dǎo)致土壤中致病菌增多，根腐病嚴(yán)重，造成甘薯毛根死亡，根部腐爛，從而出現(xiàn)土壤中有機(jī)質(zhì)含量有所升高的現(xiàn)象，而耐連作的X18具有一定的抗根腐病的能力，雖有影響，但相比Y138較輕。

圖3 不同采樣時(shí)期各樣品中不同種類微生物PLFA含量變化Fig.3 Changes of PLFA content of different microbial species of each sample in different sampling periods

圖4 不同樣品在不同采樣時(shí)期F/B值及G+/G-值的變化Fig.4 Changes of F/B value and G+/G- value of different samples in different sampling periods

圖5 2015-2016年不同采樣時(shí)期各樣品PLFA的主成分分析(A)及單個(gè)PLFA載荷圖(B)Fig.5 Principal component analysis of PLFA in different samples at different sampling times in 2015-2016(A) and load chart of single PLFA(B)

2.3 不同品種間PLFA的主成分分析

對(duì)2015-2016年不同樣品的PLFA進(jìn)行主成分分析，2個(gè)主成分得分解釋了89.05%的變異。由圖5-A 可知，在提取的2個(gè)主成分中，PC1解釋了76.91%的變異，PC2解釋了12.14%的變異。X18在2年間的4個(gè)樣品分別分布在第一、第二、第四象限，Y138分別分布在第一、第二、第三象限，表明2年樣品間差異較大，即連作對(duì)X18和Y138的PLFA均有影響。2015年栽植初期和收獲前期，X18和Y138的分布均相距較遠(yuǎn)，表明其差異較大；2016年栽植初期和收獲前期，2個(gè)品種均分布在第一象限，二者距離較近，表明二者差異較小，說(shuō)明其群落結(jié)構(gòu)較為相似；2016年、2015年同時(shí)期相比，2個(gè)品種相距均較遠(yuǎn)，表明其根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大，說(shuō)明無(wú)論是否耐連作，二者均受連作的影響，但程度不同。由圖5-B可知，對(duì)單體PLFA在主成分上的載荷值進(jìn)行分析，12：0、i14：0和16：1 w7c等均與PC1呈正相關(guān)，17：1 w7c、16：0 DMA和16：1 w9c等均與PC1呈負(fù)相關(guān)。cy17：0 w7c、a16：0和20：0 10Me等均與PC2呈正相關(guān)，18：2 w6c、17：1 w5c和18：1 w5c等均與PC2呈負(fù)相關(guān)。

3 討論

本研究利用PLFA法初步分析了甘薯連作后根際土壤微生物群落的變化，發(fā)現(xiàn)連作后總PLFA含量均有所升高，表明連作后，甘薯根際土壤總的微生物含量增加，尤其真菌增加顯著。這與前人[10,25]報(bào)道的連作可使真菌含量增加的結(jié)論一致。本研究表明，不同甘薯品種受連作影響程度不同，其中不耐連作Y138的真菌含量增加更為顯著，進(jìn)而影響了甘薯根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。土壤環(huán)境劣化，致病真菌增多，引發(fā)根腐病。研究發(fā)現(xiàn)根腐病的產(chǎn)生多是由于連作、土壤貧瘠和干旱等因素引發(fā)的，且其致病菌主要為鐮孢真菌[26]。本研究結(jié)果表明，不同甘薯品種對(duì)根腐病的抗性不同，X18具有一定的抗根腐病能力；此外，不同甘薯品種的根系分泌物可能不同，不耐連作品種的根系分泌物可能更有利于有害真菌的生長(zhǎng)，從而形成惡性循環(huán)，使甘薯病害加重，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降。甘薯連作引起的土壤理化性質(zhì)、土壤酶活、不同品種根系分泌物的差異及其對(duì)根際土壤微生態(tài)的影響尚不清楚，還有待進(jìn)一步研究。本研究中，連作后總微生物含量和放線菌含量均有所增加，這與前人[8]研究結(jié)果不同。可能與供試甘薯品種或試驗(yàn)方法或連作年限不同有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)休閑期對(duì)甘薯根際土壤微生物群落變化也有一定影響，休閑期間細(xì)菌等主要微生物含量有所恢復(fù)，以促進(jìn)微生物群落結(jié)構(gòu)平衡。研究表明，輪作倒茬可以有效緩解大豆的連作障礙，使輪作大豆成熟期根際土壤真菌和細(xì)菌PLFA比例較連作3年處理降低2倍[27]。因此，充分利用休閑期進(jìn)行合理的輪作倒茬，可能緩解甘薯連作障礙。此外，還可以結(jié)合施用一般有機(jī)肥、土壤改良劑等，促進(jìn)有益微生物生長(zhǎng)，維持土壤微生態(tài)平衡[28-30]。

PLFA技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于土壤、湖泊等環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的研究中，但也存在不足之處，如對(duì)特異性微生物類群的鑒定不夠準(zhǔn)確[31]，無(wú)法在種的水平上揭示土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化[32]。為了更好、更全面地了解甘薯根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，應(yīng)采用多種方法分析，如高通量測(cè)序等分子生物學(xué)技術(shù)。

4 結(jié)論

甘薯連作對(duì)根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)有一定的影響，連作后，總PLFA含量有所升高，即甘薯根際土壤總微生物含量有所升高；真菌含量增加顯著，微生物群落結(jié)構(gòu)失衡，Y138的真菌含量增加較X18更為顯著，與其品種特性有一定的關(guān)系，同時(shí)休閑期對(duì)二者也有一定的影響，使微生物含量增多，其中X18中表征叢枝菌根真菌的16：1 w5c含量較Y138增加明顯，有利于X18生長(zhǎng)，這可能與其耐連作有關(guān)，因此應(yīng)增強(qiáng)對(duì)休閑期的重視，合理利用，緩解連作障礙。