龔絲雨 梁喜歡 楊帥強(qiáng) 張世川 朱肖文 劉齊元

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045)

磷(P)是植物生長發(fā)育過程中的營養(yǎng)元素之一，也是構(gòu)成植物體內(nèi)重要有機(jī)化合物(如ATP、磷脂、核酸)的必要元素，在植物能量轉(zhuǎn)化與物質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要的作用[1-2]。磷素是評(píng)價(jià)土壤肥力的主要指標(biāo)之一，其含量及有效性對(duì)作物的生長發(fā)育和新陳代謝具有重要影響[3]。目前，我國耕地土壤有效磷嚴(yán)重缺乏，施用磷肥雖能使土壤有效磷含量上升[4]，但存在磷肥利用效率低，生產(chǎn)成本高等問題，且持續(xù)施用還會(huì)引發(fā)水體富營養(yǎng)化等一系列環(huán)境污染問題[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)同一作物的不同品種對(duì)低磷脅迫和磷肥效應(yīng)具有顯著的品種差異[7]。因此，利用磷高效植物種質(zhì)資源，研究植物對(duì)磷素高效吸收利用機(jī)理，對(duì)降低植物對(duì)磷肥的依賴性，建立發(fā)展高效、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、環(huán)保的作物生產(chǎn)體系和促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義。

煙草(NicotianatabacumL.)是我國栽培的重要經(jīng)濟(jì)作物，每年煙草行業(yè)的稅收約占全國總財(cái)政收入的10%，具有舉足輕重的地位[8]。研究表明，煙草雖然對(duì)磷素需求量不高，但對(duì)磷的缺乏極度敏感，生長期間若缺磷則表現(xiàn)出生長緩慢、株體瘦小、葉片窄小、葉色發(fā)黑、煙葉化學(xué)成分欠協(xié)調(diào)等癥狀，最終導(dǎo)致煙葉減產(chǎn)和品質(zhì)下降[9]。

目前，關(guān)于不同磷效率基因型作物在低磷脅迫下的生理特性研究已有大量報(bào)道，前人通過對(duì)大豆[10]、水稻[11]、小麥[12-13]等作物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)磷高效品種在低磷條件下的根系活力、可溶性蛋白含量及酸性磷酸酶活性均顯著高于磷低效品種，且其保護(hù)酶活性也保持在較高水平，丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量明顯更低。高家合等[14]、徐敏等[15]和李華麗[16]對(duì)耐低磷及磷高效煙草品種篩選進(jìn)行了相關(guān)研究，而關(guān)于不同磷效率類型煙草在磷脅迫下生理特征的研究尚鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，根據(jù)2017年煙草耐低磷及磷高效基因型的篩選結(jié)果(尚未發(fā)表)，以耐低磷且磷高效品種(K326、云煙105)和低磷敏感且磷低效品種(G28、中煙101)為試驗(yàn)材料進(jìn)行磷效率特征探討，以期為進(jìn)一步研究煙草養(yǎng)分高效生理機(jī)理和培育磷高效基因型煙草提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試煙草材料為磷高效且耐低磷品種(K326、云煙105)和磷低效且低磷敏感品種(G28、中煙101)。其中，云煙105由江西省煙葉科學(xué)研究所提供，其他3個(gè)品種均由國家農(nóng)作物種質(zhì)資源平臺(tái)煙草種質(zhì)資源子平臺(tái)提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018年在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。采用營養(yǎng)液水培方式，選擇飽滿健康的煙草種子進(jìn)行漂浮育苗，待煙草長至四葉一心期時(shí)，挑選長勢(shì)一致的煙苗在培養(yǎng)盆(長×寬×高=52 cm×40 cm×15 cm)中等間距定植，進(jìn)行低磷(LP，0.01 mmol·L-1KH2PO4)與正常磷(NP，1.00 mmol·L-1KH2PO4)營養(yǎng)液處理，營養(yǎng)液體積為8 L·盆-1，各品種每個(gè)處理培養(yǎng)1盆，每盆48株。營養(yǎng)液配制方法參照文獻(xiàn)[17]，并用NaOH和H2SO4調(diào)節(jié)營養(yǎng)液pH值為6.0。NP處理營養(yǎng)液配方：2.5 mmol·L-1NH4NO3、1.0 mmol·L-1KH2PO4、2.4 mmol·L-1K2SO4、4.6×10-2mmol·L-1H3BO3、5.0 mmol·L-1CaCl2、2.0 mmol·L-1MgSO4、9.0×10-3mmol·L-1MnCl2·4H2O、7.65×10-4mmol·L-1ZnSO4·7H2O、3.7×10-2mmol·L-1Fe-EDTA、3.2×10-4mmol·L-1CuSO4、1.6×10-5mmol·L-1(NH4)6MO7O24。LP處理中KH2PO4濃度為0.01 mmol·L-1，其他配方與NP相同，以KCl平衡調(diào)整K+。每隔3 d更換1次營養(yǎng)液，每天上午 9：00 用氧氣泵向營養(yǎng)液通氣30 min。從最后一次營養(yǎng)液更換日起連續(xù)5 d(6月25日-6月29日)定時(shí)(21：00)測(cè)定營養(yǎng)液的pH值，處理28 d后開始測(cè)定煙草的農(nóng)藝性狀及相關(guān)生理指標(biāo)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 農(nóng)藝性狀的測(cè)定 參照煙草標(biāo)準(zhǔn)(YC/T 142-2010)[18]調(diào)查煙草株高(cm)、莖粗(mm)等農(nóng)藝性狀；采用排水法測(cè)定根系體積(mL)；像素法測(cè)量葉面積(cm2)；利用SPAD-502葉綠素儀(日本美能達(dá)公司)測(cè)定煙草葉片的葉綠素含量相對(duì)值(SPAD值)。將新鮮煙株分為地上部分和根系，105℃殺青30 min，75℃烘干獲得干重。

1.3.2 生理指標(biāo)的測(cè)定 根系活力測(cè)定采用氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)還原法；葉片游離脯氨酸含量采用酸性茚三酮(acidic ninhydrin)法；MDA及可溶性糖含量采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)法測(cè)定[19]。采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)分別測(cè)定葉片可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)活性。其中，ACP以每克組織蛋白在37℃與基質(zhì)作用30 min產(chǎn)生 1 mg 酚表示其活性，即U·g-1prot；SOD以每克組織在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)酶活力單位，單位為U·g-1FW。采用試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)分別測(cè)定葉片過氧化氫酶(catalase，CAT)和過氧化物酶(peroxidase，POD)活性。其中，CAT以每克組織每分鐘催化1 nmol H2O2降解定義為一個(gè)酶活力單位，即nmol·min-1·g-1FW；POD以每克組織在每毫升反應(yīng)體系中每分鐘A470變化0.01為一個(gè)酶活力單位，即U·g-1FW。營養(yǎng)液pH值利用臺(tái)式pH測(cè)定儀(上海雷磁儀器廠)測(cè)定。

1.3.3 耐低磷指數(shù)的計(jì)算 采用耐低磷指數(shù)(low-phosphorus tolerance index，L/N)[20]比較不同磷效率類型煙草在低磷脅迫下的生長及生理特征差異，按照公式計(jì)算耐低磷指數(shù)：

耐低磷指數(shù)=低磷條件下指標(biāo)測(cè)定值/正常磷條件下指標(biāo)測(cè)定值

(1)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與圖表制作；運(yùn)用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多重比較采用LSD檢驗(yàn)法，兩組數(shù)據(jù)間的差異顯著性采用T檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同磷效率煙草農(nóng)藝性狀的差異

由表1可知，低磷脅迫下，4個(gè)煙草基因型苗期農(nóng)藝性狀均受到不同程度的影響。與正常磷相比，低磷脅迫下煙苗的株高、莖粗、根體積、地上部干重、根干重、最大葉面積及葉片SPAD值均有所減小，而主根長有所增大。對(duì)于莖粗而言，G28、中煙101在2種磷素水平下均差異顯著，而K326、云煙105均無顯著差異。除莖粗外，各煙草基因型的其他指標(biāo)(地上部干重、根干重、株高、SPAD值等)LN與NP間均差異顯著。

表1 不同供磷條件下各煙草基因型苗期農(nóng)藝性狀特征Table 1 Characteristics of the agronomic trains in tobacco varieties at seedling stage under different phosphorus levels

注：同行不同小寫字母表示下的不同品種間差異顯著(P<0.05)，同列不同大寫字母表示同一品種的不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Different lowercase letters in the same line indicate significantly different among different vocrieties under the same treatment at 0.05 level.Different capital letters in the same column indicate significant different among different treatments of the same variety at 0.05 level. The same as following.

低磷脅迫下，不同磷效率煙草品種的各指標(biāo)變化幅度存在明顯差異，其中株高、SPAD值降幅依次為云煙105(17.50%、28.92%)K326(25.25%)>中煙101(21.90%)>G28(5.14%)。其中，K326和云煙105的主根長增幅較大，地上部與根干重、株高、莖粗等降幅較小，且其L/N值均較大，說明磷高效煙草品種在低磷脅迫下仍能保持較高的磷素利用效率。

2.2 不同磷效率煙草細(xì)胞保護(hù)酶活性的差異

由表2可知，低磷脅迫顯著提高了各煙草品種的CAT、POD和SOD活性。低磷水平下，G28、中煙101、云煙105和K326的CAT活性較正常磷處理分別提高了23.63%、57.71%、67.23%和88.96%，POD活性分別提高了23.20%、23.23%、40.78%和39.68%，SOD活性分別提高了17.61%、9.63%、38.89%和40.94%。低磷脅迫下，G28的CAT、POD活性增幅均為最低，中煙101的SOD活性增幅最低，K326的CAT和SOD活性增幅最高，云煙105的POD活性增幅最高。結(jié)果表明，磷高效品種的細(xì)胞保護(hù)酶提升幅度較大，而磷低效品種提升較小。CAT、POD和SOD活性的L/N值均表現(xiàn)為K326、云煙105較高，中煙101、G28較低。

2.3 不同磷效率煙草酸性磷酸酶活性的差異

由表3可知，低磷水平下，云煙105、K326根和葉中ACP活性均顯著提高，G28、中煙101根和葉中的ACP活性雖有所增加，但均無顯著差異。根中ACP活性增幅依次為K326(47.94%)>云煙105(25.85%)>中煙101(15.67%)>G28(9.52%)；葉中4個(gè)品種的ACP活性變化趨勢(shì)同根一致，增幅最大為 K326(49.02%)，其次是云煙105(26.67%)，再次為中煙101(8.79%)，G28(8.77%)最低；根和葉中ACP活性增幅均表現(xiàn)為K326>云煙105>中煙101>G28，說明磷高效品種的ACP活性增幅大于磷低效品種。根中，K326 的L/N值顯著高于其他3個(gè)基因型，云煙105 的L/N值顯著高于中煙101、G28；葉中，各煙草基因型的L/N值間無顯著差異。2種處理下，根和葉中的ACP活性均為K326和云煙105較高，說明磷高效品種在LP和NP處理下均具有高效的磷營養(yǎng)效率。同一處理下，各基因型根中ACP活性均高于葉片。

2.4 不同磷效率煙草根系活力及水培營養(yǎng)液pH值的差異

由表4可知，與正常施磷相比，低磷水平下各煙草基因型的根系活力均顯著降低，其中降幅最大的是G28，降低了73.00%，K326降幅最小(25.26%)。根系活力的L/N值以K326為最高，云煙105和中煙101次之，G28最低，表明磷低效煙草品種的根系活性受低磷脅迫的影響更為明顯。

表2 不同供磷條件下各煙草基因型細(xì)胞保護(hù)酶活性Table 2 Cell protective enzyme activities in tobacco varieties at seedling stage under different phosphorus levels

Note: A:LP. B:NP. C:L/N.圖1 不同供磷條件下各煙草基因型培營養(yǎng)液pH值變化Fig.1 Changes of pH value of nutrient solutions in tobacco varieties under different phosphorus levels

表3 不同供磷條件下各煙草基因型酸性磷酸酶活性Table 3 Acid phosphatase activities in tobacco varieties at seedling stage under different phosphorus levels

由圖1可知，LP和NP處理下，各煙草基因型的營養(yǎng)液pH值隨著處理時(shí)間的延長均呈降低趨勢(shì)。各煙草基因型的pH值變化存在差異，調(diào)整pH值后第1～第5天，LP處理下G28、中煙101、云煙105和K326的pH值由6.00分別下降至3.90、3.81、3.54和3.11，NP處理下pH值由6.00分別下降至4.21、4.18、4.15和3.88，L/N則由1.00分別下降至0.93、0.91、0.85和0.80。LP和NP處理下各品種pH值變化整體均表現(xiàn)為K326>云煙105>中煙101>G28，說明磷高效品種降低根際pH值的能力明顯高于磷低效品種。

表4 不同供磷條件下各煙草基因型根系活力Table 4 Root activities in tobacco varieties at seedling stage under different phosphorus levels

2.5 不同磷效率煙草抗逆生理指標(biāo)的差異

由表5可知，LP處理下，4個(gè)煙草品種的可溶性糖、游離脯氨酸及MDA含量均顯著高于NP，而可溶性蛋白則顯著低于NP。低磷水平下，各煙草基因型可溶性蛋白含量降幅依次為云煙105(35.31%)中煙101(54.32%)>云煙105(22.82%)>K326(22.46%)，游離脯氨酸含量增幅依次為云煙105(65.75%)>K326(64.37%)>中煙101(27.62%)>G28(19.77%)，可溶性糖含量增幅依次為K326(61.42%)>云煙105(46.36%)>G28(31.96%)>中煙101(27.08%)。LP和NP處理下，可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸含量均以磷高效基因型(K326和云煙105)較大，磷低效基因型(G28和中煙101)較小，上述3個(gè)指標(biāo)的L/N值亦是如此。各基因型煙草MDA含量在NP處理下依次表現(xiàn)為中煙101>云煙105>G28>K326，但無顯著差異，而在LP處理下磷低效基因型品種則顯著高于磷高效基因型品種。

表5 不同供磷條件下各煙草基因型苗期主要生理指標(biāo)Table 5 Main physiological indexes in tobacco varieties at seedling stage under different phosphorus levels

3 討論

作物在生長前期對(duì)磷素缺乏十分敏感，當(dāng)磷素供給量處于低水平時(shí)，植物體內(nèi)碳水化合物的合成就會(huì)受影響，細(xì)胞分裂受阻，進(jìn)而導(dǎo)致植株生長緩慢[16]。本研究中，LP處理下各煙草基因型生長均受到明顯影響，其株高、莖粗、地上部干重、根干重、根體積、最大葉面積及葉片SPAD值均低于NP水平，各煙草基因型的不同指標(biāo)(除K326、云煙105的莖粗外)在2種磷素水平下的差異均達(dá)顯著水平；不同磷效率煙草基因型對(duì)磷脅迫的響應(yīng)不同，磷高效品種(K326和云煙105)的減小幅度明顯低于磷低效品種(G28和中煙101)，表明磷高效品種在磷濃度較低的情況下仍能保持較高的生物量，維持正常生長。Vejchasarn等[21]研究表明，植物在低磷逆境中通過改變根系形態(tài)來提高磷素吸收效率。這與本研究結(jié)果相同。本研究中，在LP處理下，云煙105、K326、中煙101和G28主根分別增長33.56%、25.25%、21.90%、5.14%，擴(kuò)大了根系活動(dòng)范圍，增加了根系與磷素的接觸面積，促進(jìn)了植物吸收利用更多磷素，保證了植物正常生長[22]。LP條件下，不同基因型煙草的根系指標(biāo)存在明顯差異，其中K326主根長、根體積及根干重的L/N值分別為1.25、0.79、0.79，云煙105為1.34、0.78、0.73，G28為1.05、0.73、0.35，中煙101為1.22、0.74、0.37。說明磷高效品種根系指標(biāo)的L/N值較高，受低磷的影響明顯更小，根系適應(yīng)性優(yōu)于磷低效品種。這與前人[23-24]的研究結(jié)果相同。

低磷不僅使植物的根系形態(tài)產(chǎn)生適應(yīng)性變化，還會(huì)引起植物根系甚至全株發(fā)生一系列生理變化[25]。植物根系通過分泌有機(jī)酸，選擇性吸收陰陽離子等方式酸化根際，以降低根際pH值，活化更多難溶性磷并產(chǎn)生更多有機(jī)磷水解酶[26]。本研究中，G28培養(yǎng)液pH值由6.00下降至3.90，中煙101降至3.81，云煙105降至3.54，K326降至3.11，低磷降低了各煙草基因型的培養(yǎng)液pH值，且隨著脅迫時(shí)間的延長，pH值降低幅度。此外本研究還發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液的pH值降幅因品種而異，磷高效品種的pH值變化幅度更大，更能酸化根際來促進(jìn)磷素的吸收，適應(yīng)低磷逆境。這與前人在油菜[27]、小麥[28]等作物上的研究結(jié)果類似。說明在一定范圍內(nèi)，低磷處理時(shí)間越長，植物根際pH值越低[28]。根系活力是根系功能的主要衡量指標(biāo)之一，可在一定程度上反映植物對(duì)水分和礦物質(zhì)的代謝能力。研究發(fā)現(xiàn)植物處于逆境中會(huì)降低根系活力[29]。這與本研究結(jié)果相同。本研究表明，不同磷效率煙草根系活力的降低程度不同，降幅較大的為G28(73.00%)、中煙101(63.77%)，較小的為云煙105(36.74%)、K326(25.26%)，說明磷低效品種的根系生理活性受到的影響更明顯，而磷高效品種在低磷脅迫下表現(xiàn)出較強(qiáng)的新陳代謝能力。

ACP是植物生長過程中一種重要的水解酶，能夠促進(jìn)有機(jī)磷的水解，提高磷素的生物有效性[30]。研究表明，植物在缺磷條件下體內(nèi)的ACP活性會(huì)顯著增強(qiáng)[30-32]。這與本研究結(jié)果相同。本研究中，各煙草基因型的ACP活性均呈增加趨勢(shì)，說明ACP活性增強(qiáng)是植物對(duì)低磷脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)。張海偉等[33]研究認(rèn)為，植物磷效率與ACP活性呈正相關(guān)，在本試驗(yàn)中也得到相似結(jié)論。LP條件下，根系A(chǔ)CP活性的提高量以K326和云煙105為較大，分別為47.94%、25.85%，中煙101和G28為較小，分別為15.67%、9.52%，葉片也以K326(49.02%)、云煙105(26.67%)為較大，中煙101(8.79%)、G28(8.77%)為較小，具有較高磷效率的煙草基因型不同部位的ACP活性增強(qiáng)效果明顯大于磷低效型，說明磷效率越高，植物體內(nèi)的ACP活性也越高。但也有學(xué)者[34]認(rèn)為，ACP僅是植物對(duì)低磷脅迫的誘導(dǎo)物，而與磷效率無關(guān)，具體原因還有待進(jìn)一步研究。

當(dāng)植物處于低磷脅迫時(shí)體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量超氧自由基，致使活性氧代謝失衡，從而對(duì)植物細(xì)胞造成一定的氧化傷害。為了維持正常的生理狀態(tài)，植株體內(nèi)的保護(hù)酶(SOD、POD、CAT等)活性會(huì)增強(qiáng)，共同作用清除H2O2和自由基[35]。本研究中，低磷脅迫促使各基因型煙草的SOD、POD、CAT活性均顯著增強(qiáng)，這與前人在小麥[35]上的研究結(jié)果一致。低磷水平下，不同處理的煙草3種保護(hù)酶活性均表現(xiàn)為磷高效品種高于磷低效品種。這與敖雪等[36]發(fā)現(xiàn)磷高效基因型大豆CAT、POD及SOD 3種保護(hù)酶活性在整個(gè)生育期均保持在較高水平的結(jié)論相一致。說明磷高效品種的細(xì)胞保護(hù)能力更強(qiáng)，能通過增強(qiáng)保護(hù)酶活性來保證細(xì)胞膜的完整性，維持細(xì)胞內(nèi)外的氧化還原平衡，使植物在低磷逆境中能進(jìn)行正常代謝生長[37]。

植物在逆境條件中會(huì)迅速累積大量游離脯氨酸、可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來維持細(xì)胞滲透勢(shì)，起到保護(hù)細(xì)胞的作用[38]。本研究中，LP條件下各煙草品種的游離脯氨酸和可溶性糖含量均顯著升高，而可溶性蛋白含量顯著降低，游離脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量在低磷時(shí)表現(xiàn)為磷高效型(K326、云煙105)較高，磷低效型(中煙101、G28)較低。這與李俊等[39]的研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)在LP水平下，云煙105(22.82%)及K326(22.46%)的MDA含量增幅均顯著低于G28(62.50%)及中煙101(54.32%)，磷高效基因型煙草的MDA含量明顯低于磷低效型，這與前人在水稻[40]、玉米[41]等作物的研究結(jié)果相一致。MDA是膜質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，其含量能反映膜質(zhì)過氧化作用水平[42]，磷高效型煙草在LP條件下MDA含量更低，說明膜質(zhì)過氧化程度更輕，受到的傷害更小，對(duì)低磷脅迫的抗性高于磷低效型。

4 結(jié)論

與磷低效基因型(G28、中煙101)相比，磷高效基因型(K326、云煙105)在低磷時(shí)能夠迅速做出一系列抗逆反應(yīng)，通過增大主根長和根體積，增強(qiáng)根系活力，提高ACP活性，分泌更多酸性物質(zhì)，更大程度地增強(qiáng)細(xì)胞保護(hù)酶系統(tǒng)(CAT、SOD和POD)活性以及積累更多細(xì)胞滲透物質(zhì)，從而減輕低磷脅迫帶來的危害和維持較高磷效率。鑒于時(shí)間因素，本試驗(yàn)未測(cè)定煙草的磷素吸收、利用效率以進(jìn)行ACP活性與磷效率的相關(guān)性分析，故后續(xù)可將不同基因型煙草的磷效率與ACP活性差異之間的關(guān)系作為研究方向。本試驗(yàn)為苗期試驗(yàn)，與大田情況可能有所不同，因此仍需大田試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。