尹明華 葉思雨 寧本松 張銘心 石光禹

(上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西 上饒 334001)

DNA甲基化是植物生長發(fā)育、形態(tài)建成、逆境脅迫等過程中一種常見的表觀遺傳現(xiàn)象，有利于植物維持正常的生長發(fā)育，是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀遺傳修飾方式之一，高等植物基因組中DNA甲基化水平約為20%～50%[1]。1990年，Holliday[2]指出表觀遺傳是生物在不改變基因組序列的前提下通過DNA和組蛋白調(diào)控基因表達(dá)的現(xiàn)象。研究表明，DNA甲基化可降低植物體內(nèi)一些基因的活性，而去甲基化則誘導(dǎo)這些基因的重新激活和表達(dá)，且基因表達(dá)活性與DNA胞嘧啶甲基化程度呈負(fù)相關(guān)[3]。

懷玉山高山馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)，又稱麻籽洋芋，主要種植在懷玉山玉峰村、洋塘村、金坪村、隴首村、關(guān)口村等地，營養(yǎng)價值較高，且淀粉和脂肪含量低，無還原糖，具有健脾利濕、降糖降脂等功能。2013年4月，懷玉山高山馬鈴薯正式被核準(zhǔn)為國家地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品[4]。馬鈴薯一般以地下塊莖進行無性繁殖，容易積累病毒，導(dǎo)致其種性退化、品質(zhì)和產(chǎn)量下降[4]。因此，懷玉山高山馬鈴薯脫毒處理對其規(guī)?；N植具有重要意義。利用莖尖脫毒快繁是目前解決馬鈴薯種薯退化最直接有效的方法，但其取材困難(0.2～0.3 mm)且不易成活[5]。超低溫療法脫毒具有成本低、周期短、脫毒率較高等優(yōu)勢[6]。研究表明，與常規(guī)莖尖培養(yǎng)脫毒技術(shù)相比，超低溫療法脫毒率可提高23%～100%，平均脫毒率可提高53%[7]。如王子成等[8]利用超低溫療法成功脫除馬鈴薯S病毒和馬鈴薯Y病毒(potato virus Y，PVY)，二者脫毒率分別為47%和83%，顯著高于常規(guī)莖尖培養(yǎng)脫毒法。王彪[9]研究也表明，玻璃化超低溫療法可有效脫除馬鈴薯卷葉病毒(potato leaf roll virus，PLRV)和Y病毒，脫毒率達(dá)80%。但目前對常規(guī)莖尖培養(yǎng)脫毒和超低溫療法脫毒的研究主要集中于脫毒程序建立、病毒檢測、遺傳穩(wěn)定性分析等方面[10-11]，而有關(guān)常規(guī)莖尖培養(yǎng)脫毒和超低溫療法脫毒后再生植株的DNA甲基化水平和模式的變化研究尚未見報道。病毒是一種生物脅迫，用常規(guī)莖尖培養(yǎng)和超低溫療法脫除病毒實際上是一種解除生物脅迫的過程[12]。Kovalchuk等[12]研究表明，植物感染病毒導(dǎo)致的甲基化整體水平上升有利于病毒攻擊時植物基因組的穩(wěn)定。但常規(guī)莖尖培養(yǎng)脫毒和超低溫療法脫毒后，再生脫毒苗的基因組DNA甲基化的變化尚不明確。目前DNA甲基化水平和模式的分析一般采用甲基化敏感擴增多態(tài)性(methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP)技術(shù)[13]。MSAP技術(shù)是以擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)為基礎(chǔ)的方法[14]，具有簡單易行、通用性強、無需事先知道被測植株序列信息、可有效監(jiān)測DNA甲基化與基因表達(dá)關(guān)系等優(yōu)點[15-17]。毛細(xì)管電泳具有分辨率較高、準(zhǔn)確、簡便、高效等優(yōu)點。因此本研究以懷玉山高山馬鈴薯常規(guī)莖尖培養(yǎng)脫毒苗和超低溫療法脫毒苗為研究對象，采用MSAP結(jié)合毛細(xì)管自動電泳儀對其基因組DNA甲基化水平和甲基化模式進行分析，以期為懷玉山高山馬鈴薯常規(guī)莖尖培養(yǎng)脫毒和超低溫療法脫毒的表觀遺傳研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

懷玉山高山馬鈴薯常溫繼代帶毒苗(編號：1～2，對照組CK)；懷玉山高山馬鈴薯玻璃化法超低溫保存帶毒苗(編號：3～4，處理組1)；懷玉山高山馬鈴薯玻璃化法超低溫療法脫毒苗(編號：5～7，處理組2)；懷玉山高山馬鈴薯常規(guī)莖尖培養(yǎng)脫毒苗(編號：8～10，處理組3)，均由上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院植物組織培養(yǎng)室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 采取改良的CTAB法[17]提取DNA。

1.2.2 基因組DNA雙酶切 采用HpaⅡ和MspⅠ同裂酶(識別四堿基)分別與核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ(識別六堿基)組合對樣本DNA進行雙酶切。第一個DNA酶切反應(yīng)體系為20 μL，包括400 ng樣本DNA、2 μL 10×Buffer4 [50 mmol·L-1KAc、20 mmol·L-1Tris-acetate、10 mmol·L-1MgAc2、和1 mmol·L-1dTT(pH值7.9，25℃)]、0.8 μLEcoRⅠ內(nèi)切酶、0.8 μLHpaⅡ內(nèi)切酶，37℃保溫過夜。第二個DNA酶切反應(yīng)體系為20 μL，包括400 ng樣本DNA、2 μL 10×Buffer1[包含10 mmol·L-1Tris-HCl、10 mmol·L-1MgCl2和1 mmol·L-1dTT(pH值7.0，25℃)]、0.8 μLEcoRⅠ內(nèi)切酶、0.8 μLMspⅠ內(nèi)切酶，37℃保溫過夜。

1.2.3 酶連接反應(yīng) 人工設(shè)計的與EcoRⅠ和HpaⅡ/MspⅠ酶切位點互補的人工接頭加于酶切片段的兩端(表1)。接頭連接體系總體積為20 μL，包括2 μL Buffer(10×T4)、0.4 μLEcoRⅠ(20 μmol·L-1)和HpaⅡ/MspⅠ接頭，用ddH2O補足至20 μL，16℃保溫過夜。

1.2.4 接頭連接后預(yù)擴增 預(yù)擴增反應(yīng)體系為20 μL，包括0.4 μL dNTPs(10 mmol·L-1)、2 μL Buffer(10×)、0.2 μLTaq酶(5 U·μL-1)、0.5 μL E00-primer(10 μmol·L-1)、0.5 μL M00-primer(10 μmol·L-1)，ddH2O補足至20 μL。PCR預(yù)擴增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性30 s；56℃變性1 min，72℃退火1 min，72℃延伸10 min，26個循環(huán)。預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋20倍，備用。

1.2.5 選擇性擴增 擴增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性30 s；65～56℃變性30 s；72℃延伸1 min；13個循環(huán)，進行降式PCR擴增(退火溫度每個循環(huán)降0.7℃)；94℃預(yù)變性30 s；56℃退火30 s，72℃延伸1 min；23 個循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.6 毛細(xì)管電泳試驗 將甲酰胺與分子量內(nèi)標(biāo)按照 1∶100 體積比混勻，上樣板加混合物9 μL，再加入1 μL PCR產(chǎn)物(稀釋10倍)。然后采用3730XL測序儀(Applied Biosystems，美國)進行毛細(xì)管電泳。電泳結(jié)束后，對30個樣品、10對引物組合擴增產(chǎn)物通過測序儀得到的原始數(shù)據(jù)進行分析(GeneMarker 2.2 軟件)，比較分析各泳道內(nèi)分子量內(nèi)標(biāo)的位置與各樣品峰值的位置，得到片段大小。再根據(jù)無帶和有帶情況轉(zhuǎn)化為0/1數(shù)據(jù)矩陣。最后參照參考文獻[18-19]對其進行甲基化率和甲基化模式比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示樣本所提取基因組DNA主帶清晰，無降解現(xiàn)象(圖1)，符合本試驗對DNA的要求。

2.2 預(yù)擴增結(jié)果

預(yù)擴增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果表明預(yù)擴產(chǎn)物均勻彌散，且連續(xù)成片(圖2)，符合MSAP選擴模板的要求。

圖2 預(yù)擴增電泳檢測結(jié)果Fig.2 Preamplification electrophoretic detection results

2.3 基因組DNA甲基化水平分析

本試驗采用10對選擇性擴增引物組合(E32MSP40、E32MSP48、E35MSP48、E36MSP43、E37MSP48、E39MSP44、E40MSP44、E50MSP43、E78MSP40、E86MSP48)對雙酶切后的10個樣本進行擴增，其中對樣本1的擴增見圖3。由表2可知，懷玉山高山馬鈴薯常溫繼代帶毒苗總甲基化率為62.63%，全甲基化率為46.96%，半甲基化率為19.96%；懷玉山高山馬鈴薯玻璃化法超低溫保存帶毒苗總甲基化率為65.33%，全甲基化率為46.36%，半甲基化率為18.97%；懷玉山高山馬鈴薯常規(guī)莖尖脫毒苗總甲基化率為63.13%，全甲基化率為45.62%，半甲基化率為17.50%；懷玉山高山馬鈴薯玻璃化法超低溫療法脫毒苗總甲基化率為58.75%，全甲基化率為40.54%，半甲基化率為18.21%。上述結(jié)果表明，懷玉山高山馬鈴薯常溫繼代帶毒苗甲基化水平較高，經(jīng)過玻璃化法超低溫保存處理雖未能脫毒但其甲基化水平有所下降，但甲基化仍處于較高水平，常規(guī)莖尖培養(yǎng)脫毒和玻璃化法超低溫療法脫毒可明顯降低試管苗的甲基化水平，且玻璃化法超低溫療法脫毒苗的甲基化水平更低。

2.4 基因組DNA甲基化模式分析

與懷玉山高山馬鈴薯常溫繼代帶毒苗(CK)相比，懷玉山高山馬鈴薯玻璃化法超低溫保存帶毒苗去甲基化模式的比例為31.43%，甲基化模式的比例為29.29%(表3)；與CK相比，懷玉山高山馬鈴薯常規(guī)莖尖培養(yǎng)脫毒苗去甲基化模式的比例為29.30%，甲基化模式的比例為26.76%(表4)；與CK相比，懷玉山高山馬鈴薯玻璃化法超低溫療法脫毒苗去甲基化模式的比例為34.75%，甲基化模式的比例為23.03%(表5)。上述結(jié)果表明，在超低溫保存(未能脫毒)、莖尖常規(guī)培養(yǎng)脫毒和超低溫療法脫毒3個處理中，去甲基化模式和甲基化模式并存，但均以去甲基化模式為主要趨勢，且超低溫療法脫毒去甲基化模式最強，其次是莖尖常規(guī)培養(yǎng)脫毒，最后是玻璃化法超低溫保存處理。

注：每個引物擴增圖左為Hpa Ⅱ，右為MspⅠ。Note: The left of amplification of each primer is Hpa Ⅱ, and the right is Msp Ⅰ.圖3 不同引物組合對樣本1的MSAP擴增產(chǎn)物檢測Fig.3 MSAP amplification product test of sample 1 besed on different primer combinations

3 討論

植物的病毒侵染本質(zhì)上一種生物脅迫[20]。Kovalchuk等[12]研究表明，病毒侵染會使植物體內(nèi)的甲基化水平大幅度提高，并顯示出表觀遺傳現(xiàn)象； Boyko等[21]認(rèn)為基因組超甲基化是植物適應(yīng)病毒侵染的一種應(yīng)答機制。脫毒即接觸這種生物脅迫。常規(guī)莖尖培養(yǎng)脫毒法是采用植物組織培養(yǎng)的方法切取0.2～0.3 mm 莖尖進行培養(yǎng)，其原理是由于莖尖較小，維管束尚未形成，而病毒可通過維管束傳播，因此常規(guī)莖尖培養(yǎng)可以脫毒[22]；超低溫療法脫毒法是用超低溫保存技術(shù)保存約1 cm的莖尖，莖尖切取較為容易，但在超低溫保存的過程中，莖尖外圍細(xì)胞含有維管束同時也含有病毒，且由于脫水困難，在超低溫保存后不能成活，而莖尖內(nèi)部細(xì)胞無維管束不含病毒且易脫水，在超低溫保存后能成活，其再生苗有可能實現(xiàn)脫毒[6]。常規(guī)莖尖培養(yǎng)脫毒法僅通過莖尖的簡單培養(yǎng)來實現(xiàn)脫毒，無其他脅迫，而超低溫療法脫毒法是通過超低溫保存來實現(xiàn)脫毒，存在超低溫脅迫和滲透脅迫，過程較為復(fù)雜。因此，常規(guī)莖尖培養(yǎng)脫毒苗和超低溫療法脫毒苗的DNA甲基化水平和模式存在差異。

表2 懷玉山高山馬鈴薯試管苗基因組DNA甲基化水平分析
Table 2 Analysis of genomic DNA methylation level in plantlets of alpine potato in Huaiyushan

模式PatternsHap ⅡMsp Ⅰ帶型Band types條帶數(shù)及比例Number of bands and percentage常溫繼代帶毒苗Plantlets with viruses subcultured at room temperature超低溫保存帶毒苗Plantlets with viruses after cryopreservation常規(guī)莖尖脫毒苗Virus-free plantlets regenerated from routine culture of shoot-tips超低溫療法脫毒苗Virus-free plantlets by cryotherapy00Ⅳ(超甲基化)Ⅳ(Hpermethylation)158116 121 10701Ⅲ(全甲基化)Ⅲ(Full-methylation)89126 124 12010Ⅱ(半甲基化)Ⅱ(Hemi-methylation)10599 94 10211Ⅰ(非甲基化)Ⅰ(Un-methylation)174181 198 231總擴增帶數(shù)Total amplified band number368406416 453甲基化總帶數(shù)Total methylation band num-ber352341 339 329總甲基化率Total methylationd rate/%62.6365.3363.1358.75全甲基化帶數(shù)Full-methylation band num-ber247242 245 227全甲基化率Full-methylation rate/%46.9646.3645.6240.54半甲基化帶數(shù)Hemi-methylationband num-ber10599 94 102半甲基化率Hemi-methylation rate/%19.9618.9717.5018.21

注：總甲基化率=[(Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)]×100%；全甲基化率=[(Ⅲ+Ⅳ)/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)]×100%；半甲基化率=[Ⅱ/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)]×100%。

Note: Total methylation rate=[(Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)]×100%. Full-methylation rate=[(Ⅲ+Ⅳ)/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)]×100%. Hemi-methylation rate=[Ⅱ/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)]×100%.

前人對馬鈴薯[23-24]和留蘭香[25]超低溫保存后的DNA甲基化遺傳變異進行了研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)超低溫保存后馬鈴薯和留蘭香均發(fā)生了去甲基化和甲基化，但以去甲基化變化為主，全基因組DNA胞嘧啶甲基化水平降低。何艷霞等[26]在對擬南芥幼苗的超低溫保存研究中也發(fā)現(xiàn)了去甲基化現(xiàn)象。張成婉[27]在對歐李莖尖的研究中發(fā)現(xiàn)超低溫保存后，其甲基化模式存在累加效應(yīng)，且甲基化模式可通過無性繁殖傳給后代。郝玉金[28]研究表明，超低溫保存能夠誘導(dǎo)柑桔DNA甲基化變化，使DNA甲基化程度降低，說明脫甲基化可能與愈傷組織分化能力增強相關(guān)；朱文濤[29]實現(xiàn)了五葉草莓和全明星草莓的超低溫療法脫毒，但發(fā)現(xiàn)五葉草莓脫毒苗和全明星草莓脫毒苗基因組DNA均出現(xiàn)甲基化水平降低的現(xiàn)象。曲先[30]采用超低溫療法脫除了馬鈴薯病毒，但馬鈴薯脫毒苗的MSAP檢測發(fā)現(xiàn)13個位點發(fā)生了甲基化增加，21個位點發(fā)生了去甲基化。

本研究中，超低溫保存和脫毒處理均可使懷玉山高山馬鈴薯試管苗甲基化水平下降，且超低溫療法脫毒苗甲基化水平最低；超低溫保存和脫毒處理均可使去甲基化模式和甲基化模式并存，其中去甲基化模式占優(yōu)勢，且超低溫療法脫毒去甲基化模式最強。原因可能是莖尖常規(guī)培養(yǎng)脫毒解除了病毒造成的生物脅迫，導(dǎo)致DNA甲基化水平降低；超低溫保存(未脫毒)對材料進行逆境脅迫，同樣產(chǎn)生DNA甲基化水平降低的現(xiàn)象，這與前人研究結(jié)果類似，這種變化趨勢可能是植物對超低溫保存這種逆境處理的一種遺傳適應(yīng)，但其內(nèi)在機制尚不明確。但擬南芥上的研究發(fā)現(xiàn)，超低溫保存能夠影響基因的差異表達(dá)[31]；超低溫療法脫毒既解除了病毒造成的生物脅迫，又施加了超低溫保存這種逆境脅迫，導(dǎo)致DNA甲基化水平顯著下降。前人對模式植物擬南芥的研究表明，超低溫保存后擬南芥會發(fā)生一定的甲基化變化，引起性狀的改變[32]，且這些發(fā)生變化的條帶大部分可通過有性生殖傳遞給下一代[26]。

表3 懷玉山高山馬鈴薯玻璃化法超低溫保存帶毒苗基因組DNA甲基化模式分析Table 3 Analysis of genomic DNA methylation patterns in plantlets with viruses after cryopreservation of alpine potato in Huaiyushan

表4 懷玉山高山馬鈴薯常規(guī)莖尖培養(yǎng)脫毒苗基因組DNA甲基化模式分析Table 4 Analysis of genomic DNA methylation patterns in virus-free plantlets regenerated from routine culture of shoot-tips of alpine potato in Huaiyushan

表5 懷玉山高山馬鈴薯玻璃化法超低溫療法脫毒苗基因組DNA甲基化模式分析Table 5 Analysis of genomic DNA methylation patterns in virus-free plantlets by cryotherapy of alpine potato in Huaiyushan

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，懷玉山高山馬鈴薯經(jīng)過玻璃化法超低溫保存處理、常規(guī)莖尖培養(yǎng)脫毒和玻璃化法超低溫療法脫毒均可明顯降低試管苗的甲基化水平，且玻璃化法超低溫療法脫毒苗的甲基化水平最低；不同處理去甲基化模式和甲基化模式并存，且均以去甲基化模式為主要趨勢，去甲基化模式強弱依次為超低溫療法脫毒>莖尖常規(guī)培養(yǎng)脫毒>超低溫保存(未脫毒)。但本試驗只研究了玻璃化法超低溫保存和玻璃化法超低溫療法脫毒的甲基化水平和模式的變化，下一步的研究重點將對其他超低溫保存和超低溫療法脫毒的甲基化水平和模式進行系統(tǒng)研究，以獲得對超低溫保存和超低溫療法脫毒甲基化水平和模式的全面認(rèn)識。本研究利用MSAP 分析高山馬鈴薯脫毒苗甲基化模式的變化，明確了甲基化與脫毒的關(guān)系，為進一步篩選鑒定甲基化調(diào)控的脫毒相關(guān)基因，闡明脫毒恢復(fù)種性機理奠定了一定的理論基礎(chǔ)。