王思靜， 張 華， 馬學(xué)寬， 邢 科， 徐亦男， 安冬青,2

(1新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院； 2新疆名醫(yī)名方特色方劑實(shí)驗(yàn)室， 烏魯木齊 830011)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是指以動(dòng)脈內(nèi)膜有脂質(zhì)等血液成分的沉積、平滑肌細(xì)胞增生和膠原纖維增多,形成粥糜樣含脂壞死病灶和血管壁硬化為主要表現(xiàn)的一種疾病，是心血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，由動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的心血管疾病已經(jīng)成為全球死亡的首要原因。國內(nèi)外研究顯示，我國的心血管病現(xiàn)患人數(shù)約3億,其中2.7億人患有高血壓，冠心病人數(shù)約1 100萬,心血管病死亡率居首位，高于腫瘤和其他疾病[1]。因此有效防治AS能夠降低心血管疾病的發(fā)病率和死亡率。目前，對于AS的治療主要以降脂、降血小板等方法，代表藥物以他汀類為主。天香丹顆粒為新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院的院內(nèi)制劑，前期研究表明，該藥能有效緩解冠心病心絞痛發(fā)作,調(diào)節(jié)血脂水平，抗血栓形成，保護(hù)心肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)治療性血管新生等[2-4]。天香丹顆粒由中藥新塔花、丹參、紅景天、降香配伍而成，新塔花具有抗炎鎮(zhèn)痛、降壓等功效[5-7]，丹參具有益氣活血、抗氧化、保護(hù)心血管、改善心肌纖維功能[8-9]，紅景天具有抗氧化、保護(hù)心血管、改善心肌缺血、增強(qiáng)免疫力等功效[10-11]，降香主要用于外傷出血、心血管病等[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合前期研究基礎(chǔ)[13]，采用ApoE-/-小鼠建立AS動(dòng)物模型，探究天香丹顆粒緩解AS病理變化過程，為天香丹有效治療AS提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物30只健康雄性ApoE-/-小鼠，10只同品系C57小鼠，8周齡，體質(zhì)量(19±1)g，購于北京維通利華公司，許可證號:SCXK(京)2016-0011。飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，倫理審核編號:20171129-02。

1.2 儀器AB124型精密電子天平(上海海康電子儀器廠)，PM401型石蠟熔蠟箱(德國Leica公司)，5235型組織包埋機(jī)(日本SAKURA公司)，LKB-V型切片機(jī)(德國Leica公司);，5424R型低溫高速離心機(jī)(德國Eppendrof公司)，DM2500型光學(xué)顯微鏡(德國Leica公司)，Type1500型多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)。

1.3 試藥天香丹顆粒(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑,新藥制字：ZO400082)，阿托伐他汀(北京索萊寶科技有限公司，批號:20151223)，HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號:G1120)，膽固醇(北京索萊寶科技有限公司，批號:C8280)，丙硫氧基嘧啶(北京索萊寶科技有限公司，批號:YZ-100803)，小鼠IL-6 ELISA試劑盒(Thermo公司，批號:M0044C)，小鼠IL-10 ELISA試劑盒(美國Thermo公司，批號:R0016C)。

1.4 模型的建立將40只小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)，連續(xù)灌胃12 w，建立動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型，所有小鼠不限飲食飲水，活動(dòng)自由。高脂飼料配方：基礎(chǔ)飼料82.68%，豬油10.00%，豬膽鹽0.20%，膽固醇2.00%，蔗糖5.00%，丙硫氧基嘧啶0.12%，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.5 動(dòng)物分組及給藥40只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，將30只ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為模型組(0.4 mL/10 g,蒸餾水)、他汀組(3 mg·kg-1·d-1,阿托伐他汀)、天香丹組(2.7 g·kg-1·d-1,天香丹顆粒)，C57小鼠為空白組(0.4 mL/10 g,蒸餾水)，每組10只，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃12周，每周記錄小鼠體質(zhì)量變化，并調(diào)整用藥量。

1.6 標(biāo)本采集各組小鼠灌胃第12周末，禁食不禁水12 h，麻醉后眼球取血，置于1.5 mL EP管中，7 500 r/min離心15 min，取血清置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?；在無菌條件剖開小鼠胸腹腔，取主動(dòng)脈根部至髂腎動(dòng)脈分支處動(dòng)脈組織，主動(dòng)脈用10%甲醛固定，用于HE染色。

1.7 指標(biāo)的檢測

1.7.1 HE染色和斑塊面積分析 將固定24 h以上的主動(dòng)脈，依次經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后，進(jìn)行5 μm厚度切片，取5張效果較好的切片；HE染色后在光鏡下觀察主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化，計(jì)算主動(dòng)脈斑塊面積(PA)和管腔面積(LA)比值。

1.7.2 檢測血清IL-6和IL-10表達(dá)水平 采用ELISA法檢測，按照上海酶聯(lián)生物ELISA試劑盒說明書嚴(yán)格操作，設(shè)置標(biāo)曲。用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定各孔吸光度值(OD值)，以濃度值為橫坐標(biāo)(X),各標(biāo)準(zhǔn)OD值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出小鼠血清中IL-6和IL-10最終水平。

2 結(jié)果

2.1 小鼠主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)變化小鼠主動(dòng)脈HE染色結(jié)果顯示,空白組管壁幾乎無脂質(zhì)沉積，管腔無明顯狹窄(圖1A); 模型組內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞排序紊亂,出現(xiàn)大量脂質(zhì)沉積和炎癥細(xì)胞浸潤，管腔狹窄，內(nèi)壁破損，且有斑塊形成(圖1B); 他汀組斑塊面積小于模型組，管腔狹窄不明顯，未見斑塊脫落與破裂(圖1C); 天香丹組動(dòng)脈粥樣斑塊面積小于模型組，大于空白組，有脂質(zhì)浸潤，管腔局部狹窄(圖1D)。

A: 空白組

B:模型組

C:他汀組

D:天香丹組

圖1 各組小鼠胸主動(dòng)脈病理變化情況(HE ×200倍)

2.2 小鼠主動(dòng)脈斑塊面積/管腔面積比值(PA/LA)與空白對照組比較，模型組主動(dòng)脈PA/LA比值增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01); 與模型組比較，天香丹組、他汀組主動(dòng)脈PA/LA比值減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01); 與他汀組比較，天香丹組主動(dòng)脈PA/LA比值增大，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 各組小鼠主動(dòng)脈斑塊面積比較/%

注:與空白組比較,*P<0.01; 與模型組比較,#P<0.01; 與他汀組比較,△P>0.05。

2.3 小鼠血清IL-6和IL-10水平的比較與空白組比較，模型組小鼠血清中IL-6表達(dá)水平升高，IL-10表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01); 與模型組比較，他汀組、天香丹組小鼠血清中IL-6表達(dá)水平降低，IL-10表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01); 與他汀組比較，天香丹組小鼠血清中IL-6表達(dá)水平降低，IL-10表達(dá)水平升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2。

表2 小鼠血清IL-6和IL-10表達(dá)水平/(pg/mL)

注:與空白組比較,*P<0.01;與模型組比較,#P<0.01; 與他汀組比較,△P>0.05。

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化作為心腦血管疾病主要病理基礎(chǔ)，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究證實(shí)，AS的發(fā)生發(fā)展均有炎癥反應(yīng)的參與。IL-6是AS形成的一個(gè)重要炎性反應(yīng)因子，參與AS的形成和發(fā)展，由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-10是一種重要的抑炎細(xì)胞因子，具有下調(diào)催化因子和炎性反應(yīng)的作用，在限制血管壁炎性反應(yīng)中具有積極作用，屬于比較典型的抑炎因子。大量研究表明[14-16]，以冠心病為典型的心血管病患者機(jī)體內(nèi)的促炎和抑炎因子平衡失調(diào)可能是AS發(fā)生發(fā)展的核心，因此如何進(jìn)一步提升患者自身的抗炎能力很可能是治療AS，防治心腦血管疾病新的靶向治療點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，天香丹顆粒能夠有效緩解AS病理變化過程，減少AS斑塊面積，下調(diào)炎癥因子IL-6水平，上調(diào)抑炎因子IL-10的表達(dá)水平，抑制炎癥反應(yīng)，改善主動(dòng)脈內(nèi)皮功能，從而起到抗AS的作用。