許穎捷， 邵 博， 曾雪敏， 尹小朋， 王 冰， 宋志強(qiáng)， 龔忠誠

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院/附屬口腔醫(yī)(學(xué))院頜面腫瘤外科， 2新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學(xué)研究所， 烏魯木齊 830054)

髁突軟骨部分缺損或退行性病變常由顳頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病、腫瘤、創(chuàng)傷等多種病因侵及軟骨層面而導(dǎo)致發(fā)生。軟骨自身因匱乏神經(jīng)血管致使其恢復(fù)力受限，當(dāng)其因任何原因損傷后，調(diào)動機(jī)體進(jìn)行自身修復(fù)后結(jié)果不容考量。在臨床上，目前用于顳下頜關(guān)節(jié)軟骨缺損的治療方案主要有三種[1]，一是關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射促軟骨修復(fù)藥物和潤滑補(bǔ)償物質(zhì)，二是外科手術(shù)進(jìn)行自體軟骨移植，三是人工髁突置換手術(shù)。雖然以上方法均有一定療效，但同時也存在一些局限性和缺點(diǎn)。近年來，隨著組織工程軟骨技術(shù)的出現(xiàn)為軟骨缺損的修復(fù)帶來了新的契機(jī)。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)，取材步驟簡單易行，量大且創(chuàng)傷小等特點(diǎn)是軟骨組織工程種子細(xì)胞來源的絕對優(yōu)勢，脂肪干細(xì)胞可以在體外可以分化成軟骨、骨、肌腱、骨骼肌和脂肪[2-3]，這也使得ADSCs逐漸成為種子細(xì)胞研究焦點(diǎn)。轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)家族是成軟骨細(xì)胞分化的主要調(diào)節(jié)因子。TGF-β主要通過調(diào)節(jié)種子細(xì)胞胞外膠原分子、蛋白多糖水平的表達(dá)，在此基礎(chǔ)的同時降低了蛋白酶的含量。來源于TGF-β超家族的TGF-β3具有增加軟骨外基質(zhì)成分，并且能合成硫酸糖胺聚糖的作用。使用含有TGF-β3目的基因的慢病毒載體內(nèi)源性轉(zhuǎn)染ADSCs,誘導(dǎo)其向軟骨細(xì)胞分化,從而促進(jìn)組織再生。本研究旨在探究體外培養(yǎng)條件下利用含TGF-β3的慢病毒基因載體轉(zhuǎn)染ADSCs，探索最佳轉(zhuǎn)染滴度，觀察轉(zhuǎn)染后的ADSCs的活性和向軟骨細(xì)胞分化潛能。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器胎牛血清(Gibco)；H-DMEM、DMEM/F12培養(yǎng)基、PBS、青霉素/鏈霉素、0.25%胰蛋白酶(Hyclone)；TGF-β3慢病毒載體(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin)購于上海吉凱基因有限公司；細(xì)胞活性檢測(CCK-8)試劑盒(博士德)；Trizol試劑(Invitrogen)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒(Thermo)；二氧化碳恒溫箱(HF240，中國)；熒光倒置顯微鏡(LEICA CTR400，德國)；共聚焦顯微鏡(LASAF_CIP_HWS3LEICA，德國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物新西蘭大耳兔，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，雌雄不限，由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處置嚴(yán)格遵守《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》相關(guān)要求。動物倫理審核項(xiàng)目編號(IACUC20180411-13)。

1.3 兔ADSCs的分離培養(yǎng)常規(guī)分離培養(yǎng)取自雙側(cè)腹股溝部脂肪組織中的ADSCs原代細(xì)胞，按照1∶4傳代擴(kuò)增ADSCs。原代細(xì)胞及傳代細(xì)胞使用倒置顯微鏡每日觀察細(xì)胞生長情況及形態(tài)變化。

1.4 慢病毒轉(zhuǎn)染ADSCs取生長良好的第2代ADSCs，胰酶消化后離心重懸，以1×105/mL細(xì)胞懸液種于3.5 cm培養(yǎng)皿中，ADSCs轉(zhuǎn)染時分為3個組：轉(zhuǎn)染含有綠色熒光蛋白TGF-β3慢病毒的ADSCs作為LV-(TGF-β3)-ADSCs組，轉(zhuǎn)染僅含有綠色熒光蛋白慢病毒空載體的ADSCs作為LV-ADSCs組，未轉(zhuǎn)染慢病毒的細(xì)胞作為空白組。待細(xì)胞貼壁率約達(dá)30%時按感染條件(感染復(fù)數(shù))MOI=50及MOI=100開始進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別在LV-(TGF-β3)-ADSCs組加入無血清DMEM/F12培養(yǎng)液、TGF-β3慢病毒載體及感染增強(qiáng)液；LV-ADSCs組加入無血清DMEM培養(yǎng)液、慢病毒空載體及感染增強(qiáng)液；空白組僅加入無血清DMEM/F12培養(yǎng)液。每瓶加入1 mL液體量，水平小幅震蕩使病毒液與細(xì)胞充分接觸，置于37℃、5% CO2飽和濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后吸出病毒液，加入完全培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)每2天換液1次，96 h后在熒光顯微鏡下觀察。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)及激光共聚焦檢測轉(zhuǎn)染效率在轉(zhuǎn)染96 h后，各組培養(yǎng)皿中細(xì)胞分別經(jīng)由0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，PBS清洗離心2次后重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個/mL，取200uL細(xì)胞懸液，上機(jī)測定增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)表達(dá)效率。各轉(zhuǎn)染組分別使用0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度后按5×103個接種至共聚焦小皿內(nèi)，24 h后拍攝共聚焦檢測轉(zhuǎn)染效率。具體觀察內(nèi)容如下：各組細(xì)胞在共聚焦顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后熒光顯影效果。低倍鏡下取同一個視野，分別在明場及激發(fā)的熒光條件采圖，同時疊加合并后可顯示該視野下所含細(xì)胞負(fù)載并表達(dá)EGFP的占比。

1.6 CCK-8檢測不同滴度慢病毒感染ADSCs細(xì)胞毒性慢病毒感染完成的細(xì)胞消化后按照密度為 2×104/mL，取100 μL細(xì)胞懸液接種于96孔板中。于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)1 d后分別加入 10 μL CCK8試劑孵育3 h。對照組CCK8試劑加入不含細(xì)胞的培養(yǎng)液中。酶標(biāo)儀讀取450 nm處的吸光度，連續(xù)檢測8 d觀察慢病毒對細(xì)胞生長的影響。根據(jù)CCK-8法連續(xù)8 d檢測各組細(xì)胞數(shù)量,由細(xì)胞的生長情況進(jìn)一步評判慢病毒載體對脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的毒性作用,未做任何處理的空白組細(xì)胞作為參照。

1.7 實(shí)時定量PCR分別在誘導(dǎo)分化7、14、21 d，Trizol法提取總RNA，Nanodrop核酸蛋白測定儀檢測總RNA 的濃度與純度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，DEPC水稀釋5倍后進(jìn)行熒光定量。構(gòu)建的20uL反應(yīng)體系如下: 2×SYBR green PCR Master mix 10 μL，Primer ( mix) 1 μL，RNase-Free water 7 μL，cDNA 2 μL。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，在Real-time PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件:95℃ 2 min，95℃ 5 s，62℃ 15 s，共39個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用Livak公式2-ΔΔCt法計(jì)算聚蛋白多糖(AGGRECAN)、Ⅱ型膠原(COL2A1)、性別決定區(qū)Y框蛋白(Sry related HMG box-9, SOX-9)的相對表達(dá)水平。各引物序列見表1。

2 結(jié)果

2.1 兔ADSCs形態(tài)倒置顯微鏡下觀察，接種細(xì)胞后72 h可見少量細(xì)胞已貼壁，隨著培養(yǎng)的時間延長原代細(xì)胞分裂增殖，包漿逐漸向外伸展變形為長梭形(圖1a)，約7～9 d貼壁細(xì)胞數(shù)量可覆蓋培養(yǎng)瓶底面80%之多(圖1b)，呈扁平狀。ADSCs按1∶4傳代第3至5代時，細(xì)胞生長速度較快，約2～3 d貼壁面積可超過90%，生長呈典型的漩渦狀或魚群狀聚集，ADSCs經(jīng)傳代后可純化，形態(tài)多呈長梭形，較為均一。

表1 各引物序列及大小

a: ADSCs P0培養(yǎng)4 d(×100)

b: ADSCs P3培養(yǎng)3 d(×100)

圖1 兔ADSCs干細(xì)胞形態(tài)

2.2 流式細(xì)胞儀及共聚焦檢測轉(zhuǎn)染效率

2.2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率 慢病毒載體含有EGFP基因，其表達(dá)效率即轉(zhuǎn)染效率。使用流式細(xì)胞儀測定EGFP表達(dá)效率結(jié)果顯示：LV-(TGF-β3)-ADSCs組及LV-ADSCs組MOI=50時轉(zhuǎn)染效率分別為82%、90.9%；LV-(TGF-β3)-ADSCs組及LV-ADSCs組MOI=50時轉(zhuǎn)染效率分別為90.5%、93.5%。在ADSCs轉(zhuǎn)染96h時，各轉(zhuǎn)染組組間轉(zhuǎn)染效率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但LV-(TGF-β3)-ADSCs組及LV-ADSCs組的轉(zhuǎn)染效率明顯高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2。

2.2.2 共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果 根據(jù)鏡下觀察熒光激發(fā)后顯像結(jié)果，即可估算轉(zhuǎn)染效率，觀察ADSCs轉(zhuǎn)染96 h后各組細(xì)胞傳代繼續(xù)培養(yǎng)24 h時的轉(zhuǎn)染效率無明顯差異，見圖3。

空白組

LV-(TGF-β3)-ADSCs組(MOI=50)

LV-ADSCs組(MOI=50)

LV-(TGF-β3)-ADSCs組(MOI=100)

LV-ADSCs組(MOI=100)

圖2 流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率

2.3 CCK-8檢測不同滴度慢病毒感染ADSCs細(xì)胞毒性根據(jù)檢測結(jié)果繪制生長曲線，各組脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生長曲線約呈“S”形，見圖4，生長潛伏期為1 d，細(xì)胞第2天進(jìn)入對數(shù)生長期，慢病毒載體轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞第4天達(dá)生長高峰而后逐漸進(jìn)入平臺期，空白組細(xì)胞第3～7天平穩(wěn)增加，至第8天變緩。慢病毒載體轉(zhuǎn)染脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞后對細(xì)胞無明顯毒性作用。

2.4 成軟骨分化相關(guān)基因Aggrecan，COL2A1，SOX-9的表達(dá)研究結(jié)果顯示,在分別誘導(dǎo)培養(yǎng)7、14、21 d時，相較于空載體轉(zhuǎn)染組及空白組，轉(zhuǎn)染含有TGF-β3目的基因的慢病毒的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞從基因水平均可合成更多的成軟骨分化相關(guān)的Aggrecan(P<0.01)、SOX-9(P<0.001)及COL2A1(P<0.001),見表2～4。

圖4 慢病毒轉(zhuǎn)染脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的生長曲線

表2 慢病毒轉(zhuǎn)染ADSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)7d時成軟骨分化相關(guān)基因的表達(dá)

表3 慢病毒轉(zhuǎn)染ADSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d時成軟骨分化相關(guān)基因的表達(dá)

表4 慢病毒轉(zhuǎn)染ADSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d時成軟骨分化相關(guān)基因的表達(dá)

3 討論

由于顳下頜關(guān)節(jié)軟骨缺乏血管神經(jīng)分布，任何形式的軟骨損傷后其自身幾乎無本體修復(fù)能力。因此對于軟骨退行病變的解決方式青睞于組織工程化軟骨的應(yīng)用。組織工程的研究方向也從早期軟骨膜及骨膜移植到自體軟骨軟骨細(xì)胞回植，目前干細(xì)胞聯(lián)合生物材料及生長因子植入損傷部位為組織工程主要辦法。

在軟骨組織工程中細(xì)胞因子起到調(diào)控促進(jìn)作用，TGF-β家族在誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化過程中至為關(guān)鍵。在成軟骨分化的工程中TGF-β主要通過上調(diào)基質(zhì)中膠原、蛋白多糖含量，下調(diào)金屬蛋白酶含量途徑二者協(xié)調(diào)以發(fā)揮最終作用。有研究指出TGF-β超家族分子參與了軟骨內(nèi)成骨的整個過程。在此需要指出的是，在TGF-β家族中TGF-β1、TGF-β2優(yōu)勢誘導(dǎo)細(xì)胞成骨[4-5]，而TGF-β3[6]可誘導(dǎo)細(xì)胞成軟骨分化，TGF-β3可增加軟骨外基質(zhì)成分，并且具有合成硫酸糖胺聚糖的作用。本實(shí)驗(yàn)通過使用TGF-β3生長因子以刺激ADSCs向軟骨方化。

ADSCs在組織工程中的廣泛應(yīng)用[7-9]，本研究前期研究已通過體外分離培養(yǎng)ADSCs并進(jìn)行成脂、成骨及成軟骨的誘導(dǎo)分化，證明干細(xì)胞的特性。生長因子在這一過程的作用尤為重要。在軟骨組織工程中外源性添加生長因子對促進(jìn)種子細(xì)胞生物活性的影響不穩(wěn)定，細(xì)胞增殖傳代后易丟失相關(guān)屬性。內(nèi)源性基因修飾的方式能夠保持種子細(xì)胞的活性，可在軟骨受損局部區(qū)域持續(xù)釋放最佳濃度的細(xì)胞因子，使種子細(xì)胞分泌目的蛋白，從而促進(jìn)組織再生。慢病毒載體 (lentivirus vector, LV)可感染分裂及非分裂期細(xì)胞[10]，能將選定的目的基因轉(zhuǎn)載至細(xì)胞中以調(diào)節(jié)細(xì)胞分泌，一方面這種作用可穩(wěn)定存在，另一方面同時也有免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)[11]，因此慢病毒載體一種較為理想介質(zhì)運(yùn)用在基因修飾中。

本研究根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置感染復(fù)數(shù)為50、100，將TGF-β3基因轉(zhuǎn)染ADSCs中轉(zhuǎn)染組結(jié)果無明顯差異。激光共聚焦顯微鏡的結(jié)果中可以觀察到TGF-β3慢病毒轉(zhuǎn)染的ADSCs的長梭形細(xì)胞形態(tài)優(yōu)于慢病毒空載體轉(zhuǎn)染后ADSCs的形態(tài)，結(jié)果說明慢病毒對細(xì)胞形態(tài)有一定的影響，TGF-β3對脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)的維持有一定作用。根據(jù)CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生長曲線結(jié)果顯示，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，慢病毒對細(xì)胞的毒性小?？赡艿脑?yàn)椋郝《局械膶λ拗骷凹?xì)胞由影響的片段已經(jīng)被剔除，替換為外源性引入的TGF-β3目的基因，感染目的細(xì)胞后慢病毒并不會利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的病毒顆粒，較為安全[12]。并且在實(shí)驗(yàn)過程中，慢病毒轉(zhuǎn)染8～12 h后及時將病毒感染液棄除，每日更換完全培養(yǎng)基以供分裂增殖是需要的營養(yǎng)物質(zhì)，也是對局部細(xì)胞生長微環(huán)境的更新及維持。但空白組細(xì)胞增殖平臺期為第3～7天，維持時間較慢病毒轉(zhuǎn)染組長，考慮原因?yàn)檗D(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖速度較快，第3～5天CCK-8吸光度介于空白組上方，間接反映轉(zhuǎn)染組細(xì)胞數(shù)量多于空白組，ADSCs貼壁生長，生長空間有限，細(xì)胞增殖較快易形成接觸抑制，使得平臺期維持較短，提前進(jìn)入穩(wěn)定期。TGF-β3誘導(dǎo)ADSCs向軟骨細(xì)胞方向分化，軟骨實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖緩慢，且易去分化，可影響細(xì)胞增殖。且TGF-β3可誘導(dǎo)干細(xì)胞分泌軟骨細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞間交通發(fā)生變化。基于以上兩點(diǎn)，TGF-β3轉(zhuǎn)染組增殖平臺期維持時間短于空白組。結(jié)合激光共聚焦細(xì)胞形態(tài)的獲取，比較TGF-β3目的基因轉(zhuǎn)染組，慢病毒空載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變，由長梭形轉(zhuǎn)變?yōu)槎趟笮位蛘卟灰?guī)則型，貼壁細(xì)胞在形態(tài)學(xué)發(fā)生轉(zhuǎn)變的過程中易脫壁發(fā)生細(xì)胞數(shù)量的丟失，繼而使得慢病毒空載體轉(zhuǎn)染組平臺期維持短于空白組。同時也可以解釋后續(xù)PCR檢測成軟骨相關(guān)基因及蛋白在空載體組表達(dá)較低的原因。

Aggrecan、SOX-9及Ⅱ型膠原(COL2)與成軟骨分化密切相關(guān)。其中COL2是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)主要組成部分，SOX-9在軟骨形成中至關(guān)重要[13]，Aggrecan對軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的有穩(wěn)固作用。本實(shí)驗(yàn)研究中，將TGF-β3目的基因內(nèi)源性通過慢病毒基因載體轉(zhuǎn)染整合至ADSCs，從而過表達(dá)成軟骨分化相關(guān)的基因及蛋白。通過實(shí)時定量PCR檢測結(jié)果顯示：與空白組比較，轉(zhuǎn)染含有TGF-β3目的基因的慢病毒的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可以合成更多的成軟骨分化相關(guān)的Aggrecan、SOX-9及COL2A1。這些軟骨細(xì)胞外基質(zhì)含量增多，構(gòu)建局部微環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞間通訊，這是一種相互促進(jìn)的正反饋結(jié)果。綜合以上三種細(xì)胞外基質(zhì)成分及水平，從而可以得出以下結(jié)論：TGF-β3轉(zhuǎn)染時慢病毒滴度越高，ADSCs合成的細(xì)胞外基質(zhì)含量就高。慢病毒將TGF-β3目的基因轉(zhuǎn)染至ADSCs中，慢病毒數(shù)量越多，代表著有更多的細(xì)胞遺傳物質(zhì)中有TGF-β3的整合參與，從而促進(jìn)更多的細(xì)胞合成相關(guān)成軟骨分化的基質(zhì)。

隨著Aggrecan、SOX-9及COL2A1的表達(dá)增高，可以形成更多的細(xì)胞外基質(zhì)，構(gòu)建一個良好的成軟骨分化的微環(huán)境。但是本研究存在不足之處在于缺乏滿意的支架材料來承載TGF-β3慢病毒轉(zhuǎn)染的ADSCs，也缺乏相應(yīng)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，后續(xù)研究內(nèi)容應(yīng)著重以上兩個方面進(jìn)行。綜上，TGF-β3目的基因由慢病毒載體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，是誘導(dǎo)ADSCs成軟骨分化的理想的途徑。因此經(jīng)TGF-β3基因修飾的ADSCs可以作為軟骨組織工程的種子細(xì)胞來源，為修復(fù)軟骨缺損及關(guān)節(jié)退行性病變帶來希望。