許穎捷， 宋志強(qiáng)， 邵 博， 胡露露， 曾雪敏, 龔忠誠(chéng)

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院/附屬口腔醫(yī)(學(xué))院頜面腫瘤外科， 2新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學(xué)研究所， 烏魯木齊 830054 )

髁突軟骨部分缺損或退行性病變常常由顳頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病、腫瘤、創(chuàng)傷等多種病因侵及軟骨層面而導(dǎo)致發(fā)生。軟骨自身因匱乏神經(jīng)血管其修復(fù)能力極其有限，當(dāng)軟骨損傷后，調(diào)動(dòng)機(jī)體進(jìn)行自身修復(fù)幾乎是不可能的[1]。近年來(lái)軟骨組織工程學(xué)的發(fā)展為此類問(wèn)題帶來(lái)了良好的應(yīng)用前景，即用于臨床修復(fù)軟骨缺損或替代病變、缺損的組織器官，從而達(dá)到修復(fù)創(chuàng)傷和重建功能的目的[2]。 種子細(xì)胞、支架材料、生長(zhǎng)因子是組織工程的三大結(jié)構(gòu)[3]。大量體外研究表明干細(xì)胞增殖能力無(wú)限，具有多向分化潛能，其特性為構(gòu)建組織工程軟骨提供了理想種子細(xì)胞的可能性。Zuk等從人的脂肪中分離出脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)，取材簡(jiǎn)易，量大且創(chuàng)傷小等特點(diǎn)是軟骨組織工程種子細(xì)胞來(lái)源的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，ADSCs逐漸成為應(yīng)用在組織工程中[4]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)兔脂肪組織中的ADSCs進(jìn)行分離培養(yǎng)及鑒定，檢測(cè)其成脂、成骨、成軟骨細(xì)胞分化的特性，為后期基于ADSCs作為種子細(xì)胞的軟骨組織工程的研究提供更有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新西蘭大耳兔，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置嚴(yán)格遵守《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》相關(guān)要求。動(dòng)物倫理審核項(xiàng)目編號(hào):IACUC20180411-13。

1.2 材料

1.2.1 主要試劑 DMEM/F12、H-DMEM培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶、L-谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素(HYCLONE公司，美國(guó))，Ⅰ型膠原酶(Worthington公司，美國(guó))，胎牛血清(FBS)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Insulin Transferrin Selenium, Gibco公司，美國(guó))，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、維生素C、吲哚美辛、β-磷酸甘油鈉、L-脯氨酸、油紅O、1%茜素紅染色液(pH=4.2)、甲苯胺藍(lán)(北京索萊寶公司，中國(guó))、地塞米松(Dexamethasone)、胰島素(Insulin)、細(xì)胞活性檢測(cè)(CCK-8)試劑盒(Sigma公司，美國(guó))，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1,Prope-tech公司，美國(guó))，F(xiàn)ITC-小鼠單克隆抗體CD90、CD11b、兔單克隆抗體CD34、HLA-DR、FITC-鼠抗兔IgG(abcam公司，美國(guó))，DAB顯色液(北京中杉金橋)。

1.2.2 儀器 流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur，美國(guó))、超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD，中國(guó))、低速離心機(jī)(KDC-40，中國(guó))、倒置顯微鏡(LEICA CTR400，德國(guó))、二氧化碳恒溫箱(HF240，中國(guó))。

1.3 方法

1.3.1 ADSCs的分離與培養(yǎng) 成年新西蘭大耳白兔經(jīng)由耳緣靜脈注射過(guò)量利多卡因處死，常規(guī)術(shù)前準(zhǔn)備。取雙側(cè)腹股溝部脂肪組織存至培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)，用含5%雙抗的無(wú)菌PBS清洗3遍，盡量剔除脂肪組織中肉眼可見的筋膜和血管，眼科剪剪碎至約1 mm3大小，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管。加入等體積的0.1%Ⅰ型膠原酶，離心管封口后放入搖床消化(37℃，140 r/min，60 min)。加等體積終止液(含10%FBS的DMEM/F12)終止消化，2 000 r/min，4℃離心5 min，棄上層粘稠絮狀組織及中層清液，留沉淀層。PBS清洗一次，DMEM/F12培養(yǎng)基(含10%FBS，1%雙抗)重懸沉淀，200目細(xì)胞篩過(guò)濾；吸取濾液，接種至50 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48～72 h后首次換液，之后每隔2天換一次液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。使用倒置顯微鏡每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及形態(tài)變化。

1.3.2 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 取培養(yǎng)P3代ADSCs細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后稀釋至1×104個(gè)/mL，以每孔100 μL接種于8個(gè)96孔板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。正常培養(yǎng)組含培養(yǎng)液與細(xì)胞，對(duì)照組僅含培養(yǎng)液無(wú)細(xì)胞,每組各設(shè)6個(gè)復(fù)孔。按照使用說(shuō)明書，每天取1個(gè)96孔板，連續(xù)7 d在波長(zhǎng)為450 nm條件下酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的吸光度值，并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.3 ADSCs表面相關(guān)抗原的鑒定 取生長(zhǎng)良好的P3代細(xì)胞，胰蛋白酶消化收集，使用適量緩沖液重懸，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/mL；在每個(gè)流式管中分別加入100 μL細(xì)胞懸液并做好標(biāo)記，分別加入稀釋后的CD90、CD11b熒光標(biāo)記的小鼠單克隆抗體、CD34、HLA-DR熒光標(biāo)記的兔單克隆抗體，室溫避光孵育30 min，設(shè)置只加緩沖液的空白對(duì)照管1，CD34、HLA-DR檢測(cè)管再加入FITC-鼠抗兔IgG室溫避光孵育30 min，空白管加入鼠抗兔IgG作為同型對(duì)照同條件孵育。PBS清洗2次，1 000 r/min，離心5 min棄上清，重懸后用預(yù)先滅菌的300目濾網(wǎng)過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。

1.3.4 ADSCs誘導(dǎo)成脂及鑒定 將P3代ADSCs以5×107個(gè)/L的密度接種在6孔板中，用含10%FBS、1%雙抗的H-DMEM培養(yǎng)4 d后吸去原培養(yǎng)液，貼壁率約80%，加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(原培養(yǎng)基中加入1 μmol/L地塞米松，0.5 mmol/L的IBMX，100 μmol/L吲哚美辛和10 μg/ml胰島素)，繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3天更換一次培養(yǎng)基。待誘導(dǎo)7 d后用4%多聚甲醛固定0.5 h。油紅O染液37℃下浸染30 min，PBS反復(fù)沖洗以去除多余染料，倒置顯微鏡觀察染色情況。

1.3.5 ADSCs誘導(dǎo)成骨及鑒定 P3代ADSCs以108個(gè)/L的密度接種在6孔板中，用含10%FBS、1%雙抗的H-DMEM培養(yǎng)4 d后吸去原培養(yǎng)液，更換培養(yǎng)基為礦化培養(yǎng)基(原培養(yǎng)基中加入100 nmol/L地塞米松、50 μg/mL維生素C和10 mmol/L β-磷酸甘油鈉)。繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3天更換一次培養(yǎng)基。待誘導(dǎo)第7天時(shí)用4%多聚甲醛固定0.5 h，漂洗后用1%茜素紅(pH=4.2)37℃浸染15 min，PBS反復(fù)沖洗，倒置顯微鏡觀察染色情況。

1.3.6 ADSCs誘導(dǎo)成軟骨及免疫組織化學(xué)檢測(cè) P3代培養(yǎng)于50 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶的ADSCs經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，在1.5 mL EP管內(nèi)離心成為細(xì)胞團(tuán)塊，構(gòu)建Pellet結(jié)構(gòu)，團(tuán)塊含有的細(xì)胞數(shù)需>5.0×106個(gè)，之后添加含10%FBS、1%雙抗的H-DMEM培養(yǎng)基1.2 mL，在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液，添加軟骨誘導(dǎo)液，為H-DMEM中添加2.5%FBS，40 μg/mlL脯氨酸，100 nmol/L地塞米松，50 μg/mL維生素C，1%ITS，10 ng/mL TGF-β1，繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3天更換一次培養(yǎng)基。待誘導(dǎo)21 d天后用4%多聚甲醛固定(>12 h)，酒精梯度脫水(80%～100%)，浸蠟、石蠟包埋、切片5 μm、脫蠟后進(jìn)行HE及免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs形態(tài)隨著原代細(xì)胞貼壁時(shí)間的延長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于一致,胞漿延展成長(zhǎng)梭形或者長(zhǎng)三角形，約7～9 d貼壁細(xì)胞數(shù)量可達(dá)傳代要求，此時(shí)貼壁面積約80%，細(xì)胞間胞膜接觸擠壓呈魚群狀，見圖1。

2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制根據(jù)CCK-8法連續(xù)8 d檢測(cè)結(jié)果繪制生長(zhǎng)曲線，P3代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈“S”形(圖2)，細(xì)胞潛伏期約2 d，第3天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第5天達(dá)生長(zhǎng)高峰，第6天逐漸進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢(表1)。

圖2 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞P3代生長(zhǎng)曲線

表1 增殖曲線所測(cè) A 值

2.3 細(xì)胞表面相關(guān)抗原的流式細(xì)胞術(shù)鑒定流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)P3代ADSCs表面抗原結(jié)果見圖3，細(xì)胞表達(dá)CD90陽(yáng)性(87.72%)，相反CD11b(0%)、CD34(0.03%)、HLA-DR(1.4%)呈陰性反應(yīng)。

正常培養(yǎng)細(xì)胞

CD-90

CD-11

bCD-34

HLA-DR

圖3 ADSCs流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果

2.4 ADSCs成脂誘導(dǎo)P3代ADSCs貼壁率達(dá)100%后，加入成脂誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)72 h后長(zhǎng)梭形細(xì)胞開始發(fā)生形變，胞漿飽滿變稍呈扁圓狀，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞胞漿逐漸透亮，油紅0分別染色誘導(dǎo)后的ADSCs，結(jié)果顯示誘導(dǎo)第7天時(shí)可細(xì)胞胞漿內(nèi)見較大的脂滴形成(圖4a)，除較大脂滴外，胞漿內(nèi)可見均勻的分布的細(xì)小脂滴(圖4b)。

a: 胞漿內(nèi)見大脂滴形成，如箭頭所示

b: 胞漿內(nèi)見細(xì)胞脂滴形成，如箭頭所示

圖4 ADSCs成脂誘導(dǎo)后油紅O染色(BF光束下拍照, ×200)

2.5 ADSCs成骨誘導(dǎo)細(xì)胞貼壁達(dá)70%時(shí)，加入成骨誘導(dǎo)液，誘導(dǎo)過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化，倒置顯微鏡下見ADSCs漩渦狀生長(zhǎng)中心及邊緣可見小結(jié)節(jié)，成骨誘導(dǎo)的ADSCs使用1%茜素紅分別染色鏡下觀察，結(jié)果示誘導(dǎo)第7天時(shí)可見數(shù)個(gè)骨結(jié)節(jié)形成，見圖5。

圖5 ADSCs成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色，鈣結(jié)節(jié)紅染 (PH光束下拍照, ×100)

2.6 ADSCs成軟骨誘導(dǎo)成軟骨誘導(dǎo)21 d后Pellet成橄欖球型，表面光滑，有韌性。成軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)后，蘇木精-伊紅染色胞漿呈紫紅色。核呈深紫色，軟骨凹陷形成。Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)中顯示胞漿被染成棕褐色，表達(dá)軟骨Ⅱ型膠原特異性蛋白，且形成成熟的軟骨凹陷，見圖6。

3 討論

由于顳下頜關(guān)節(jié)軟骨缺乏血管神經(jīng)分布，任何形式的軟骨損傷后其自身幾乎無(wú)本體修復(fù)能力。單純外科手術(shù)難以達(dá)到理想的治療效果，累計(jì)術(shù)后感染壞死、繼發(fā)畸形等并發(fā)癥，使得單一開放性手術(shù)治療舉步維艱。目前，基于種子細(xì)胞的軟骨組織工程是解決軟骨損傷后修復(fù)的研究焦點(diǎn)。組織工程的研究方向也從早期軟骨膜及骨膜移植到自體軟骨軟骨細(xì)胞回植，如今干細(xì)胞已廣泛應(yīng)用于其中。

誘導(dǎo)后形成Pellet結(jié)構(gòu)

HE染色(×40)

Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色(×40)

圖6 ADSCs成軟骨誘導(dǎo)

種子細(xì)胞的選擇是組織工程化軟骨的前提。成熟的軟骨細(xì)胞雖是經(jīng)典的種子細(xì)胞來(lái)源，但因其組織有限，以及易老化易去分化等缺點(diǎn)，軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞的發(fā)展受到限制。干細(xì)胞作為一類可多向分化、具有無(wú)限增殖潛能的細(xì)胞，成為軟骨組織工程種子細(xì)胞的首選。既往研究表明由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSCs)是軟骨組織工程理想的種子細(xì)胞[5]。但BMSCs的數(shù)量很少，在體外培養(yǎng)經(jīng)多次傳代易老化，致使增殖能力和成軟骨分化潛能均下降。相較前者，ADSCs常常由吸脂獲取，具有獲取量大，取材簡(jiǎn)易，創(chuàng)傷較小等特點(diǎn)，使得ADSCs在來(lái)源上成為組織工程種子細(xì)胞的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其可以在體外可以分化成軟骨、骨、肌腱、骨骼肌和脂肪[6-8]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ADSCs在體外特定條件下可分化為多種細(xì)胞類型及表達(dá)BMSCs相關(guān)抗原。本實(shí)驗(yàn)依照相關(guān)文獻(xiàn)分離出兔腹股溝部脂肪組織，剔除筋膜血管，使用I型膠原酶消化后對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，ADSCs以貼壁方式生長(zhǎng)，呈類成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞增殖迅速，細(xì)胞傳代培養(yǎng)生長(zhǎng)穩(wěn)定。

流式細(xì)胞術(shù)可通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞表型來(lái)明確細(xì)胞來(lái)源，但標(biāo)記脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性分子目前尚未找到，相關(guān)研究表明,脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞這一類細(xì)胞的特異性表面標(biāo)記：CD44、CD54、CD90、CD105等陽(yáng)性表達(dá)；不表達(dá)CD45、HLA-DR等免疫原性細(xì)胞的表面標(biāo)記；對(duì)CD34的表達(dá)目前還存在爭(zhēng)議[9-10]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ADSCs表型結(jié)果顯示CD90呈陽(yáng)性表達(dá)，CD11b、CD34、HLA-DR呈陰性表達(dá)，結(jié)合成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化結(jié)果進(jìn)一步證明了所分離培養(yǎng)的細(xì)胞就是來(lái)源于脂肪的間充質(zhì)干細(xì)胞。

在軟骨組織工程中細(xì)胞因子起到調(diào)控促進(jìn)作用，TGF-β1在誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化過(guò)程中至為關(guān)鍵，在胚胎軟骨形成過(guò)程時(shí)，TGF-β1可以誘導(dǎo)原始的間充質(zhì)干細(xì)胞分化形成軟骨組織，并具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的作用。TGF-β1通過(guò)促進(jìn)干細(xì)胞分化成軟骨，促進(jìn)其增殖，同時(shí)也能促使軟骨糖胺多糖和II型膠原合成以增加軟骨細(xì)胞外基質(zhì)[11-13]。本實(shí)驗(yàn)外源性添加10 ng/mL的TGF-β1可成功誘導(dǎo)ADSCs向軟骨方向分化，促進(jìn)軟骨相關(guān)蛋白Ⅱ型膠原的形成。相關(guān)研究表明TGF-β1在此濃度時(shí)可顯著促進(jìn)MSCs的成軟骨分化，增加濃度(>10 ng/mL)并不能提高M(jìn)SCs的成軟骨效率。

本研究結(jié)果表明，從兔脂肪組織中分離培養(yǎng)到的ADSCs具有多向分化潛能。增殖能力優(yōu)好是組織工程種子細(xì)胞選擇的必備因素，本研究中ADSCs增殖速度較快，第3天即可進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，對(duì)比BMSCs，ADSCs生長(zhǎng)速度快，這與Zhu等[14]研究結(jié)果一致。

綜上，脂肪組織中細(xì)胞豐富，取材方便，ADSCs分離培養(yǎng)方法簡(jiǎn)易,可獲得大量細(xì)胞且干細(xì)胞特性顯著，貼壁ADSCs用選擇性培養(yǎng)基后具有向脂肪、骨分化能力，細(xì)胞團(tuán)塊pellet結(jié)構(gòu)在三維環(huán)境培養(yǎng)經(jīng)由TGF-β1外源性刺激誘導(dǎo)后，具有軟骨分化潛能，成為髁突軟骨損傷組織工程修復(fù)中種子細(xì)胞的佳選。