李曉兵，何 蕊，位 鴻，劉 鶴，成光宇，王秀閣*

（1.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合實驗中心，長春 130021；

2.長春中醫(yī)藥大學藥學院，長春 130117）

中藥消渴痹通膠囊是由黃芪、桑枝、雞血藤、豨薟草、全蝎等7 味中藥組成的醫(yī)院制劑，臨床用于治療糖尿病周圍神經(jīng)病變已有15年，具有益氣活血，化瘀通絡功效，既往研究證實能夠改善 DPN 患者的臨床癥狀。為控制該藥品的質(zhì)量，本文對其主要有效成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷進行含量測定研究，同時進行含量測定方法學驗證，以便更加全面的控制樣品質(zhì)量，為臨床用藥提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備 SK8200HP 超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司），XMTD-8222 恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司），BT125D 型十萬分之一電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），高效液相色譜儀Waters 2695 液相色譜儀，紫外檢測器，色譜柱：島津Inertsil ODS-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.2 材料與試藥 3 批中試樣品（批號為20171101、20171102、20171103），毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號：111920-201606，供含量測定用，規(guī)格：20 mg，購于中國食品藥品檢定研究院），乙腈為色譜純，水為超純水；其它試劑均為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 1）色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（250 mm×4.6 mm，5 μm）；2）流動相：乙腈-0.2%甲酸水，梯度洗脫；3）檢測波長：260 nm；4）流速：1 mL/min。理論板數(shù)按毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量峰計算應不低于3 000。

時 間/min 乙腈 0.2%甲酸水 0 ～20 20-40 80-60 20 ～30 40 60

1.3.2 供試品溶液制備方法[1-2]取本品粉末 ( 過四號篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流4 h，放冷，再稱定重量，以甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液25 mL，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

1.3.3 對照品溶液的制備 取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品，精密稱定為5.05 mg，置10 mL 量瓶中，加甲醇定容到10 mL 容量瓶中，再精密吸取1 mL，加甲醇定容到10 mL 量瓶中，搖勻，得濃度為50.5 μg /mL 的溶液，再精密吸取5 mL，加甲醇定容到10 mL 量瓶中，搖勻，即得。（每1 mL 含毛蕊異黃酮葡萄糖苷25.25 μg/mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性考察[3]以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（色譜柱型號：Inertsil ODS-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-0.2%甲酸水為流動相，梯度洗脫；檢測波長為260 nm。

分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液各10 mL，注入液相色譜儀，色譜圖見圖1。

圖1 專屬性考察（從上到下，毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品、供試品、陰性）

可見在此條件下，毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰與其它峰分離較好，陰性對照液在相應位置無干擾。

2.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液2.0、4.0、8.0、10.0、15.0、20.0 mL，注入液相色譜儀測定，以進樣量（mg）為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線?；貧w方程：Y= 2 882 543.970X+38 794.520，r= 0.999 5，毛蕊異黃酮葡萄糖苷線性范圍為0.050 5 ～0.505 0 mg，試驗結(jié)果見表1、圖2。

表1 線性關(guān)系考察

圖2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷標準曲線

2.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取對照品溶液和同一批供試品溶液各10 mL，分別在0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h進樣，依法測定，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積積分值為指標，測定其穩(wěn)定性，結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗

結(jié)果：RSD 分別為0.82%和2.95%，穩(wěn)定性良好，24 h 內(nèi)測定結(jié)果可靠。

2.4 精密度試驗 精密吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液10 mL，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6 次，依法測定，記錄峰面積積分值，計算，考察精密度，結(jié)果見表3。

表3 精密度試驗

精密度考察結(jié)果顯示：對照品溶液連續(xù)測定結(jié)果的RSD 為0.28%，表明儀器、方法的精密度良好。

2.5 重現(xiàn)性試驗 精密稱取同一批樣品共6 份，按供試品溶液項下制備，依法獨立測定，計算樣品含量，以考察本法的重現(xiàn)性，結(jié)果見表4。

表4 重現(xiàn)性試驗

以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為含量測定指標，考察本法的重現(xiàn)性，結(jié)果RSD為1.84%，平均含量為0.141 0 mg/g，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.6 準確度試驗 精密稱取已知含量同一批樣品，取約1 g，共6 份，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品0.161 6 mg，精密加甲醇至50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流4 h，放冷，再稱定重量，以甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液25 mL，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液，依法測定，計算回收率，結(jié)果見表5。

表5 回收率試驗結(jié)果

結(jié)果表明，平均回收率為99.16%，RSD 為2.15%，表明本法準確性較好，方法可行。

2.7 含量測定 取3 批中試樣品，依法制備供試品溶液，每批2 份，分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10 mL，注入液相色譜儀，測定峰面積，計算3批中試樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量，結(jié)果見表6。

2.8 含量限度的確定 根據(jù)本品3 批樣品含量測定結(jié)果，含量測定數(shù)據(jù)平均為0.148 5 mg/g，含量限度按測定結(jié)果平均值的80%計算，結(jié)果為0.118 8 mg/g，本品規(guī)格為每個膠囊裝0.32 g，故暫定：本品每個膠囊含黃芪以毛蕊異黃酮葡萄糖苷（C22H22O10）計，不得少于0.038 0 mg。

表6 3 批中試含量測定結(jié)果 mg/g

3 討論

消渴痹通膠囊是由7 味中藥組成的復方制劑，組成成分復雜，干擾多。在質(zhì)量控制方面，嘗試了多種樣品提取及純化方法，優(yōu)化色譜條件，最后選定了本文中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定作為定量指標，本研究通過方法學驗證，證明該方法有較好的線性、精密度和回收率，采用高效液相色譜法進行含量測定，能有效消除組分中其他類物質(zhì)干擾，分離度較好，具有很好的準確性，可作為本品的質(zhì)量控制方法。