童民鋒，楊帆，劉繼紅，徐虎

（金華市中心醫(yī)院 神經(jīng)外科，浙江 金華 321000）

腦膠質(zhì)瘤是常見(jiàn)的顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，因其具有高度惡性生物學(xué)行為，臨床治療效果往往不佳[1]。替莫唑胺（temozolomide，TMZ）是一種親脂性小分子，能高效透過(guò)血腦屏障，引起堿基錯(cuò)配導(dǎo)致DNA斷裂進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，為膠質(zhì)瘤治療的一線化療藥[2]。越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤內(nèi)存在一部分具有自我更新能力、多向分化潛能及更強(qiáng)體內(nèi)成瘤能力的細(xì)胞—腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs）[3]。研究報(bào)道，腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（glioma stem cells，GSCs）是腦膠質(zhì)瘤對(duì)包括TMZ在內(nèi)的傳統(tǒng)化療耐受的重要因素[4]。如何遏制腦膠質(zhì)瘤對(duì)化療藥物耐受是臨床治療的關(guān)鍵所在。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度在200 nt～100 kb的非編碼RNA，許多l(xiāng)ncRNA異常表達(dá)于腫瘤，并且影響包括腦膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展[5]。lncRNA BC200（以下簡(jiǎn)稱BC200）是lncRNA大家族的一員，臨床研究顯示其在高侵襲性乳腺癌及卵巢癌、宮頸癌中高度上調(diào)[6]，但BC200與腦膠質(zhì)瘤干性的關(guān)系還未有研究報(bào)道。本研究以腦膠質(zhì)瘤U87 MG細(xì)胞為研究模型培養(yǎng)分離GSCs，siRNA干擾BC200并觀察GSCs對(duì)TMZ的敏感性，為臨床腦膠質(zhì)瘤治療提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料 U87 MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。DMEM和無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；EGF、bFGF和胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；羊抗兔CD133、羊抗鼠Bax、羊抗鼠Bcl-2和羊抗鼠cleaved caspase-3、羊抗兔GAPDH購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的鼠和兔二抗購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司；蛋白提取試劑盒及細(xì)胞裂解液購(gòu)自北京碧云天公司；BC200 siRNA購(gòu)自上海吉瑪公司；TMZ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、GSCs提取及TMZ處理:U87 MG細(xì)胞先以含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，后轉(zhuǎn)至無(wú)血清的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液含重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）20 pg·L-1和表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）20 pg·L-1中，并加入B27補(bǔ)充劑培養(yǎng)提取GSCs，GSCs以球形懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)。細(xì)胞均在37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)傳代。以TMZ（200 μmol·L-1）處理GSCs 24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 免疫熒光鑒定GSCs:GSCs在4%多聚甲醛中固定30 min后，室溫下用Triton X-100透核膜10 min。應(yīng)用含5% BSA的PBS封閉2 h，于4 ℃下孵育一抗CD133（1:400）和Nestin（1:500）過(guò)夜，同時(shí)以DAPI染核。室溫孵育熒光二抗2 h，PBS洗片后應(yīng)用熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.3 siRNA轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染前1 d，用0.5 mL含F(xiàn)BS和抗生素的DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞接種在24孔板上。選擇用于初期接種的細(xì)胞數(shù)量，應(yīng)能在24 h內(nèi)使細(xì)胞匯合達(dá)到70%～90%。轉(zhuǎn)染前換成無(wú)抗生素、無(wú)血清的培養(yǎng)基。siRNA的轉(zhuǎn)染濃度為40 pmol/L，準(zhǔn)備siRNA-lipo 2000混和液，稀釋轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（lipo 2000），使用前將lipo 2000試劑搖勻，然后取適量，用不含血清的培養(yǎng)基稀釋，輕輕混和，室溫孵育5 min；用不含血清的培養(yǎng)基稀釋siRNA，加入量為40 pmol/L，輕輕混和；稀釋好的lipo 2000 經(jīng)過(guò)5 min的孵育后，與稀釋好的siRNA輕輕混和，室溫20 min以形成siRNA-lipo 2000混和物。將siRNA-lipo 2000混和液加入含有細(xì)胞以及培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)板中輕輕搖晃，使之混勻。將培養(yǎng)板置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中至檢測(cè)時(shí)間24 h。設(shè)立轉(zhuǎn)染對(duì)照組（NCsi）和BC200轉(zhuǎn)染沉默組（BC200 siRNA）。

1.2.4 Western blot:細(xì)胞培養(yǎng)融合至70%，按實(shí)驗(yàn)要求處理細(xì)胞后，加入RIPA細(xì)胞裂解液（使用前20 min加蛋白酶抑制劑，使其終濃度為1 mmol·L-1），在冰上孵育15 min以充分裂解，然后在4 ℃、12 000 r/min離心15 min。取樣品上清液留用，采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。進(jìn)行Western blot檢測(cè)時(shí)，每個(gè)泳道按30 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行上樣，SDSPAGE電泳分離蛋白，然后將分離蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（美國(guó)Millipore公司）上；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，以TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min；然后按要求加入Bax（1:1 000）、cleaved caspase-3（1:1 000）、Bcl-2（1:2 000）、CD133（1:1 000）室溫雜交1～2 h或4 ℃溫育過(guò)夜。一抗處理后，TBST洗膜3次，再加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗（1:2 000），室溫雜交1 h，PVDF膜以化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國(guó)Millipore公司）進(jìn)行顯色，Syngene Imaging System進(jìn)行成像，以Quantity One對(duì)蛋白印跡條帶進(jìn)行處理和分析。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（Control組）、TMZ處理組（TMZ組）、轉(zhuǎn)染對(duì)照組（NCsi組）、BC200轉(zhuǎn)染組（BC200 siRNA組）、TMZ處理的NCsi組（NCsi+TMZ組）、TMZ處理的BC200 siRNA組（BC200 siRNA+TMZ組）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以±s 表示，2組間比較用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GSCs的分離鑒定結(jié)果 免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)GSCs表面存在干細(xì)胞標(biāo)記物CD133和Nestin，GSCs分離培養(yǎng)成功，見(jiàn)圖1。

圖1 GSCs表面干細(xì)胞標(biāo)記物CD133和nestin的熒光顯色（免疫熒光染色）

2.2 TMZ處理對(duì)GSCs凋亡的影響 TMZ處理24 h后，TMZ組24 h GSCs成球能力未有明顯變化，見(jiàn)圖2。與Control組比，TMZ組細(xì)胞Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平未有明顯變化（P＞0.05）。

圖2 TMZ對(duì)GSCs細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯影響（×100）

2.3 siRNA沉默BC200對(duì)GSCs干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響 與NCsi組比，BC200 siRNA組的BC200 RNA水平下降了90.25%±3.66%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與NCsi組比，BC200 siRNA組的CD133蛋白表達(dá)下降92.36%±4.22%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖3。

2.4 沉默BC200對(duì)TMZ誘導(dǎo)的GSCs凋亡的影響 與NCsi+TMZ組比，BC200siRNA+TMZ組GSCs成球能力明顯減弱，見(jiàn)圖4A。與NCsi+TMZ組比，BC200 siRNA+TMZ組細(xì)胞cleaved caspase-3和Bax分別上調(diào)45.36%±4.25%和63.23%±5.12%，Bcl-2下調(diào)31.22%±3.80%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖4B和4C。

圖3 siRNA沉默BC200后抑制GSCs CD133蛋白表達(dá)

3 討論

圖4 沉默BC200對(duì)TMZ誘導(dǎo)的GSCs細(xì)胞球形生長(zhǎng)和凋亡的影響

惡性膠質(zhì)瘤是常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，具有高侵襲性。到目前為止，傳統(tǒng)手術(shù)只能切除肉眼可見(jiàn)的膠質(zhì)瘤病灶，因此術(shù)后患者往往要接受放療或化療[7]。TMZ為膠質(zhì)瘤治療的一線化療藥物，是一種能高效透過(guò)血腦屏障的親脂性小分子，其藥理機(jī)制為引起堿基錯(cuò)配導(dǎo)致DNA斷裂進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[2]。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間治療惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)TMZ等化療藥敏感性會(huì)降低[8]。研究報(bào)道，降低惡性腫瘤干細(xì)胞干性可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[9]。腫瘤干細(xì)胞具有自我更新、無(wú)限增殖、高致瘤性等特點(diǎn)，近些年研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞與干細(xì)胞具有某些相同的特異性表面分子標(biāo)志物，例如CD133、Nestin、ESA等，且懸浮生長(zhǎng)時(shí)均會(huì)以微球狀生長(zhǎng)[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)分離的GSCs表面陽(yáng)性表達(dá)CD133和Nestin，細(xì)胞球狀聚集生長(zhǎng)，驗(yàn)證了其干細(xì)胞特性。TMZ處理GSCs 24 h時(shí)細(xì)胞球狀生長(zhǎng)能力未明顯下降，凋亡標(biāo)志蛋白Bax、cleaved caspase-3和Bcl-2未有明顯變化，提示在24h時(shí)TMZ未能明顯誘導(dǎo)GSCs凋亡。

BC200是一種在人類神經(jīng)細(xì)胞中特異性表達(dá)的lncRNA，通過(guò)特定的調(diào)節(jié)機(jī)制調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞突觸小體的形成，在一般正常組織中可以檢測(cè)到較低表達(dá)量的lnc BC200[12]。研究報(bào)道，lncRNA BC200在腫瘤組織中表達(dá)量明顯升高，釋放并穩(wěn)定地存在于血液中，這為其作為外周血腫瘤標(biāo)志物提供了可能[13-14]。本研究進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BC200高表達(dá)于腦膠質(zhì)瘤U87 MG細(xì)胞，siRNA沉默BC200后，由腦膠質(zhì)瘤U87 MG細(xì)胞培養(yǎng)分離的GSCs干細(xì)胞標(biāo)志物CD133表達(dá)下調(diào)。提示GSCs干性能力下降。TMZ處理沉默BC200的GSCs發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞成球能力減弱，細(xì)胞分散生長(zhǎng)。觀察凋亡標(biāo)志蛋白發(fā)現(xiàn)，Bax和cleaved caspase-3 表達(dá)明顯上調(diào)，Bcl-2 下調(diào)。這些提示GSCs中BC200對(duì)細(xì)胞干性的維持具有重要作用，而干細(xì)胞特性的保持使GSCs能夠抵抗TMZ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，BC200可能通過(guò)介導(dǎo)Nestin表達(dá)從而維持腦膠質(zhì)瘤U87 MG細(xì)胞的干性，而該效應(yīng)可促進(jìn)細(xì)胞對(duì)TMZ誘導(dǎo)凋亡的抵抗。因此，干預(yù)BC200及其下游信號(hào)靶點(diǎn)可能是腦膠質(zhì)瘤臨床治療的新方法。