徐天臻，王臣健，湯呈宣

（溫州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院 瑞安市人民醫(yī)院 脊柱外科，浙江 溫州 325200）

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是臨床常見的嚴重創(chuàng)傷，常導致永久性感覺和運動功能喪失，引起癱瘓甚至威脅生命[1-2]。SCI的病理過程可分為2個階段:原發(fā)性損傷由機械損傷引起，難以逆轉(zhuǎn)；繼發(fā)性損傷則由血管損傷、氧化應激、炎性反應、谷氨酸興奮性毒性、細胞凋亡和壞死等引起的復雜病理級聯(lián)反應，最終引起神經(jīng)細胞的凋亡，導致脊髓進一步損傷[3-5]。因此，限制繼發(fā)性損傷進程從而減輕神經(jīng)元凋亡或許可以促進SCI之后的功能恢復[6]。

維格列?。╲ildagliptin，Vilda）是口服二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase 4，DPP4）抑制劑類降糖藥物，已在110余個國家批準使用[7]。近來有研究指出Vilda除降糖作用外，還具備抗氧化應激、維持線粒體功能、抗炎、抗凋亡等作用[8-9]。其神經(jīng)保護作用已在大鼠阿爾茨海默癥（Alzheimer's disease，AD）模型中提及[10-11]，但其在大鼠SCI模型中的作用報道較少，因此，本實驗研究Vilda對SCI后大鼠運動神經(jīng)元凋亡及運動功能的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物及分組:選用雌性SD大鼠48只，清潔級，體質(zhì)量200～250 g，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號:SYXK（浙）2014-0006，給予足量的水和飼料，在23～25 ℃的環(huán)境下喂養(yǎng)。采用隨機數(shù)字表法將適應性喂養(yǎng)1周后的大鼠分為3組:假手術組（Sham組）、手術組（SCI組）、Vilda治療組（SCI+Vilda組），每組16只。

1.1.2 主要試劑與儀器:Vilda購自美國MCE公司，使用時將藥物按2 mg/mL的濃度在超聲波幫助下溶于0.9%氯化鈉溶液；制備壓迫型大鼠SCI模型器械由溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院骨科實驗室提供（血管夾夾持應力:30 g）；凋亡相關蛋白Bcl-2單克隆抗體購自英國Abcam公司，Bax、Cleaved Caspase 3單克隆抗體均購自美國CST公司；山羊抗鼠抗體、山羊抗兔抗體均購自上海翊圣公司；尼氏染色液（焦油紫法）購自北京索萊寶公司。全自動酶標儀購自美國Thermo公司，電泳儀和自動凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司，熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司，組織勻漿機購自上海凈信公司。

1.2 方法

1.2.1 模型的制備及術后處理:將SD大鼠以8%水合氯醛按3.5 mL/kg劑量行腹腔注射麻醉。麻醉滿意后取俯臥位，固定大鼠四肢，T9節(jié)段附近備皮并消毒。Sham組僅去除棘突和椎板，暴露脊髓，不進行血管夾壓迫；SCI組和SCI+Vilda組使用血管夾（30 g）制備壓迫型SCI模型[12-14]，壓迫點為T9節(jié)段，血管夾壓迫時間為1 min。大鼠SCI模型建立成功的標準:脊髓局部充血、水腫，行為學可觀察到大鼠后肢痙攣，尾巴痙攣抽動，蘇醒后BBB評分（Basso-Beattie-Bresnahan scale）為0 分[15]。術后處理:麻醉蘇醒后，立刻給藥1次，按10 mg·kg-1·d-1的劑量通過灌胃方式給藥，SCI組和SCI+Vilda組分別同時給予等體積的0.9%氯化鈉溶液和Vilda溶液，連續(xù)給藥7 d，之后每3 d給藥1次；分別在術后第3、第7、第14、第28天處死取標本。術后大鼠自由進食和飲水，飼養(yǎng)環(huán)境維持在23～25 ℃，每2 d換次墊料，保持干燥通風；同時輔助SCI組和SCI+Vilda組大鼠排尿、排便，每日3次，做好會陰部護理。

1.2.2 后肢運動功能恢復的行為學評估:在術后第1、第3、第7、第14、第21、第28天分別運用0～21 分制BBB量表評估大鼠后肢運動功能恢復的情況[15]，評估采取雙盲法，由熟悉BBB評分量表的實驗人員進行；此外，在術后第28天，對各組大鼠進行足印跡步態(tài)分析[16-17]，每只大鼠前爪用紅墨水染色，后爪用藍墨水染色，放置于2 m×10 cm的白紙上自由行走，獲得足印跡。

1.2.3 脊髓組織尼氏染色檢測前角運動神經(jīng)細胞:術后第7天，處死大鼠，完整剝離出損傷處（T7～T10）的脊髓組織，置于4%多聚甲醛中固定，之后用石蠟包埋，用切片機切成5 μm厚的薄片黏附在載玻片上。根據(jù)試劑盒說明書進行染色:切片常規(guī)脫蠟至水，然后將切片置于染色工作液中，并將染缸于56 ℃溫箱浸染1 h，之后取出切片，去離子水沖洗3次（沖洗時注意防止脫片），將切片置于尼氏分化液中分化30 s，之后乙醇梯度脫水，二甲苯中透明30 min，中性樹膠封固，最后在顯微鏡下觀察。

1.2.4 脊髓組織免疫熒光染色檢測凋亡蛋白的表達:術后第3天，處死大鼠，完整剝離出損傷處（T8～T10）的脊髓組織，置于4%多聚甲醛中固定，之后用石蠟包埋，用切片機切成5 μm厚的薄片黏附在載玻片上。根據(jù)組織免疫熒光染色步驟進行操作:切片常規(guī)脫蠟至水，PBS漂洗3次，每次5 min（漂洗時注意防止脫片）；37 ℃水浴箱中胰酶法抗原修復30 min，PBS漂洗3次，每次5 min；37 ℃水浴箱中用10%山羊血清封閉1 h；孵育一抗:將Cleaved Caspase 3抗體用1% BSA按1:400的比例稀釋，滴到切片上將脊髓組織完全覆蓋，之后將切片放入濕盒中4 ℃孵育過夜；孵育二抗:一抗孵育結束之后，將切片取出，在37 ℃水浴箱中復溫1 h，之后PBS漂洗3次，每次5 min，用1% BSA按1:1 000濃度稀釋二抗抗體，滴到切片上將組織覆蓋，置于37 ℃水浴箱孵育2 h（孵育二抗全程避光）；DAPI染核:二抗孵育結束之后，取出切片，PBS漂洗3次，將DAPI染液滴到組織上，室溫下靜置1 min（避光操作）；封片:將切片用PBS漂洗3次，每次5 min，去除多余PBS，滴加抗熒光猝滅劑，封片，暗室顯微鏡下觀察。

1.2.5 Western blot檢測凋亡相關蛋白的表達:術后第3天，處死各組大鼠，完整剝離出T8～T10節(jié)段的脊髓組織，加入組織裂解液（按10 mg組織加100 μL裂解液的比例添加，裂解液按100:1 的比例混合組織裂解液和PMSF），用組織勻漿機研磨（50 Hz，5 min）；研磨之后離心10 min（3 000 r/min），吸取上清液，超聲波裂解3 次，每次10 s，然后離心30 min（12 000 r/min），吸取上清液（全程在冰上進行）；使用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白濃度，配制蛋白樣品時保證20 μL樣品中含80 μg蛋白；12%的SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h；孵育一抗:將硝酸纖維素膜放入相應的抗體孵育盒中（Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase 3抗體按1:1 000的比例稀釋），搖床上4 ℃環(huán)境下孵育過夜；孵育二抗:一抗孵育結束之后，將膜用TBST漂洗3次，每次5 min，再將膜轉(zhuǎn)入二抗孵育盒，放于搖床上，室溫孵育2 h；曝光:二抗孵育結束之后，將顯色液均勻敷在膜上，在凝膠成像儀上曝光成像；圖像分析:利用Image Lab3.0軟件對曝光結果進行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 使用GraphPad Prism 7.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)以s 表示，每組實驗均重復進行3次，多組比較采用單因素方差分析，采用廣義線性混合模型分析BBB評分的組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Vilda促進大鼠SCI后運動功能的恢復 大鼠建模成功后，BBB評分為0分，僅依靠前肢拖行，爬行時身體不穩(wěn)易傾斜、轉(zhuǎn)圈，隨著時間的推移，SCI組與SCI+Vilad組大鼠BBB評分開始提升，但SCI+Vilad組大鼠BBB評分的提升較SCI組更為顯著，從術后第14天開始，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1A；從足印跡步態(tài)分析實驗結果來看，在術后第28天，與SCI組大鼠相比，SCI+Vilad組大鼠后肢運動功能恢復得更好，步態(tài)更為一致，爬行時身體更穩(wěn)定，后肢動作更為協(xié)調(diào)，見圖1B。

圖1 Vilda促進大鼠SCI后運動功能的恢復

2.2 Vilda減少SCI后脊髓前角運動神經(jīng)元的損失

脊髓前角區(qū)域尼氏染色結果顯示，Sham組脊髓組織染色陽性前角運動神經(jīng)元數(shù)量多、分布均勻；SCI組大鼠前角運動神經(jīng)元數(shù)量明顯減少（P ＜0.01），損失嚴重，分布不均勻；而SCI+Vilad組大鼠情況較SCI組大鼠有所改善，前角運動神經(jīng)元數(shù)量增多（P＜0.01），分布較為均勻，見圖2。

2.3 Vilda抑制凋亡相關蛋白的表達 脊髓組織免疫熒光染色結果顯示，術后第3天，與Sham組相比，SCI組脊髓組織內(nèi)凋亡相關蛋白Cleaved Caspase 3的表達增強，而在SCI+Vilad組大鼠中，這種情況得到改善，凋亡相關蛋白Cleaved Caspase 3的表達減弱（見圖3）。Western blot結果顯示，在術后第3天，與Sham組比，SCI組凋亡相關蛋白Bax、Cleaved Caspase 3 的表達明顯上升（P ＜0.01），而Bcl-2蛋白表達明顯下降（P ＜0.01）；而與SCI組相比較，SCI+Vilda組大鼠中Bax蛋白表達明顯下降（P＜0.01），Cleaved Caspase 3蛋白表達也下降（P ＜0.05），而Bcl-2蛋白表達明顯上升（P＜0.05），見圖4。

圖2 Vilda減少SCI后脊髓前角運動神經(jīng)元的損失

3 討論

SCI影響著全世界成千上萬的人，公開的數(shù)據(jù)顯示在美國每年大約新增SCI患者10 000例，主要致病因素包括機動車事故（占36%～48%）、暴力（占5%～29%）、摔倒（占17%～21%）、體育損傷（占7%～16%），并常常伴隨著終身的殘疾以及高昂的治療費用[18-19]。目前，SCI病理過程分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷2個過程已得到普遍認同，其中繼發(fā)性損傷會持續(xù)數(shù)周時間，運動神經(jīng)元凋亡在繼發(fā)性損傷中扮演了重要的角色，并且最終導致肌肉失神經(jīng)性無力和萎縮[20-22]。當前臨床治療SCI的方式主要有手術治療和藥物治療。手術治療指外科手術解除脊髓壓迫、恢復脊柱穩(wěn)定性；藥物治療主要包括糖皮質(zhì)激素沖擊療法減輕過氧化和創(chuàng)傷后炎癥反應，以及一些神經(jīng)營養(yǎng)性藥物（神經(jīng)節(jié)苷脂、利魯唑等），近來低溫療法以及細胞移植療法也在探索中但尚未進入臨床應用[23]。但目前的療法都未能有效逆轉(zhuǎn)運動神經(jīng)元的凋亡，促進運動功能的恢復。因此，探索新的治療策略，抑制脊髓損傷之后運動神經(jīng)元的凋亡，從而促進脊髓損傷后運動功能的恢復是目前研究的熱點。

圖3 Vilda抑制凋亡相關蛋白Cleaved Caspase 3的表達（比例尺:20 μm）

圖4 3組大鼠凋亡相關蛋白相對表達量比較

本研究探討了DPP4抑制劑類降糖藥物Vilda對大鼠脊髓損傷之后神經(jīng)細胞、特別是運動神經(jīng)元細胞凋亡的影響及運動功能恢復的作用。在細胞凋亡過程中，Caspase家族、Bcl-2家族和Bax因子是常被研究的對象，其中Cleaved Caspase 3是凋亡執(zhí)行因子，Bcl-2是凋亡抑制因子，Bax是凋亡促進因子[24-26]。在本研究中，我們采用免疫熒光法和Western blot法檢測凋亡相關蛋白的表達，采用尼氏染色法檢測脊髓中運動神經(jīng)元的存活情況。從結果來看，與Sham組相比，SCI組凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase 3 表達增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2表達減少，在尼氏染色結果中相對應的表現(xiàn)為陽性神經(jīng)元數(shù)目減少且分布不均；而SCI+Vilda組大鼠在接受Vilda干預之后，與SCI組相比較，凋亡蛋白表達減少，凋亡抑制蛋白表達回升，相應的尼氏染色結果顯示陽性神經(jīng)元數(shù)目較SCI組多且分布較為均勻。這些結果提示大鼠SCI之后應用Vilda干預之后，脊髓運動神經(jīng)元的凋亡減弱，存活情況得到改善，并且提示這種作用與Caspase 3凋亡通路的調(diào)控相關。伴隨著脊髓運動神經(jīng)元凋亡的抑制，脊髓損傷后大鼠的運動功能也得到了改善，與SCI組相比，SCI+Vilad組大鼠的BBB評分顯著升高，足印跡步態(tài)顯示用藥干預后的SCI+Vilad組大鼠表現(xiàn)為更加一致、穩(wěn)定、協(xié)調(diào)的步態(tài)，提示經(jīng)Vilda治療后，伴隨著運動神經(jīng)元凋亡的抑制以及數(shù)目的恢復，SCI后大鼠的運動功能得到顯著恢復。

綜上所述，Vilda在大鼠SCI中表現(xiàn)出神經(jīng)保護作用，這種作用與Vilda可抑制神經(jīng)細胞凋亡有關，并最終促進大鼠SCI后運動功能的恢復。