韓影，王晨晨，王玉環(huán)，葉艷，閆洪濤，楊新軍

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生與管理學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 產(chǎn)科，浙江 溫州 325027）

巨大兒是指出生體質(zhì)量≥4 000 g的活產(chǎn)新生兒[1]。近年來(lái)，全球的巨大兒發(fā)生率均呈上升趨勢(shì)[2-3]。巨大兒的發(fā)生不僅會(huì)增加肩難產(chǎn)等產(chǎn)科問(wèn)題[4]，而且會(huì)增加其成年后患糖尿病、肥胖等代謝性疾病的風(fēng)險(xiǎn)[5-6]。目前國(guó)內(nèi)外的研究多關(guān)注妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）巨大兒，而非GDM巨大兒發(fā)生的原因和機(jī)制仍不清楚[7]。已知長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸（long-chain polyunsaturated fatty acid，LCPUFA）對(duì)胎兒的發(fā)育具有重要作用，而且由于胎兒合成LCPUFA的能力有限，主要依靠胎盤(pán)從母體轉(zhuǎn)運(yùn)給胎兒[8-9]。胎盤(pán)過(guò)度轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸會(huì)導(dǎo)致胎兒脂質(zhì)水平異常，這可能是產(chǎn)生巨大兒或大于胎齡兒（large for gestational age，LGA）的原因之一[10]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸轉(zhuǎn)位酶在巨大兒胎盤(pán)中表達(dá)上調(diào)[11]，胎盤(pán)質(zhì)膜脂肪酸結(jié)合蛋白（plasma membrane fatty acid-binding protein，F(xiàn)ABPpm）與其他膜蛋白相比，對(duì)LCPUFA具有更高的親和力，它能夠優(yōu)先攝取LCPUFA，且由于其只在胎盤(pán)母體面表達(dá)，更有利于LCPUFA從母體到胎兒的單向流動(dòng)[12-13]。那么在非GDM巨大兒發(fā)生中，是否有胎盤(pán)FABPpm表達(dá)改變，影響胎盤(pán)脂肪酸過(guò)度轉(zhuǎn)運(yùn)尚不清楚。因此，本研究擬探討胎盤(pán)FABPpm基因表達(dá)水平與巨大兒發(fā)生的關(guān)系，為非GDM巨大兒的發(fā)生機(jī)制提供新的線索。

1 資料和方法

1.1 一般資料 連續(xù)收集2015年6月至2016年6月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院產(chǎn)科進(jìn)行常規(guī)產(chǎn)前檢查并分娩的產(chǎn)婦及單胎足月新生兒作為研究對(duì)象。巨大兒組為出生體質(zhì)量≥4 000 g的新生兒；對(duì)照組為隨機(jī)選擇的出生體質(zhì)量2 500～3 999 g且與巨大兒分娩時(shí)間相差3 d以內(nèi)的新生兒。入選標(biāo)準(zhǔn):正常妊娠、單胎、足月分娩，糖耐量試驗(yàn)正常，新生兒無(wú)先天畸形。排除標(biāo)準(zhǔn):有妊娠合并癥者（如糖尿病、高血壓、心臟病等）；有妊娠并發(fā)癥（如胎盤(pán)異常、先兆子癇等）和新生兒先天畸形。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有產(chǎn)婦均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集:采用自行設(shè)計(jì)的調(diào)查表收集產(chǎn)婦和新生兒的基本信息，內(nèi)容包括產(chǎn)婦年齡、身高、孕前體質(zhì)量、孕前BMI、孕期體質(zhì)量增加值、分娩方式、新生兒出生體質(zhì)量及其他相關(guān)信息。

1.2.2 樣品采集與處理:胎兒娩出后采用無(wú)菌注射器抽取臍靜脈血10 mL，室溫靜置1 h，3 000 r/min離心20 min，將上層血清轉(zhuǎn)移至5 mL凍存管中；胎盤(pán)娩出后，立即取胎盤(pán)母體側(cè)滋養(yǎng)層組織1 cm3，放入經(jīng)DEPC處理過(guò)的凍存管中，加入RNAlater（美國(guó)Ambion公司）保存。采集的樣品液氮運(yùn)輸，并保存于-80 ℃冰箱待測(cè)。

1.2.3 胎盤(pán)RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和qPCR檢測(cè):用TRIzol法提取胎盤(pán)總RNA，反轉(zhuǎn)錄后采取qPCR法測(cè)定胎盤(pán)FABPpm表達(dá)水平，選取GAPDH作為內(nèi)參基因。所用引物序列如下:FABPpm上游:5'-GGAAGGAAATAGC AACAGTGG-3'，下游:5'-TCCTACACGCTCACCATATAAGC-3'，產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為191 bp；GAPDH上游:5'-CATGAGA AGTATGACAACAGCCT-3'，下游:5'-AGTCCTTCCACGATAC CAAAG-3'，產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為113 bp。qPCR反應(yīng)條件為:95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)熔解曲線與瓊脂糖凝膠電泳分析，以保證產(chǎn)物的特異性。最后采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)胎盤(pán)組織中FABPpm表達(dá)水平:取胎盤(pán)組織用PBS洗滌2次，棄上清，加入RIPA裂解液裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整濃度一致，蛋白變性后-20 ℃保存。經(jīng)SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，兔抗人抗體一抗（美國(guó)Abcam公司）1:2 000孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次每次10 min，用山羊抗兔二抗（美國(guó)Abcam公司）1:5 000常溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液顯色，用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，采用Quantity one凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)圖像中蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析。

1.2.5 臍血游離脂肪酸（nonestesterified fatty acid，NEFA）水平檢測(cè):采用銅試劑比色法檢測(cè)，試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 問(wèn)卷調(diào)查資料和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)一錄入EpiData 3.1數(shù)據(jù)庫(kù)，運(yùn)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料如呈正態(tài)分布，則以形式表示，若非正態(tài)分布用M（P25，P75）表示。計(jì)量資料采用成組t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)。采用logistic回歸分析巨大兒的影響因素，以O(shè)R（95%CI）來(lái)估計(jì)各因素對(duì)巨大兒發(fā)生的危險(xiǎn)程度。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 2組間新生兒性別、分娩方式、孕期體質(zhì)量增加和新生兒出生體質(zhì)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其他因素如產(chǎn)婦年齡、孕前體質(zhì)量、身高、孕前BMI、孕周、初產(chǎn)婦的比例在2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 2組產(chǎn)婦及新生兒的基本特征比較（每組n=40）

圖1 2組胎盤(pán)組織中FABPpm mRNA表達(dá)

2.2 胎盤(pán)FABPpm mRNA表達(dá) qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，巨大兒組FABPpm mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.519，P=0.012），見(jiàn)圖1。進(jìn)一步按照性別分層分析顯示，在男性新生兒中，巨大兒組FABPpm mRNA表達(dá)量為1.33（1.02，1.78），高于對(duì)照組的1.03（0.91，1.23），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.176，P＜0.001）；而在女性新生兒中，2組表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[1.16（0.69，1.64） vs. 0.95（0.79，1.14），P＞0.05）]。

2.3 胎盤(pán)FABPpm蛋白表達(dá)水平 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示巨大兒組FABPpm的蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-3.769，P=0.002），見(jiàn)圖2。

2.4 2組新生兒臍血NEFA濃度比較及與FABPpm的mRNA表達(dá)的相關(guān)性 2組新生兒臍血中NEFA的含量測(cè)定結(jié)果顯示，巨大兒組為（274.72±138.08）μmol/L，低于對(duì)照組的（364.07±184.05）μmol/L（P=0.021）。相關(guān)性分析的結(jié)果顯示，胎盤(pán)FABPpm表達(dá)量與臍血NEFA濃度在對(duì)照組中呈正相關(guān)關(guān)系（rs=0.334，P=0.046），但是在巨大兒組中，未觀察到兩者的直線相關(guān)關(guān)系（見(jiàn)圖3）。

圖2 2組胎盤(pán)FABPpm蛋白相對(duì)表達(dá)量

2.5 胎盤(pán)FABPpm mRNA表達(dá)與新生兒出生體質(zhì)量的相關(guān)性 FABPpm mRNA表達(dá)量和新生兒出生體質(zhì)量的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，2組中FABPpm mRNA均與出生體質(zhì)量呈正相關(guān)，見(jiàn)圖4。

2.6 巨大兒發(fā)生的影響因素分析 采用多因素logistic回歸模型，對(duì)影響巨大兒發(fā)生的因素進(jìn)行篩選與分析。以是否是巨大兒為因變量，其他因素如新生兒性別、孕期體質(zhì)量增加、FABPpm mRNA表達(dá)量等為自變量進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析。各自變量賦值情況為:①胎兒性別:女=0，男=1。②孕期體質(zhì)量增加:正常=0，不足=1，過(guò)多=2，孕期體質(zhì)量增加的分類依據(jù)是美國(guó)醫(yī)學(xué)研究所針對(duì)不同孕前BMI的孕婦推薦的孕期體質(zhì)量增加適宜范圍[14]:孕前BMI＜18.5 kg/cm2為12.5～18 kg；孕前BMI=18.5～24.9 kg/cm2為11.5～16 kg；孕前BMI=25.0～29.9 kg/cm2為7～11.5 kg；孕前BMI≥30 kg/cm2為5～9 kg。低于推薦范圍為體質(zhì)量增加不足，在推薦范圍之內(nèi)的為正常，超過(guò)推薦范圍的為體質(zhì)量增加過(guò)多。③FABPpm:低于中位數(shù)=0，高于中位數(shù)=1。④NEFA:低于中位數(shù)=0，高于中位數(shù)=1。在控制了新生兒性別、孕期體質(zhì)量增加等因素之后，胎盤(pán)FABPpm mRNA的表達(dá)升高可增加巨大兒發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，且與胎兒性別、孕期體質(zhì)量增加過(guò)多共同影響巨大兒的發(fā)生，見(jiàn)表2。

圖3 2組胎盤(pán)FABPpm mRNA表達(dá)量與臍血NEFA濃度的相關(guān)性

圖4 胎盤(pán)FABPpm基因mRNA表達(dá)水平與新生兒出生體質(zhì)量的相關(guān)性分析

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)在巨大兒胎盤(pán)中FABPpm mRNA和蛋白均呈現(xiàn)高表達(dá)。FABPpm表達(dá)量與臍血NEFA濃度在對(duì)照組呈正相關(guān)，而在巨大兒組未顯示有意義的相關(guān)關(guān)系。多因素logistic回歸分析控制相關(guān)混雜因素后，F(xiàn)ABPpm高表達(dá)的OR仍然具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示胎盤(pán)FABPpm表達(dá)上調(diào)可增加非GDM巨大兒發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，其可能是通過(guò)影響了胎盤(pán)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)而影響巨大兒發(fā)生。

已知胎盤(pán)作為連接母體與胎兒的橋梁，負(fù)責(zé)將對(duì)胎兒發(fā)育必須的脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輸送到胎兒體內(nèi)。胎盤(pán)FABPpm可通過(guò)加速攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化LCPUFA來(lái)調(diào)節(jié)胎盤(pán)脂肪酸代謝過(guò)程[15-17]。那么巨大兒胎盤(pán)FABPpm基因mRNA和蛋白水平都呈高表達(dá)，可使巨大兒的胎盤(pán)具有相對(duì)更高的能力攝取并轉(zhuǎn)運(yùn)母體脂肪酸給胎兒。當(dāng)大量脂肪酸在胎兒體內(nèi)以脂肪形式沉積，便容易獲得更多的身體脂肪和更大的體質(zhì)量。另外，我們發(fā)現(xiàn)在男性新生兒中，巨大兒胎盤(pán)中FABPpm表達(dá)量高于對(duì)照組，而女性新生兒中，2組并無(wú)差異，這可能是由于男性新生兒比女性新生兒對(duì)脂肪酸有更高的需求[18]，使得男性巨大兒胎盤(pán)代償性地表達(dá)更多的FABPpm，才能攝取更多的脂肪酸以滿足胎兒的需求。這也可能部分地解釋了巨大兒男嬰多于女?huà)氲默F(xiàn)象。

本研究發(fā)現(xiàn)NEFA在巨大兒臍血中含量降低，且對(duì)照組胎盤(pán)FABPpm表達(dá)與臍血NEFA濃度呈正相關(guān)關(guān)系，但在巨大兒組兩者并未發(fā)現(xiàn)有意義的相關(guān)性。該結(jié)果提示我們，除了胎盤(pán)的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)之外，可能還有其他的因素影響胎兒臍血NEFA的含量。如有研究報(bào)道在巨大兒臍血中含有更高的胰島素[19]，而胰島素的高表達(dá)能夠促進(jìn)脂肪酸的再酯化，使得巨大兒臍血中NEFA含量降低。另一個(gè)可能的影響因素是，巨大兒對(duì)脂肪酸的需求比正常胎兒更高，大量脂肪酸被巨大兒用于合成自身脂肪并沉積。由于這些影響因素的存在，所以即使上調(diào)的FABPpm攝取并轉(zhuǎn)運(yùn)更多的脂肪酸給巨大兒，但是其臍血中NEFA含量卻不高，且在巨大兒組中并未觀察到FABPpm與NEFA的直線相關(guān)關(guān)系。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，胎盤(pán)FABPpm表達(dá)量與出生體質(zhì)量在2組中均呈正相關(guān)關(guān)系。這說(shuō)明了胎盤(pán)FABPpm的表達(dá)會(huì)增加胎盤(pán)對(duì)脂肪酸的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)[15-17]，使胎兒獲得更多的用于脂肪合成的原料，造成體內(nèi)更多的脂肪沉積，因此出生體質(zhì)量會(huì)增加。

本研究分析獲得的其他影響巨大兒發(fā)生的相關(guān)因素與以往的研究結(jié)果相一致[20]，男性胎兒和孕期體質(zhì)量增加過(guò)多都會(huì)增加巨大兒的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。在控制了混雜因素之后，胎盤(pán)FABPpm mRNA高表達(dá)仍然會(huì)增加巨大兒發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，提示FABPpm作為重要調(diào)節(jié)因子可能通過(guò)影響巨大兒脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)而參與巨大兒的形成。

表2 巨大兒發(fā)生的影響因素

本研究也存在不足之處。首先，該研究是一項(xiàng)病例對(duì)照研究，不能評(píng)估各因素與巨大兒發(fā)生的因果關(guān)系。其次，由于研究的樣本量有限，多因素分析模型中危險(xiǎn)度估計(jì)的可信區(qū)間較寬，可能會(huì)影響估計(jì)的精確性。因此，進(jìn)一步的研究需要增加樣本量，并通過(guò)細(xì)胞模型和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型探討脂肪酸在胎盤(pán)中轉(zhuǎn)運(yùn)的具體機(jī)制，從而幫助我們深入了解胎盤(pán)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝相關(guān)蛋白在巨大兒發(fā)生中的作用。

綜上所述，胎盤(pán)FABPpm mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，會(huì)增加巨大兒發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。提示可能是由于FABPpm參與了胎盤(pán)脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)從而調(diào)節(jié)新生兒出生體質(zhì)量，進(jìn)而影響巨大兒發(fā)生。該結(jié)果為探索非GDM巨大兒發(fā)生機(jī)制提供了新的線索。