劉 佳，董 旭，郭 華，王 嫚，申剛義

(中央民族大學(xué) 藥學(xué)院,民族醫(yī)藥教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中央民族大學(xué))，北京 100081)

固定化酶微反應(yīng)器作為一種微型生化反應(yīng)工具，具有樣品用量少、催化效率高、可重復(fù)利用、易功能化組裝等優(yōu)勢(shì)，在蛋白質(zhì)酶解、生物傳感器、抑制劑篩選等領(lǐng)域得到了廣泛研究和應(yīng)用[1-3]。而將固定化酶微反應(yīng)器和高效分離技術(shù)在線(xiàn)聯(lián)用，可實(shí)現(xiàn)酶解-分離-鑒定一體化平臺(tái)操作，顯著提速研究周期。目前，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者對(duì)固定化酶微反應(yīng)器在線(xiàn)高效分離技術(shù)進(jìn)行了大量研究[4-7]。如Zhang等將胰蛋白酶微反應(yīng)器與μPRLC-ESI-MS/MS聯(lián)用，構(gòu)建了一個(gè)集在線(xiàn)蛋白變性、還原、酶解、分離、檢測(cè)于一體的蛋白質(zhì)分析平臺(tái)[4]。相對(duì)于其他分離技術(shù)，以毛細(xì)管為反應(yīng)及分離通道的毛細(xì)管電泳酶微反應(yīng)器因制作簡(jiǎn)便、分離效率高、易于聯(lián)用而優(yōu)勢(shì)明顯。研究者將固定化酶微反應(yīng)器與毛細(xì)管電泳在線(xiàn)耦合，開(kāi)展了從中藥材中篩選酶抑制劑的研究[7-8]。本課題組也基于毛細(xì)管電泳酶微反應(yīng)器，測(cè)定了吉非替尼對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體的抑制率[8]。毛細(xì)管電泳酶微反應(yīng)器主要由酶微反應(yīng)器和毛細(xì)管分離通道兩部分構(gòu)成。不同的固酶基質(zhì)對(duì)酶微反應(yīng)器的性能有很大影響。而不同的毛細(xì)管電泳分離模式也直接影響后續(xù)樣品的分離效率。因此開(kāi)發(fā)新型固酶基質(zhì)和電泳分離介質(zhì)對(duì)于提高毛細(xì)管電泳酶微反應(yīng)器性能至關(guān)重要。

近年來(lái)，納米材料作為固酶基質(zhì)和分離介質(zhì)逐漸受到研究者的青睞[9-10]，其中石墨烯(Graphene)作為新型納米材料[11-12]廣受關(guān)注。石墨烯大的比表面積能增加固酶量，而高電導(dǎo)率可促進(jìn)酶的催化效率[13]。此外，基于其良好的穩(wěn)定性以及π-π共軛作用等獨(dú)特物化性質(zhì)，石墨烯作為電色譜固相介質(zhì)可顯著提高分離效率。因此，將石墨烯引入酶微反應(yīng)器-毛細(xì)管電泳技術(shù)中，制備石墨烯基質(zhì)的固定化酶微反應(yīng)器-毛細(xì)管電色譜，既能簡(jiǎn)化制作方法，還將提高該技術(shù)的整體性能。

雖然石墨烯作為毛細(xì)管的固酶基質(zhì)已有研究[13-14]，但將石墨烯優(yōu)良的固酶性能和分離性能有機(jī)結(jié)合起來(lái)提高毛細(xì)管電泳酶微反應(yīng)器技術(shù)整體性能鮮見(jiàn)報(bào)道?；诖?，本文以石墨烯衍生物氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)為基質(zhì)，以胰蛋白酶為模型蛋白，通過(guò)層層組裝法制備了毛細(xì)管電色譜胰蛋白酶微反應(yīng)器，對(duì)其性能進(jìn)行了研究，并將其應(yīng)用于中藥材中胰蛋白酶抑制劑(Trypsin inhibitor,TI)的快速篩選。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與樣品

P/ACE MDQ型毛細(xì)管電泳儀(Beckman Coulter公司)，配紫外檢測(cè)器；未涂層熔融石英毛細(xì)管(內(nèi)徑為75 μm，總長(zhǎng)為40 cm，有效長(zhǎng)度30 cm，河北永年銳灃色譜器件有限公司)；XP205型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；pH計(jì)(Sartorius PB-10)；KQ-500B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；NW10VF超純水系統(tǒng)(上海康雷分析儀器有限公司)；RFS100/S傅立葉拉曼光譜儀(Bruker公司)。

GO(片徑50～200 nm，南京先豐納米材料科技有限公司)；牛胰蛋白酶(1∶250，4.0 U/mg，美國(guó)Amresco公司)；N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽(BAEE)、N-苯甲酰-L-精氨酸(BA)、聚乙烯亞胺(PEI，50%水溶液)、芐脒鹽酸鹽(BH)均購(gòu)于阿拉丁試劑上海公司；10種中藥材(北京同仁堂中關(guān)村藥店)；其他化學(xué)試劑(國(guó)藥集團(tuán))除特殊說(shuō)明外均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；所用溶液均經(jīng)0.22 μm尼龍66膜過(guò)濾。

1.2 GO毛細(xì)管電色譜的制備

裸毛細(xì)管內(nèi)壁依次用1 mol/L NaOH、超純水、0.1 mol/L的HCl各沖洗活化20 min，沖洗壓力為20 psi(1 psi=6.9×103Pa)?；罨蟮拿?xì)管用5%(體積分?jǐn)?shù))PEI沖洗20 min使內(nèi)壁帶正電荷，用超純水反向?qū)⑽唇Y(jié)合的PEI沖洗掉。通入0.5 mg/mL的GO(使用前超聲處理0.5 h)，孵化20 min，重復(fù)上述步驟一次，使毛細(xì)管內(nèi)壁帶上負(fù)電荷。用超純水反向?qū)⑽唇Y(jié)合的GO沖洗掉。以上正向沖洗壓力均為5 psi，反向沖洗壓力均為10 psi。

1.3 胰蛋白酶微反應(yīng)器的制備

在GO毛細(xì)管電色譜進(jìn)樣端以0.5 psi的壓力進(jìn)樣10 s注入一段約1 cm長(zhǎng)的5 mg/mL的胰蛋白酶Tris-HCl溶液(50 mmol/L，pH 8.0)。孵化40 min后用Tris-HCl緩沖液反向沖洗10 min，沖洗壓力為10 psi。反應(yīng)器制備完成后于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 藥材提取液的制備

分別準(zhǔn)確稱(chēng)量5.0 g各種中藥材，粉碎，加入100 mL 6 mmol/L NaOH溶液，超聲30 min。然后用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至8.0，再超聲1.5 h，傾入高速離心管中，以16 000 r/min高速離心10 min使之分層，棄去不溶物，取上清液過(guò)0.45 μm尼龍濾膜，濾液于4 ℃保存待用，臨用時(shí)稀釋至所需濃度。

1.5 儀器工作條件

電泳條件：胰蛋白酶微反應(yīng)器毛細(xì)管電色譜柱使用前經(jīng)Tris-HCl緩沖液沖洗10 min，兩次進(jìn)樣間運(yùn)行緩沖液沖洗5 min。樣品進(jìn)樣量為0.5 psi×5 s，分離電壓20 kV，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，實(shí)驗(yàn)溫度25 ℃。系統(tǒng)控制與數(shù)據(jù)處理由32Karat軟件完成。

酶性能測(cè)定條件：不同濃度的BAEE按照上述進(jìn)樣量導(dǎo)入微反應(yīng)器柱端，25 ℃下與固定化胰蛋白酶孵化1 min后分離檢測(cè)，其他條件同上。通過(guò)產(chǎn)物BA峰面積的變化來(lái)計(jì)算酶活。

抑制率測(cè)定條件：10 mmol/L BAEE和5 mmol/L抑制劑BH(或10 mg/mL的中藥材粗提物)的混合液導(dǎo)入胰蛋白酶微反應(yīng)器柱端，于25 ℃下孵化1 min后分離檢測(cè)，其他條件同上。通過(guò)添加抑制劑前后產(chǎn)物BA峰面積的變化來(lái)計(jì)算抑制率：Inhibition(%)=100-(100x/blank);式中，Inhibition(%)為抑制率；blank為加入抑制劑前產(chǎn)物BA的峰面積；x為加入抑制劑后BA的峰面積。

圖1 不同毛細(xì)管的EOF隨pH值(7.0～9.0)的變化Fig.1 The variation of EOF with pH range from 7.0 to 9.0 in different capillaries

圖2 GO修飾毛細(xì)管(a)和裸管(b)的拉曼光譜Fig.2 Raman spectra of the GO-coated capillary(a)and bare capillary(b)

2 結(jié)果與討論

2.1 GO電色譜表征

2.1.1 電滲流選用二甲基亞砜(DMSO)作為電滲流(EOF)標(biāo)記物，以pH 7.0～9.0的Tris-HCl為運(yùn)行緩沖液，測(cè)定了GO毛細(xì)管電色譜的EOF值。結(jié)果如圖1所示，裸管的EOF隨著pH值增大而增大；當(dāng)其表面修飾正電荷的PEI后，EOF反轉(zhuǎn)為負(fù)值；而當(dāng)進(jìn)一步修飾GO后，由于GO表面含有羧基負(fù)離子，使得EOF回歸正向。通過(guò)比較，還可發(fā)現(xiàn)GO修飾的毛細(xì)管EOF穩(wěn)定性在pH 7.0～9.0范圍內(nèi)有明顯改善。

2.1.2 拉曼光譜采用拉曼光譜對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。由圖2可見(jiàn)，毛細(xì)管修飾GO后顯示出了兩個(gè)特征峰D帶(1 335 cm-1)和G帶(1 610 cm-1)，表明GO已成功修飾在毛細(xì)管內(nèi)壁。

2.1.3 穩(wěn)定性分別考察了GO柱在同一天內(nèi)多次測(cè)定(n=5)、多天測(cè)定(n=5)及不同批次GO柱(n=3)電滲流的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于5%，表明所制備的毛細(xì)管電色譜具有良好的穩(wěn)定性。

2.2 分離性能

以胰蛋白酶的底物BAEE和產(chǎn)物BA的混合物為分離對(duì)象，考察GO毛細(xì)管電色譜的分離能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GO毛細(xì)管電色譜分離度(R)為4.71(n=3)，而裸毛細(xì)管為3.70(n=3)。由此可見(jiàn)，GO的引入可使分離效果明顯提高，有望進(jìn)一步應(yīng)用于復(fù)雜化合物的分離。

2.3 酶微反應(yīng)器的性能

在GO毛細(xì)管電色譜的基礎(chǔ)上制備了固定化胰蛋白酶微反應(yīng)器，并考察微反應(yīng)器的性能。

2.3.1 穩(wěn)定性將5 mmol/L BAEE底物通入反應(yīng)器，孵化1 min后進(jìn)行分離檢測(cè)。以產(chǎn)物BA初始峰面積為定量指標(biāo)，考察微反應(yīng)器的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，新制備的微反應(yīng)器前8次峰面積呈波動(dòng)式下降，這可能與未結(jié)合的酶流失有關(guān)。從第9次后趨于穩(wěn)定，RSD為3.8%(n=10)。2日內(nèi)連續(xù)測(cè)定20次RSD為1.8%。不同批次間RSD為2.3%(n=3)。

圖3 孵化時(shí)間對(duì)產(chǎn)物率的影響Fig.3 Effect of incubation time on product BA

2.3.2 孵化時(shí)間考察了反應(yīng)器不同孵化時(shí)間對(duì)酶活的影響(圖3)。結(jié)果顯示，隨著孵化時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)物BA量逐漸增加，表明酶的水解活性提高。當(dāng)孵化時(shí)間達(dá)到8 min后，BA量最大且不再增加。由于孵化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)造成樣品區(qū)帶的擴(kuò)散，不利于分離，且分析時(shí)間也會(huì)延長(zhǎng)，綜合考慮將孵化時(shí)間選為1 min。

2.3.3 酶活性能反應(yīng)器的酶活性能主要通過(guò)米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速率(Vmax)進(jìn)行評(píng)價(jià)。本研究計(jì)算得固定化胰蛋白酶微反應(yīng)器的Km=1.10 mmol/L，Vmax=0.32 mmol·L-1·s-1。同時(shí)，利用靜電作用在裸毛細(xì)管中固定胰蛋白酶，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，固定化酶的Km為109.77 mmol/L，Vmax為0.000 46 mmol·L-1·s-1。對(duì)比可知，采用GO作為固定酶基質(zhì)的固定化酶的Km遠(yuǎn)小于裸管，Vmax遠(yuǎn)大于裸管。表明GO的引入顯著提高了固定化酶的親和力和對(duì)底物的催化活性。原因可能是GO具有獨(dú)特的單原子厚度，其二維的平面結(jié)構(gòu)提供了極大的比表面積，可以用來(lái)負(fù)載大量的各種分子，將其作為固酶載體，利于胰蛋白酶的固定。并且表面含有豐富的含氧基團(tuán)，有利于提高酶的固載量，從而改善了酶微反應(yīng)器的性能。

2.4 實(shí)際應(yīng)用

胰蛋白酶抑制劑(TI)是對(duì)胰蛋白酶具有抑制作用的一類(lèi)物質(zhì)，臨床上廣泛用于治療胰腺炎、休克和腦外科、手術(shù)止血、腫瘤等。利用胰蛋白酶作為篩選TI的靶標(biāo)，從中藥材提取物中篩選出活性藥物具有非常重要的意義。本研究將所制備的酶微反應(yīng)器用于實(shí)際藥材中TI活性成分的篩選。圖4為已知抑制劑BH和三七粗提液添加前后對(duì)胰蛋白酶抑制的電泳分離圖。從圖4A可知，加入BH后產(chǎn)物BA峰面積與未加前相比明顯降低，而底物BAEE峰面積則相對(duì)增大。表明BH的加入有效抑制了胰蛋白酶對(duì)BAEE的水解。三七也有類(lèi)似的結(jié)果(圖4B)。

表2列出了對(duì)市售10種中藥材的篩選結(jié)果，發(fā)現(xiàn)三七、大黃對(duì)胰蛋白酶有抑制作用，其它中藥材則無(wú)抑制，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[15-16]，表明該方法可以用于藥材中酶抑制劑的快速篩選。抑制率計(jì)算結(jié)果與文獻(xiàn)中存在差異主要是由于孵化溫度的不同導(dǎo)致。

SampleInhibition(%)SampleInhibition(%)Pseudo-ginseng(三七)26Phellodendron(黃柏)0FreshRehmanniaeRadix(鮮地黃)0Rheumofficinale(大黃)26.12Radixangelicaesinensis(當(dāng)歸)0Atractylodesmacrocephala(白術(shù))0BH53.5Codonopsispilosula(黨參)0Lonicerajaponica(金銀花)0Scropularianingpoensis(玄參)0Dioscoreaopposita(山藥)0

3 結(jié) 論

本文基于GO兼具良好的分離能力和固酶性能，構(gòu)筑了GO功能化的毛細(xì)管電色譜胰蛋白酶微反應(yīng)器，并利用該反應(yīng)器從10種中藥材中篩選出2種有胰蛋白酶抑制劑成分的中藥材(三七和大黃)。該研究既為毛細(xì)管電泳酶微反應(yīng)器的制備方法拓展了思路，也為酶抑制劑篩選快速提供了一種簡(jiǎn)便的技術(shù)。