劉海培,姜小梅,韓文念，許舒欣，李 艷，汪 曣，蔣學(xué)慧*

(1.天津大學(xué) 精密儀器與光電子工程學(xué)院，天津 300072；2.天津國科醫(yī)工科技發(fā)展有限公司，天津 300399)

維生素是維持人體健康所必需的物質(zhì)，其缺乏或過量均會影響人體代謝平衡。其中，維生素A(VA)、維生素D3(VD3)、維生素E(VE)為脂溶性維生素，具有促進(jìn)機(jī)體生長發(fā)育，調(diào)節(jié)生理機(jī)能，增強(qiáng)免疫的作用[1]，可在體內(nèi)大量貯存，屬于人體內(nèi)源性代謝物。通過檢測維生素的含量可評估患者體內(nèi)的營養(yǎng)狀況，目前的測定方法主要有酶免疫法[2]、化學(xué)發(fā)光免疫法[3]及質(zhì)譜法等。其中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法[4-5]具有高精確度、高靈敏度和可實(shí)時監(jiān)測的優(yōu)勢，對于維生素缺乏的臨床判斷、治療管理具有輔助診斷的作用[6-7]。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)用于內(nèi)源性代謝物的實(shí)際分析時，真實(shí)的生物基質(zhì)(Authentic matrix)中含有的待測物質(zhì)會影響標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度，從而影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性[8-9]。目前常采用牛血清白蛋白(BSA)等替代基質(zhì)(Surrogate matrix)[10-11]來模擬生物基質(zhì)，或采用活性炭吸附等前處理手段從真實(shí)生物基質(zhì)中得到已去除內(nèi)源性代謝物的剝離基質(zhì)(Stripped matrix)[12]。然而此方法成本高，且可能破壞除內(nèi)源性代謝物以外的基質(zhì)成分或者內(nèi)源性代謝物去除不完全，影響樣本原有信息，從而導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)問題[13-14]。另外一些新開發(fā)的方法無法找到合適的空白基質(zhì)，給定量分析增加了難度。

本研究利用LC-MS/MS對人體血清中維生素A、維生素D3和維生素E 3種脂溶性維生素進(jìn)行同時檢測，以混合人血清基質(zhì)中加入標(biāo)準(zhǔn)品并結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，通過對內(nèi)源性代謝物本底扣除的方法，解決了模擬基質(zhì)下檢測的標(biāo)準(zhǔn)品與待測基質(zhì)不匹配的問題，并與BSA模擬基質(zhì)方法的檢測結(jié)果進(jìn)行對比。所建立的方法適用于人體內(nèi)源性代謝物的快速準(zhǔn)確分析，可滿足臨床對于相關(guān)疾病的診斷需求。

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AX液相色譜儀(島津公司)，API4000三重四極桿質(zhì)譜儀(AB SCIEX公司)，F(xiàn)138469O離心機(jī)(Eppendorf公司)，VORTEX-5旋渦混合器(其林貝爾儀器公司)，96孔氮吹儀(VSD150-1A,無錫沃信儀器制造有限公司)，微量移液器(N32901F、N46632F、P24390G、O47528F,Eppendorf公司)，離心管(3810X,Eppendorf公司)。

甲醇、乙腈、甲酸(色譜純，F(xiàn)isher Chemical公司)；正己烷(色譜純,Sigma-Aldrich公司)；牛血清白蛋白(Amresco公司)，蒸餾水(屈臣氏集團(tuán)有限公司)。

維生素A(100 mg/L)、25-羥基維生素D3干粉試劑以及維生素E(1 000 mg/L)標(biāo)準(zhǔn)品均購于加拿大多倫多研究化學(xué)公司，維生素A乙酸酯(VA-D6)、25-羥基維生素D3-D6干粉試劑(VD3-D6)、α-生育酚D6(VE-D6,500 mg/L)內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品均購于Medical Isotopes公司。

1.2 實(shí)驗條件

色譜條件：色譜柱為Shim-pack GIST-HP C18(2.1 mm×100 mm×3 μm，島津公司)，流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸甲醇溶液，梯度洗脫程序：0～2.0 min，70% B；2.0～5.0 min，70% ～100% B；5.0～5.1 min，100% B；5.1～6.5 min，100%～70%B。流速為0.5 mL/min，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描模式，氣簾氣(CUR)壓力 103 kPa，離子化電壓(IS) 5 500 V，溫度(TEM)設(shè)為350 ℃，噴霧氣(GS1)壓力 414 kPa，輔助加熱氣(GS2)壓力 448 kPa。3種脂溶性維生素的質(zhì)譜參數(shù)見表1，選取Q1質(zhì)量數(shù)為母離子，Q3質(zhì)量數(shù)為子離子進(jìn)行定量分析。

表1 3種脂溶性維生素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of three fat-soluble vitamins

*DP:declustering potential;CE:collision energy;CXP:collision cell exit potential;EP:entrance potential

1.3 樣品配制

1.3.1 空白樣品制備取90 μL混合人血清，加入10 μL甲醇和10 μL內(nèi)標(biāo)工作液得到空白基質(zhì)樣品，取牛血清白蛋白(5% BSA)按相同步驟得到空白基質(zhì)樣品，作為對照。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)樣品制備稱取標(biāo)準(zhǔn)樣品，采用甲醇逐級稀釋得到標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。分別精密吸取90 μL混合人血清和5% BSA，各加入標(biāo)準(zhǔn)工作溶液10 μL，配制各濃度的生物標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，加入10 μL內(nèi)標(biāo)工作液以及200 μL甲醇-乙腈(體積比1∶1)作為沉淀劑，渦旋振蕩60 s；再加入600 μL正己烷作為萃取劑，劇烈振蕩120 s；以14 000 g轉(zhuǎn)速離心5 min，取上層有機(jī)層500 μL，室溫下氮?dú)獯蹈桑尤?0%甲醇水溶液100 μL進(jìn)行復(fù)溶，充分混勻30 s后，待LC-MS/MS分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

分別采用混合人血清基質(zhì)和BSA基質(zhì)配制已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品與未知濃度的待測樣品，在相同實(shí)驗條件下依次進(jìn)行LC-MS/MS檢測，得到每組樣品的信號色譜峰及其對應(yīng)的內(nèi)標(biāo)峰面積。其中，混合人血清基質(zhì)作為空白基質(zhì)樣品，平行進(jìn)樣8組，確定空白背景的穩(wěn)定性。計算得到混合人血清空白基質(zhì)樣品的色譜峰與其對應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積比值，在混合人血清基質(zhì)下得到的標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜峰與其對應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積的比值減去空白樣品比值的平均值，即通過本底扣除的方法去除人體內(nèi)源性代謝物引入的干擾。所得結(jié)果與傳統(tǒng)BSA模擬基質(zhì)樣品的測定結(jié)果進(jìn)行對比，采用同位素內(nèi)標(biāo)法分別建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對定量分析結(jié)果進(jìn)行比較。

1.5 方法評價

1.5.1 線性范圍與檢出限將配制的生物標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品經(jīng)前處理后進(jìn)樣分析，以目標(biāo)分析物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，其峰面積與對應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)(Y)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]；以3倍信噪比(S/N=3)，且3次測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于20%作為各成分的檢出限(LOD)，以S/N=10且RSD小于20%作為各成分的定量下限(LOQ)。

1.5.2 準(zhǔn)確度與精密度通過比較混合人血清基質(zhì)和BSA基質(zhì)樣品的加標(biāo)回收率，確定實(shí)驗方法的準(zhǔn)確性。對待測人血清樣品加入低、高兩個濃度的3種脂溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)品，分別帶入混合人血清基質(zhì)和BSA基質(zhì)下建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品回收率；每天對加標(biāo)樣品測定1次，連續(xù)檢測5 d，通過計算RSD值驗證兩種方法的重現(xiàn)性。

此外，對于混合人血清空白基質(zhì)樣品做8組平行樣，每個平行樣重復(fù)進(jìn)樣2次求得平均值，批間實(shí)驗每組采用不同混合人血清，以去除人員個體間差異的影響，連續(xù)檢測5 d。通過計算RSD值確保混合人血清空白基質(zhì)樣品批內(nèi)、批間的穩(wěn)定性。

1.5.3 方法對比對于40組未知濃度樣本，通過采用混合人血清基質(zhì)和BSA模擬基質(zhì)的方法分別進(jìn)行LC-MS/MS檢測，利用兩種方法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算得到3種待測維生素的濃度，并進(jìn)行對比和統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

考察了有機(jī)相溶劑(甲醇、乙腈、甲醇-乙腈混合溶劑)分別與超純水、0.1%甲酸、0.1%氨水組成的流動相體系對于3種脂溶性維生素峰形及分離效果的影響，結(jié)果表明，以甲醇和超純水為流動相體系，并在兩相中分別加入0.1%甲酸，可增加分析物的響應(yīng)強(qiáng)度，且峰形良好。根據(jù)3種脂溶性維生素的疏水特性，選擇C18柱，考察了色譜柱溫度(30、35、40、45 ℃)對分離效果和信號強(qiáng)度的影響，最終采用“1.2”的梯度洗脫方式，在40 ℃柱溫下可得到較好的分離效果。

根據(jù)目標(biāo)分析物的電離情況，選用正離子監(jiān)測模式進(jìn)行一級質(zhì)譜分析，確定母離子后再進(jìn)行二級質(zhì)譜的子離子掃描分析，選擇強(qiáng)度較高的1個碎片離子作為定量分析的子離子，并對去簇電壓(DP)、碰撞能(CE)以及碰撞室出口電壓(CXP)等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。最終確定優(yōu)化的質(zhì)譜條件如“1.2”所示，此時檢測信號響應(yīng)強(qiáng)度高，譜峰峰形良好且穩(wěn)定。

在優(yōu)化實(shí)驗條件下，得到3種脂溶性維生素在混合人血清基質(zhì)下的譜峰及其內(nèi)標(biāo)峰的色譜圖(見圖1)，其中維生素A、維生素D3、維生素E及對應(yīng)內(nèi)標(biāo)的保留時間分別為3.45、3.33、4.65 min，可在5 min內(nèi)完成分離檢測，譜峰峰形良好。

2.2 本底穩(wěn)定性

按照“1.5.2”方法對混合人血清空白基質(zhì)樣品進(jìn)行日內(nèi)、日間精密度的測試，對待測維生素的峰面積及其內(nèi)標(biāo)的峰面積進(jìn)行提取，計算兩者的比值，每天做8組平行樣品，得到3種脂溶性維生素的日內(nèi)RSD均不大于8.4%；每天采用不同20份混合人血清空白基質(zhì)進(jìn)行測定，連續(xù)檢測5 d，得到3種脂溶性維生素的日間RSD均在15% 以內(nèi)，表明混合人血清空白基質(zhì)樣品穩(wěn)定，可對混合人血清基質(zhì)的實(shí)際樣品本底進(jìn)行背景扣除。

2.3 線性范圍、檢出限及定量下限

按照“1.5.1”進(jìn)行曲線擬合，結(jié)果顯示，采用混合人血清經(jīng)背景扣除后建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線與BSA基質(zhì)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對于3種脂溶性維生素的相關(guān)系數(shù)(r)均在0.996以上，維生素A、維生素D3和維生素E分別在0.05～2 μg/mL、5～200 ng/mL、1～40 μg/mL范圍內(nèi)具有良好線性。采用混合人血清基質(zhì)所建方法對維生素A、維生素D3和維生素E的LOD分別為4.2、0.8、67.2 ng/mL，LOQ分別為13.7、2.6、221.9 ng/mL；采用BSA基質(zhì)所建方法對維生素A、維生素D3和維生素E的LOD分別為5.6、1.1、75.0 ng/mL，LOQ分別為18.7、3.7、250.0 ng/mL。兩種方法對3種脂溶性維生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線對比見圖2，結(jié)果顯示，兩種方法的擬合效果顯著接近。

圖2 維生素A(A)、維生素D3(B)、維生素E(C)的標(biāo)準(zhǔn)曲線對比Fig.2 Comparison of standard curve of vitamin A(A),vitamin D3(B) and vitamin E(C)BSA matrix;mixed human serum matrix

2.4 加標(biāo)回收實(shí)驗

按照“1.5.2”方法對待測人血清樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗，每個濃度水平重復(fù)5次，兩種方法計算得到維生素A、維生素D3和維生素E的回收率為90.7%～112%，RSD均為1.0%～4.5%(見表2)，表明兩種方法均具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。連續(xù)5 d對低、高兩個濃度的加標(biāo)樣品進(jìn)行測定，兩種方法下3種脂溶性維生素在低濃度水平的加標(biāo)回收率偏差均在±20%以內(nèi)，高濃度水平的加標(biāo)回收率偏差在±15%以內(nèi)，滿足方法學(xué)評定要求。

表2 維生素A、維生素D3和維生素E的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations of vitamin A,vitamin D3 and vitamin E

2.5 方法學(xué)比較

對40份健康志愿者的血清樣本進(jìn)行LC-MS/MS測定，分別采用混合人血清空白基質(zhì)加標(biāo)和BSA空白基質(zhì)加標(biāo)的方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣本年齡在29～86歲，其中16名男性，24名女性。對兩種方法的測定結(jié)果進(jìn)行比較，如圖3所示，經(jīng)過T檢驗分析，維生素A、維生素D3和維生素E的P值分別為0.92、0.78、0.93(均大于0.7)，說明兩種方法的計算結(jié)果無顯著差異。結(jié)果表明，40份健康志愿者血清中維生素A、維生素D3和維生素E的質(zhì)量濃度分別為280～1 000 ng/mL、5～28 ng/mL、5～28 μg/mL，且采用混合人血清基質(zhì)對實(shí)際樣品中3種脂溶性維生素的檢測結(jié)果與BSA模擬基質(zhì)的檢測結(jié)果基本重合，進(jìn)一步驗證了本方法的可行性。

圖3 兩種方法檢測濃度對比Fig.3 Detecting concentration comparison of two methods mixed human serum matrix;BSA matrix

3 結(jié) 論

本研究以人體血清中3種脂溶性維生素檢測為例，探討了一種分析人體內(nèi)源性代謝物的新方法，采用以混合人血清作為空白基質(zhì)加入標(biāo)準(zhǔn)品及同位素內(nèi)標(biāo)物再對內(nèi)源性物質(zhì)扣除本底的方法，可以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品與實(shí)際待測樣品基質(zhì)匹配，減少基質(zhì)效應(yīng)的干擾且更加便捷。通過實(shí)驗證明，此方法與采用BSA模擬基質(zhì)加入標(biāo)準(zhǔn)品及同位素內(nèi)標(biāo)物檢測的方法均滿足方法學(xué)評定標(biāo)準(zhǔn)，具有良好的準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性。因此，針對某些內(nèi)源性化合物無法獲得純凈空白基質(zhì)，以及由于模擬基質(zhì)下檢測的標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品基質(zhì)不匹配引起的基質(zhì)效應(yīng)問題，可以采用直接混合人血清扣除本底的方法，實(shí)現(xiàn)對人體內(nèi)源性代謝物的定量分析。研究結(jié)果對于臨床分析檢測具有重要意義。