劉 察，臧穎超，曾惠桃，范夏瓊，張志敏，盧紅梅

(中南大學 化學化學工學院，湖南 長沙 410083)

拉曼光譜技術是一種重要的分析檢測技術，廣泛應用于各種領域，如古文物鑒定、生物蛋白質研究、醫(yī)藥物質檢測、食物安全現(xiàn)場檢測等[1]。該技術無需復雜的樣本預處理，幾乎可以用于任何環(huán)境[2]。拉曼光譜還包含了豐富的物質結構信息，被稱為分子的“指紋圖譜”[3]。采用適當?shù)幕瘜W計量學方法，可獲取隱藏在拉曼光譜中的定性和定量信息，從而實現(xiàn)對待測物質的定性檢測和定量分析。由于常規(guī)拉曼散射光強度約為入射光強度的10-6～10-9，這極大限制了拉曼技術的應用和發(fā)展。表面增強拉曼光譜技術(Surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)利用具有納米級粗糙度表面的金、銀等金屬可將拉曼信號放大一百萬倍的特性[4-5]，設計了一系列金、銀以及復合金屬材料基底以顯著增強物質拉曼信號[6-7]，使得SERS在分子檢測中具有良好的發(fā)展前景。

甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)是一種抑制腫瘤細胞生長的抗葉酸類抗腫瘤藥，可通過抑制二氫葉酸還原酶而降低四氫葉酸的形成并阻斷DNA 的合成，有效抑制滑膜細胞及免疫炎癥細胞的增殖，從而起到免疫抑制、抗炎、抗風濕的作用，主要應用于癌癥的治療。伏立康唑(Voriconazole，VOR)是一種通過抑制真菌中由細胞色素P450介導的14α-甾醇去甲基化，從而抑制麥角甾醇的生物合成的廣譜抗真菌藥，對人和動物的真菌感染均有治療作用。臨床醫(yī)療研究發(fā)現(xiàn)：MTX和VOR兩種藥物不同比例的混用會對小兒腫瘤患者產生強烈的副作用，并嚴重損害小兒腫瘤患者的皮膚。目前拉曼光譜技術可實現(xiàn)對VOR的檢測分析。MTX固體的拉曼光譜圖無法獲取，實驗發(fā)現(xiàn)，低功率的激光照射條件下，MTX物質即出現(xiàn)灼燒情況。在VOR和MTX混合物的拉曼光譜中，VOR的拉曼光譜強度信號極低，難以找到特征拉曼光譜峰進行鑒定分析。而且2種混合物的拉曼光譜存在重疊峰干擾，無法獲得特征光譜而使混合物的定性定量分析困難[8-9]。針對此問題，可采用化學計量學中的信號預處理算法以增強拉曼光譜分辨率，消除基線效應[10-13]。Eiler等則提出一種高效算法，通過平滑分析信號，以實現(xiàn)對峰位置的檢測[14-15]。Zhang等基于小波多分辨的優(yōu)勢，提出了小波空間多尺度峰檢測方法(Multi-scale peak detection，MSPD)[16]，該方法利用小波空間中的脊線、峰谷、零交叉點等信息進行峰位置估計，并通過調整遺傳算法迭代次數(shù)和種群個數(shù)，得到峰位置和峰寬的最優(yōu)解[17]。彭穎等將MSPD方法與SERS技術相結合用于食品中違禁色素檢測，得到很好的實驗結果[18]。

本文針對MTX和VOX混合物快速定性檢測與半定量分析中存在的問題，合成了一種金納米顆粒復合物(AuNPS-PPDA)作為SERS基底，利用SERS技術可獲得MTX和VOX混合物的高質量光譜。針對SERS光譜重疊的問題，本文提出了小波空間特征匹配(Feature matching in wavelet space,FMWS)方法，通過該方法可顯著減輕信號中基線變化和隨機噪聲的影響，從而實現(xiàn)對混合物中目標物質的識別，及定性和半定量分析。

圖1 FMWS算法的流程圖
Fig.1 The procedure of FMWS

1 原 理

本文提出FMWS算法(見圖1)，該方法基于CWT原理進行峰檢測，通過綜合運用小波空間信息可準確檢測特征峰位置，實現(xiàn)對物質的定性檢測。再提取特征峰強、峰面積等信息，基于非負最小二乘算法實現(xiàn)對甲氨喋林和伏立康唑的半定量分析。

1.1 連續(xù)小波變換峰檢測

小波是基于一系列具有連續(xù)可微、零均值等特性的函數(shù)基礎上形成的多尺度信號分析方法，其表達式如下：

(1)

式中，a為尺度因子，b為平移因子。可以看成是信號s(t)與小波函數(shù)Ψ的卷積，定義如下：

(2)

采用如下步驟可以利用CWT將SERS光譜轉換至小波空間，并提取高質量特征：

①小波基的選擇：由分析儀器產生的特征峰有較高的局部特征，色譜信號多為高斯峰，光譜信號多為洛倫茲峰，因此本研究選擇的墨西哥帽函數(shù)具有近似對稱、與高斯峰相似的特點，選擇墨西哥帽小波作為小波函數(shù)；

②小波空間中的脊線、峰谷、零交叉點：在二維小波空間中，脊線、峰谷、零交叉點等重要特征參數(shù)可以很容易被確定；

③峰位置的確定：綜合利用脊線、峰谷、零交叉點可確定峰位置、起始點；

④脊線閾值：通過脊線最大值設置閾值，去除假峰；

⑤峰強與峰面積的提取：通過提取峰強、峰面積等信息，用于后續(xù)小波空間特征匹配。

小波系數(shù)C為二維矩陣，行和列分別代表尺度因子和平移因子。將矩陣C分別平移k，k-1，...1以及-k，-(k-1)，...，-1列，分別作為矩陣kC和矩陣-kC。脊線、峰谷和零交叉點可通過以下的布爾代數(shù)方程得到：

R=(C>-kC)∧(C>-(k-1()C)...(C>k-1C)∧(C>kC)

V=(C<-kC)∧(C<-(k-1)C)...(C

Z=[sgn(c1)⊕sgn(c0),…sgn(cn)⊕sgn(cn-1)]

(3)

R，V，Z為分別包含脊線、峰谷和零交叉點信息的矩陣。取出R中的列計算元素和，如果列求和為0，則這一列沒有脊線，如果列求和大于0，則這列中可能有脊線。然后從小尺度系數(shù)到大尺度系數(shù)增加行值,從初始位置掃描矩陣R。重復提取過程，直至矩陣R最后一行元素值全為0，則說明列中的脊線已經提取完全。若小波系數(shù)大于0，則為單峰。小波系數(shù)小于0，則可能為重疊峰。搜索矩陣V，Z進行雙向搜索。遇到非0值時，作為峰的起止點，將搜索過程中非0值的列保存。在原始信號中，最大值列和最小值列分別對應峰的起止點，其間的最大值列對應峰的位置。

1.2 小波空間特征匹配

HQI是一種正向光譜檢索方法，它以參考物光譜與未知光譜的匹配系數(shù)的大小，決定是否有特征物質存在。其HQI值越大，說明未知光譜與參考物光譜的相似度越高。該方法主要適用于純物質光譜分析，而對混合物光譜，雜峰存在下的未知光譜的匹配則不穩(wěn)健，其HQI值易受雜峰因素的干擾。FMWS算法則不受該因素限制，在檢索未知光譜時，只選取對應特征峰強信息進行匹配，而自動忽略其他雜峰、重疊峰的干擾。其FMWS越接近于1，則說明未知光譜與參考物光譜越接近。

(4)

HL，HU∩L為向量，HU∩L為參考物光譜L與未知物對應的特征峰光譜U。HL，i為參考物光譜第i特征峰的特征匹配系數(shù)，HU∩L為參考物光譜L與未知物光譜U的第i特征匹配系數(shù)。

1.3 非負最小二乘半定量算法

本文研究的混合物光譜，y即為混合物光譜，X為矩陣，矩陣的列代表未知化合物。b為未知化合物在混合物中占比的向量。通過設置閾值可以消除雜質峰譜的干擾，用非負最小二乘算法可以實現(xiàn)對未知混合物組分的半定量分析。統(tǒng)一混合物與光譜庫中可能存在組分的拉曼光譜積分時間，近似計算出混合物的比例。其表達式如下：

min‖y-Xb‖≥0,bi≥0

(5)

式中的非負最小二乘問題可等價于如下二次規(guī)劃問題：

(6)

式中，Q=XTX，c=-XTy。本文基于Lawson和Hanson[19]提出的有效集非負最小二乘方法對混合物中的組分進行半定量分析。

2 實驗部分

2.1 材料與儀器

氯金酸(HAuCl4·3H2O)、檸檬酸鈉，聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)、MTX、VOR(分析純，上海Sigma-Aldrich公司);實驗所用超純水(18.25 MΩ·cm)均來自Milli-Q凈水系統(tǒng)(Bedford,MA,USA)。實驗中未特別指明，均在室溫下進行。

B&W Tek i-Raman拉曼光譜儀(B&W Tek Inc.,Newark,DE,USA)，激發(fā)光源波長為785 nm，激光功率為30 mW;拉曼位移范圍為222～2 478 cm-1;Tescan MIRA 3 XMU SEM(Tescan USA Inc.,Cranberry Township,PA,USA)獲取金納米的微觀形貌圖。

2.2 金納米顆粒的制備

金納米粒子采用經典的檸檬酸鈉還原氯金酸方法制備[20]：將1mL HAuCl4(1 mmol/L)快速加入已煮沸的50 mL 1%檸檬酸鈉溶液中，在100 ℃條件下，磁力攪拌反應20 min，當混合溶液從淺黃色逐漸變?yōu)槊髁恋孽r紅色后，停止反應，將混合液自然冷卻并倒入用錫紙密封的錐形瓶中，完成50 nm的金納米(AuNPS)制備[21]。同樣條件下，將0.6 mL HAuCl4(1 mmol/L)快速加入已煮沸的50mL 1% 檸檬酸鈉溶液中，自然冷卻即得尺寸為70 nm的金納米(AuNPS)。

2.3 AuNPS-PDDA納米復合材料的制備

將1 mL PDDA與9 mL水置于燒杯中超聲處理5 min，使其充分混合后，再量取30 mL AuNPS溶液至燒杯中。40 mL混合液在8 000 r/min轉速離心機下離心15 min，移除上清液，得到2 mL AuNPS-PDDA。

2.4 MTX和VOR混合物的快速SERS檢測

100 μL不同濃度的MTX和VOR樣品與100 μL AuNPS-PDDA混合超聲處理10 min,每次用移液槍移取10 μL混合液緩慢均勻滴于硅膠板上檢測，每1批次滴5個樣品做平行檢測，光譜采集的時間為30 s，即得到MTX和VOR混合物的表面增強拉曼光譜圖。

2.5 MTX和VOR混合物的濃度梯度實驗

取0.1 mg/mL VOR(2.86 ×10-4mol/L)分別與不同MTX濃度(1.0×10-3、1.0×10-4、1.0×10-5、1.0×10-6、1.0×10-7、1.0×10-8mol/L)混合，得到6組混合物。每次移取10 μL樣本滴于硅膠板上進行檢測。

3 結果與討論

3.1 金納米顆粒形貌特征

圖1A、B分別為50 nm和70 nm金納米的掃描電鏡圖。由圖可看出，50 nm的金納米分散均勻，未出現(xiàn)團聚現(xiàn)象，而70 nm的金納米粒子分散不均勻，且出現(xiàn)部分團聚，說明50 nm尺寸的金納米穩(wěn)定性能優(yōu)于70 nm尺寸的金納米，本實驗采用50 nm尺寸的金納米基底進行實驗。

3.2 MTX和VOR的拉曼光譜圖

由圖3可以看出，VOR的常規(guī)拉曼圖譜信號強度較低，只有2 500。借助表面增強拉曼光譜技術，其730 cm-1特征峰的強度值可大于10 000。其中，730 cm-1為季碳的伸縮振動峰，1 050 cm-1為環(huán)內NCN的伸縮振動峰。本實驗用經典的檸檬酸鈉還原氯金酸獲取金納米的方法，使用強陽離子聚電解質PDDA，得到帶正電荷的金納米基底，利用正負電荷結合的原理，采用堿液溶解藥物可以使藥物分子結合在金納米表面。在入射光激發(fā)下，金納米顆粒表現(xiàn)出強烈的表面等離子體共振特性。具有很強的局域電場，使得處于該電場中的MTX和VOR分子的拉曼散射被增強。因此可以得到藥物分子信號顯著增強的拉曼特征圖譜。

圖3 VOR的拉曼光譜及表面增強拉曼光譜Fig.3 Raman and SERS spectra of VOR

圖4 MTX、VOR及MTX-VOR的表面增強拉曼光譜Fig.4 SERS spectra of VOR,MTX and MTX-VOR

圖5 混合物中改變MTX濃度的表面增強拉曼光譜Fig.5 SERS spectra of mixture with different MTX concentrations

按“2.4”考察了MTX和VOR混合物的SERS譜圖(見圖4)。由圖4可以看出：MTX和VOR純物質的SERS光譜在MTX-VOR混合物的SERS光譜中均能找到，VOR的SERS光譜也可測出。說明借助SERS技術可以成功檢測出MTX、VOR、MTX-VOR光譜。按“2.5”采用SERS技術進一步考察了MTX和VOR混合物的濃度梯度實驗。從圖5可看出，混合物中0.1 mg/mL VOR(2.86×10-4mol/L)與1.0×10-8mol/L MTX均可被成功識別。此外，采用SERS技術還可很容易地區(qū)分出混合物中各組分的拉曼特征峰，其中680 cm-1為MTX苯環(huán)上的C—H 面外彎曲振動峰，1 345 cm-1為—CH3伸縮振動峰。730 cm-1和1 345 cm-1分別為VOR和MTX的拉曼特征峰。

3.3 混合物中VOR和MTX的定性結果

利用小波空間中脊線、峰谷、零交叉點信息，通過設置脊線最大值閾值可以排除假峰，提升峰檢測的準確度?；旌纤幬锏姆治鲂盘枖?shù)據(jù)集包括VOR和MTX的信號、基線、隨機噪聲。因為小波是對稱、零均值、變化緩慢、局部基線單調的函數(shù)，所以在“1.1”小波峰檢測計算過程中會自動扣除局部緩慢變化的基線。FMWS可以認為是分析信號與尺度交換、平移后小波的卷積，因此可以壓縮小波空間的噪聲。利用小波提取到拉曼特征后，由VOR和MTX的SERS單一光譜進行定性匹配。混合藥物的SERS光譜樣本共有18組數(shù)據(jù)，即VOR濃度變化范圍為0.1、0.01、0.001 mg/mL(即2.86×10-4、2.86×10-5、2.86×10-6mol/L)，MTX為1.0×10-3～1.0×10-8mol/L。分別以VOR和MTX的SERS光譜進行匹配計算，即可分別得到VOR(表1)和MTX(表2)的定性結果。FMWS相比于HQI方法，選取目標物的峰位置信息進行匹配，可自動忽略、排除其他雜峰等因素的干擾，即公式(4)計算出的FMWS值理論上明顯高于HQI值。即采用小波空間特征匹配算法，可計算出混合物與標準品的SERS光譜匹配度。結果表明，混合物中的VOR和MTX的特征匹配系數(shù)值均大于0.96，且大部分的結果達到0.99，各組對應數(shù)值均大于HQI值。說明小波空間特征匹配方法可成功檢出混合物的組分，且其準確性高于傳統(tǒng)命中質量系數(shù)法。

3.4 混合物中VOR和MTX的半定量結果

由于重疊峰、密集峰、基線以及噪音等干擾因素，利用單個特征峰難以準確定量混合物中的組分含量。本研究依據(jù)VOR和MTX參考光譜數(shù)據(jù)，充分利用未知混合光譜全譜信息，采用非負最小二乘方法進行分析。即分別提取出VOR和MTX對應的730 cm-1和1 345 cm-1拉曼特征峰位置、峰強信息。對18組混合物的SERS光譜進行半定量分析?；旌衔锕庾Vy，矩陣X一列是一個候選化合物VOR的光譜，一列是候選化合物MTX的光譜，b為候選化合物比例的向量。通過非負最小二乘可以計算出兩者在混合物中的比例，并將其與真實占比進行對比(表3)。結果表明，混合物的各組分含量比可以進行定量，預測值與真實值之間相關性大于0.98。說明小波空間特征匹配結合非負最小二乘方法可實現(xiàn)對未知混合物中VOR和MTX組分的半定量分析。

表1 小波空間特征匹配系數(shù)與命中質量系數(shù)對不同濃度VOR的定性結果Table 1 FMWS and HQI of VOR with different concentrations in mixture

表2 小波空間特征匹配系數(shù)與命中質量系數(shù)對不同濃度MTX的定性結果Table 2 FMWS and HQI of MTX with different concentrations in mixture

表3 小波空間特征匹配對混合物組分VOR和MTX的定量結果Table 3 Quantitative analysis results of VOR and MTX mixture by FMWS

4 結 論

本研究合成了AuNPS-PDDA納米復合物，借助SERS的表面增強效應，成功地定性和半定量分析混合物中的組分甲氨蝶呤(MTX)和伏立康唑(VOR)。針對重疊峰、密集峰、弱峰、基線以及噪音等干擾因素導致組分無法檢出與準確定量這一難題，將小波信息轉換至小波空間中進行峰檢測，確定混合物中的物質成分，然后利用全譜信息進行半定量分析。該算法可以準確確定出混合物中組分，能預測其組分含量比例。結果表明，SERS技術結合小波空間特征匹配以及非負最小二乘方法可實現(xiàn)MTX和VOR的定性和半定量分析。