邵瑞婷,丁學妍,張麗華,姜 潔

(北京市食品安全監(jiān)控和風險評估中心，北京 100041)

水楊酸(Salicylic acid)又稱2-羥基苯甲酸，為白色針狀結晶或單斜棱晶，有辛辣味，微溶于水，溶于丙酮、松節(jié)油、乙醇、乙醚、苯和氯仿，具有防腐、消炎作用[1-2]，存在于自然界的柳樹皮、白珠樹葉、甜樺樹中，是一種天然的“消炎藥”.水楊酸主要作為醫(yī)藥工業(yè)的原料使用，也經常作為防腐劑被用于化妝品中，此外還被用于染料、橡膠、香精配制等.正是由于水楊酸具有防腐殺菌作用，被一些不法商販利用[3]，他們?yōu)榱搜娱L原料乳的保存期限，在原料乳中加入水楊酸鈉，這樣的原料會影響最終的產品質量，對人體產生危害[4-7].

目前，包括我國和歐盟在內的多個國家，對于水楊酸在食品中的使用都有限制規(guī)定[8-9].我國將其列為“允許使用的食品用合成香料”[9]，但未標明其可作為防腐劑在食品中使用.此外，即使作為香料，也明確標注出不得在巴氏殺菌乳、殺菌乳、發(fā)酵乳等以原料乳生產的產品中添加.國內外對于水楊酸的檢測方法，主要集中在化妝品[10-12]、醫(yī)藥[13-15]及植物生長調節(jié)劑[16-23]方面，而對于原料乳中的水楊酸檢測，沒有明確的有針對性的定量檢測方法[24-26].本方法具有操作簡單、重現性好、靈敏度高、雜質干擾小等特點，可以用于原料乳中水楊酸的檢測.

1 試驗部分

1.1 儀器

Agilent 1260超高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；超聲波萃取儀(北京五洲東方)；多管渦旋振蕩器(北京華威中儀)；冷凍離心機(美國Thermo Fisher公司).

1.2 試劑與標準品

乙腈(色譜純，美國Thermo Fisher公司)；甲醇(色譜純，美國Thermo Fisher公司)；磷酸(優(yōu)級純，默克，質量分數85%)；氨水(優(yōu)級純，國藥，質量分數25.0%～28.0%).原料乳樣品：采集于北京市大型乳企生產用原料乳.

水楊酸標準品購自中國食品藥品檢定研究院.

精確稱取水楊酸標準品10 mg置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成1 mg/mL的標準儲備溶液，避光、-18 ℃下保存.

用70%乙腈水(體積分數)逐級稀釋混合標準溶液，配制成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL的標準溶液系列.

磷酸溶液：稱取11.5 g磷酸，精確至0.01 g，加入950 mL水，用氨水調節(jié)pH至2.5，加入水至1 000 mL.

流動相A液(磷酸水)：量取磷酸溶液200.0 mL，并用水稀釋至1 000 mL[8].

流動相B液(磷酸甲醇)：量取磷酸溶液250.0 mL，并用甲醇稀釋至1 000 mL[8].

1.3 樣品前處理

稱取2 g混勻試樣(精確到0.01 g)置于10 mL刻度離心管中，加入80%乙腈水(體積分數)溶液至5 mL刻度線，渦旋30 s，超聲提取25 min，以10 000 r/min在0 ℃下離心5 min，吸取上層提取液1 mL，過0.22 μm微孔濾膜，供檢測.

1.4 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6×100 mm,3.5 μm)；柱溫 25 ℃；二極管陣列檢測器(DAD)300 nm；進樣體積 10 μL；流速 0.8 mL/min；流動相：A為磷酸水、B為磷酸甲醇，梯度洗脫程序：0～3 min，A由80%線性降到10%;3～8 min，A相保持100%;8～8.1 min，A由10%線性升到80%;8.1～10 min，A相保持80%.

2 結果與討論

2.1 提取溶劑選擇

分別用甲醇、乙腈、丙酮、氯仿4種有機溶劑對原料乳樣品進行提取條件試驗(原料乳中水楊酸添加量為5 mg/kg)，結果如圖1所示.試驗結果表明：乙腈作為提取溶劑，蛋白沉淀效果最佳，其回收率為93%～105%；丙酮及氯仿雖有一定的提取效果，但回收率較低，均不足40%；甲醇作為提取試劑，蛋白沉淀效果不佳，個別出現乳化現象，無法達到良好提取兼凈化效果.故選擇乙腈作為提取試劑.

圖1 不同溶劑提取原料乳中水楊酸的回收率(n =6)Fig.1 Recoveries of salicylic acid in raw milk by different extration solvent (n =6)

對于不同濃度的乙腈作為提取試劑對提取效率的影響也做了相應的研究.選取乙腈質量分數(乙腈∶水，V∶V)分別為10%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的提取試劑，樣品中添加水楊酸的質量分數為5 mg/kg,進行測試，結果表明乙腈的質量分數大于60%時，提取效率無明顯差異.由于原料乳中本身含有一定量的水分，為保證提取效率，本著節(jié)約原則，最終選擇質量分數為80%的乙腈(乙腈∶水，V∶V)作為提取試劑.

2.2 樣品凈化方法的選擇

原料乳中含有大量的蛋白質和脂肪，凈化的主要目的就是除去脂肪和沉淀蛋白.由于乙腈具備良好的沉淀蛋白的效果，對目標物進行提取的同時，可將原料乳中的蛋白質較為充分的沉淀.冷凍、高速離心又能有效的避免脂肪的干擾，故為降低檢測成本，節(jié)約檢測時間，沒有再額外引入其余凈化環(huán)節(jié).

2.3 提取時間的選擇

試驗比較了超聲提取時間對原料乳中水楊酸提取效率的影響.樣品中添加水楊酸的質量分數為5 mg/kg，測試結果如圖2所示.由圖2可見，隨超聲時間的增長，目標物的提取效率顯著提高，在25 min后達到動態(tài)平衡，故最終選擇超聲提取時間為25 min.

2.4 檢出限、定量限與線性范圍

分別配制質量濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL的水楊酸標準溶液，自動進樣10 μL，進行UPLC分析.將標準系列工作溶液分別注入液相色譜儀中，測定相應的峰面積.以標準系列工作溶液的質量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線.將試樣溶液注入液相色譜儀中，得到峰面積，根據標準曲線得到待測液中水楊酸的質量濃度.方法檢出限以加標樣品檢測色譜峰信噪比S/N≥3確定，方法定量限以加標樣品檢測色譜峰信噪比S/N≥10確定，具體結果如表1所列.由表1可見，水楊酸在0.5～20.0 μg/mL的線性范圍內線性關系良好，線性系數R2大于0.995，能滿足定量分析的要求.方法對于水楊酸的檢出限均為0.5 mg/kg，定量限均為1.25 mg/kg.

圖2 水楊酸不同超聲提取時間的提取效率Fig.2 Extraction efficiencies of salicylic acid with different ultrasonic extraction times

表1 水楊酸的線性范圍、回歸方程及線性相關系數Table 1 Linear ranges,linear equations and correlation coefficients of salicylic acid

2.5 樣品的加標回收率

分別在2.00 g原料乳樣品中加入含有水楊酸的標準溶液，添加質量分數為1.25、2.5、25 mg/kg.使用優(yōu)化好的方法進行提取凈化，每個添加水平分別測定6份樣品，得到水楊酸的回收率和相對標準偏差,結果如表2所列.

表2 水楊酸在不同加標水平下的加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 2 Spiked recoveries and RSDs of salicylic acid spiked in three levels(n=6)

由表2可見，回收率范圍為88.0%～118.9%，相對標準偏差均小于10%.結果表明，水楊酸在不同的添加水平均得到了滿意的回收率和較好的方法重復性.

3 結論

建立了原料乳中水楊酸的超高效液相色譜檢測方法.通過乙腈提取，可實現對原料乳樣品中水楊酸的檢測，具有較高的回收率.該方法靈敏度高、重現性好，已在日常風險監(jiān)測試驗中得到良好的應用.檢測160余個采集于北京市及其周邊大型乳品企業(yè)的原料乳樣品，未檢測出陽性樣本.由于我國的原料乳有很多零散養(yǎng)殖戶參與供應，其安全性依然是監(jiān)管的難點和重點.水楊酸等防腐劑的添加作為重要的風險隱患，一直被監(jiān)控部門關注.因此，將快速靈敏的原料乳中水楊酸的檢測方法應用于日常監(jiān)管，具有必要性.