歐陽(yáng)丹，吳 杰，謝更奇，鄭梓揚(yáng)，施涵強(qiáng)，陳 鋒，陳玉誼，林子俺

(1.福州大學(xué) 化學(xué)學(xué)院食品安全與生物分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350116；2.莆田市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心,福建 莆田 351100)

內(nèi)毒素(Endotoxin)為一種外源性的致熱源，是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的特有結(jié)構(gòu)，其主要成分是親水性的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)[1-4].內(nèi)毒素廣泛存在于水體、土壤等與人體密切相關(guān)的環(huán)境中，并且人體對(duì)內(nèi)毒素的免疫反應(yīng)非常敏感，極微量的內(nèi)毒素就可引起人體溫升高等各種不良反應(yīng).因此，建立一種快速篩查鑒別內(nèi)毒素的方法，加強(qiáng)對(duì)各類藥物、食品、飲料、水源及生物制品中的內(nèi)毒素檢測(cè)，嚴(yán)格控制其含量，對(duì)于保障人民的身體健康及社會(huì)衛(wèi)生的公共安全具有重要的意義.

目前，《中國(guó)藥典》上所記載的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法包括凝膠法和光度測(cè)定法[5].兩種方法均是通過(guò)鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生反應(yīng)的原理來(lái)進(jìn)行檢測(cè).鱟試劑方法是內(nèi)毒素檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，是當(dāng)前最靈敏的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法[6].盡管如此，此法仍存在著反應(yīng)條件苛刻、影響因素眾多、鱟源不易獲取等缺點(diǎn).近年來(lái)，基于光譜技術(shù)的內(nèi)毒素檢測(cè)方法逐漸發(fā)展，并克服了傳統(tǒng)內(nèi)毒素檢測(cè)方法的缺點(diǎn)，但依然存在耗樣量大、定性定量難以兼顧等缺點(diǎn)，尤其是無(wú)法對(duì)復(fù)雜樣品中內(nèi)毒素進(jìn)行有效提取或富集.因此發(fā)展一種高靈敏、高通量、簡(jiǎn)便、快速的內(nèi)毒素檢測(cè)方法勢(shì)在必行.

基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry ,MALDI-MS)是一種新型高效的軟電離有機(jī)質(zhì)譜，近年來(lái)已成為分析生物大分子不可或缺的工具之一[7-10].但其最大的局限性在于傳統(tǒng)基質(zhì)與樣品共結(jié)晶時(shí)存在不均勻現(xiàn)象(甜點(diǎn)效應(yīng))，嚴(yán)重影響試驗(yàn)的重現(xiàn)性，因此難以進(jìn)行定量分析.而基于納米基質(zhì)的表面輔助激光解吸電離質(zhì)譜(SALDI-MS)則可以有效地減少基質(zhì)的“甜點(diǎn)效應(yīng)”，較好的解決了重現(xiàn)性的問(wèn)題.另外，SALDI-MS 還具有許多其它優(yōu)點(diǎn)，如樣品制備簡(jiǎn)單、信噪比高、耐鹽性好、基底表面信號(hào)重復(fù)性好以及可實(shí)現(xiàn)樣品的定量分析等，顯示出了較好的應(yīng)用前景[11-14].本文采用溶劑熱法合成了一種MnO2/石墨烯(MnO2/G)納米復(fù)合材料，以大腸埃希菌中提取精致的內(nèi)毒素(Control standard endotoxin，CSE)為分析對(duì)象，建立了一種基于MnO2/G納米材料的SALDI-MS的內(nèi)毒素檢測(cè)新方法，并成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)各種注射液及飲用水中內(nèi)毒素的快速鑒定和定量分析.

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

透射電鏡(Transmission Electron Microscope，TEM，型號(hào)：Tecnai G2 20，美國(guó))；紫外可見分光光度計(jì)(Ultraviolet-visible spectrometer，UV-Vis，型號(hào)：UV-9000S，上海)；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF/MS，型號(hào)：Bruker Autoflex speed Ⅱ,Bruker Daltonics Inc.，美國(guó))

鹽酸林可霉素注射液、柴胡注射液、氯霉素注射液、普魯卡英腎上腺素注射液和滅菌注射用水等樣品均由福建省莆田市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心提供；品牌飲用水樣品購(gòu)自當(dāng)?shù)爻?；石墨烯、乙醇、乙酸錳購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)由Bruker公司提供；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水購(gòu)自廈門鱟試劑生物科技股份有限公司.

1.2 MnO2/G納米復(fù)合材料的制備

稱取50 mg石墨烯，將其分散于100 mL乙醇中，超聲1 h，得到穩(wěn)定的石墨烯懸濁液.向該懸濁液中加入0.1 mol乙酸錳,磁力攪拌1 h后，于90 ℃水浴鍋中加熱1 h，轉(zhuǎn)移至400 ℃退火3 h,制備得到MnO2/G納米材料[15].

1.3 細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

溶解：取一支細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品(10 EU)，加入1 mL的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，復(fù)溶后置于漩渦混勻器上混勻15 min，得到濃度為10 EU/mL的內(nèi)毒素溶液.

稀釋：根據(jù)試驗(yàn)需要逐步稀釋,制備濃度分別為1、0.5、0.2、0.1 EU/mL的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液.

1.4 MALDI-MS與SALDI-MS樣品制備

稱取30 mg CHCA基質(zhì)，加入1 mL的乙腈/水(體積比為3:7)溶劑，配制成質(zhì)量濃度為 30 mg/mL的CHCA溶液.將MnO2/G納米復(fù)合材料分散于乙醇/水(體積比為1∶1)中并超聲1 min，形成均勻的懸浮液(2 mg/mL).將基質(zhì)溶液/待分析物(體積比為1∶1)混勻后，移取1 μL，點(diǎn)在靶板上，自然干燥.

1.5 質(zhì)譜分析

將樣品靶板放入質(zhì)譜儀器，儀器參數(shù)調(diào)整為線性正離子模式，離子源電壓為19 kV，延遲提取120 ns，激光照射設(shè)置為300次.連續(xù)采集譜圖，采用flexAnalysis(Bruker Daltonics Inc.，美國(guó))軟件處理數(shù)據(jù).

2 結(jié)果與討論

2.1 MnO2/G納米復(fù)合材料的表征

參考文獻(xiàn) [15]，本文采用溶劑熱法制備MnO2/G納米復(fù)合材料，其結(jié)構(gòu)如圖1所示.從圖1(a)可知，MnO2/G納米復(fù)合材料具有典型的納米片層狀結(jié)構(gòu)，與石墨烯相似.該復(fù)合材料分散性較好、比表面積大，有助于激光能量的吸收與轉(zhuǎn)移.X射線能譜分析(EDS)顯示該復(fù)合材料含有Mn、O和C元素(Cu為銅網(wǎng)自身所含元素)，表明MnO2/G納米復(fù)合材料已成功制備(圖1(b)).圖1(c)為0.05 mg/mL MnO2/G水溶液的紫外可見吸收光譜圖.由圖1(c)可知，在波長(zhǎng)300～400 nm區(qū)間，該材料表現(xiàn)出較強(qiáng)的紫外光吸收能力，且與MALDI激光光源(λ=337 nm)相匹配，表明其具有作為SALDI基質(zhì)的潛力.由圖1 (d)可見，樣品與MnO2/G納米基質(zhì)共混結(jié)晶均勻，“甜點(diǎn)效應(yīng)”小，有利于實(shí)現(xiàn)定量分析和提高試驗(yàn)的重現(xiàn)性.

圖1 MnO2/G納米復(fù)合材料的(a)透射電鏡圖,(b)X射線能譜分析,(c)紫外可見吸收光譜圖(內(nèi)插圖為0.05 mg/mL的MnO2/G水溶液),(d)樣品/基質(zhì)共混結(jié)晶分布光學(xué)圖Fig.1 Characterization of MnO2/G nanocomposites (a)TEM,(b)EDS spectrum,(c)UV-vis spectrum and (d)optical image of sample/matrix co-crystallization

2.2 基于MALDI-MS和SALDI-MS的內(nèi)毒素鑒定

以1 EU/mL的內(nèi)毒素溶液為考察對(duì)象，使用有機(jī)基質(zhì)(CHCA)和本文所開發(fā)的MnO2/G納米復(fù)合材料為基質(zhì)，分別采用傳統(tǒng)的MALDI-MS 和SALDI-MS方法對(duì)其檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示.由圖2可見，當(dāng)以CHCA為基質(zhì)時(shí)，在m/z 7 000左右出現(xiàn)內(nèi)毒素的特征峰，而以MnO2/G納米復(fù)合材料為基質(zhì)時(shí)，同樣在m/z 7 000左右出現(xiàn)內(nèi)毒素的特征峰.與前者相比，采用MnO2/G納米基質(zhì)可以獲得更強(qiáng)的質(zhì)譜信號(hào)，其原因可能在于MnO2/G納米復(fù)合材料具有高的表面積和更強(qiáng)的電子解吸/轉(zhuǎn)移能力，有助于內(nèi)毒素的高效電離，進(jìn)而獲得更高的質(zhì)譜響應(yīng)[12].

圖2 (a)基于MALDI-MS的內(nèi)毒素鑒定,(b)基于SALDI-MS的內(nèi)毒素鑒定(濃度為1 EU/mL)Fig.2 Determination of CSE (1 EU/mL)by biomass spectrometry for (a)MALDI-MS using CHCA as matrix,(b)SALDI-MS using MnO2/G as matrix

2.3 基于SALDI-MS的內(nèi)毒素定量分析及重現(xiàn)性考察

以MnO2/G納米復(fù)合材料為基質(zhì)的SALDI-MS,使得CSE的定量分析成為可能.配制一系列不同濃度的CSE標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最優(yōu)化的SLDI-MS條件下測(cè)試，結(jié)果如圖3(a)所示.由圖3(a)可見，隨著CSE濃度的下降，其質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度逐漸下降，表明其濃度與質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度呈現(xiàn)一定的比例關(guān)系.在最優(yōu)質(zhì)譜參數(shù)下，CSE在0.1 ～1 EU/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性，回歸方程為y=127.103 35x+8.908 91，R2=0.998 69(圖3(b))，以基線噪聲 (S/N)3倍值對(duì)應(yīng)CSE的濃度,檢測(cè)限為 0.05 EU/mL.此外，試驗(yàn)還考察了SALDI-MS方法的重現(xiàn)性，結(jié)果如圖3(c)所示.通過(guò)連續(xù)分析10個(gè)內(nèi)毒素的不同樣品點(diǎn)(濃度為0.5 EU/mL)，可獲得內(nèi)毒素質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度，其RSD為9.02% (n=10)，表明該方法具有較好的重現(xiàn)性.

圖3 基于SALDI-MS的內(nèi)毒素定量分析(a)不同濃度的內(nèi)毒素,(b)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,(c)重現(xiàn)性考察Fig.3 SALDI-MS for CSE analysis (a)dierent concentrations of CSE,(b)calibration curve of CSE and (c)reproducibility

2.4 基于SALDI-MS的注射液及飲用水樣品分析

為了驗(yàn)證方法的可行性，本文以MnO2/G納米復(fù)合材料為基質(zhì)，采用SALDI-MS方法對(duì)注射液及飲用水中的內(nèi)毒素進(jìn)行鑒定及定量分析.依據(jù)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度與質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度間的線性關(guān)系，計(jì)算所得樣品中內(nèi)毒素的實(shí)際含量，并與傳統(tǒng)的鱟試劑方法所得結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果如表1所列.由表1可見，SALDI-MS方法測(cè)得樣品中的內(nèi)毒素濃度與傳統(tǒng)的鱟試劑方法結(jié)果吻合.經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)(配對(duì)t檢驗(yàn))，計(jì)算所得結(jié)果顯示P>0.05，兩種方法測(cè)得結(jié)果無(wú)顯著差異.但與傳統(tǒng)鱟試劑方法相比，SALDI-MS方法具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)速度快(<5 min)、無(wú)需復(fù)雜的樣品前處理、通量高和耐鹽性好等諸多優(yōu)點(diǎn)，表明該方法具有良好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值.

表1 SALDI-MS法與鱟試劑法檢測(cè)注射液和飲用水中的內(nèi)毒素Table 1 Results of endotoxin concentrations measured by SALDI-MS and TAL

3 結(jié)論

本文采用溶劑熱法制備了MnO2/G納米復(fù)合材料，并建立了一種基于MnO2/G納米復(fù)合材料的SALDI-MS的內(nèi)毒素快速檢測(cè)方法.與傳統(tǒng)的內(nèi)毒素檢測(cè)方法相比，本文所建立的SALDI-MS方法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、分辨率高、檢測(cè)速度快、高通量、耐鹽性好等優(yōu)點(diǎn).將該方法應(yīng)用于注射液及飲用水中內(nèi)毒素的快速鑒定與定量分析，取得了令人滿意的結(jié)果.該方法有望進(jìn)一步應(yīng)用于其他類食品藥品中內(nèi)毒素的快速篩查與鑒定.