盧巧梅

(福州大學(xué) 測(cè)試中心，福州大學(xué)食品安全與生物分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350116)

藍(lán)藻水華是常見(jiàn)的淡水水華現(xiàn)象，產(chǎn)生的毒素以微囊藻毒素(MCs)最普遍且危害最大[1-2].大量藻毒素的存在不僅影響生態(tài)環(huán)境，還會(huì)通過(guò)食物鏈富集和傳遞，影響淡水養(yǎng)殖業(yè)并威脅人類(lèi)健康.MCs是一類(lèi)由7個(gè)氨基酸殘基組成的環(huán)狀多肽化合物.目前已發(fā)現(xiàn)了幾十種該類(lèi)毒素，其中MC-RR、MC-LR和MC-YR最具有代表性，其測(cè)定技術(shù)包括生物學(xué)法、免疫檢測(cè)法和化學(xué)分析法等[3].化學(xué)分析法中，HPLC是推薦的MCs測(cè)定方法.痕量毒素通常需要先濃縮富集再經(jīng) HPLC-UV法直接測(cè)定[4-5].此法結(jié)合質(zhì)譜檢測(cè)器，方法的靈敏度和定性準(zhǔn)確性明顯提高，但較大的進(jìn)樣量和較低的柱效在常規(guī)HPLC-MS或HPLC-MS/MS中略顯不足[6-7].因此，開(kāi)發(fā)一種高效、樣品消耗少的MCs檢測(cè)方法仍具有實(shí)際意義.

芯片色譜技術(shù)把傳統(tǒng)色譜柱濃縮成約數(shù)厘米長(zhǎng)、數(shù)毫米厚的芯片，再通過(guò)激光鐳射技術(shù)在色譜芯片上刻出分析通道，并填充C18、C8等固定相.該微型化裝置可明顯降低流速、減少柱體積，從而提高方法靈敏度[8-9].目前芯片液相色譜-質(zhì)譜(nano-flow chip liquid chromatography-high resolution mass，nano-flow chip LC-MS)技術(shù)已成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)、肽類(lèi)等生物樣品分析[10-12]，但較少用于小分子化合物領(lǐng)域[13-15]，在MCs定量監(jiān)測(cè)中也鮮見(jiàn)報(bào)道.

本文將芯片液相色譜和高分辨質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，建立了同時(shí)檢測(cè) MC-RR、MC-LR和MC-YR的nano-flow chip LC-MS新體系.方法快速可靠，僅pg級(jí)的進(jìn)樣量也獲得了較高的靈敏度.

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Nano-flow chip LC-MS聯(lián)用系統(tǒng)(Agilent,USA)包括納流液相色譜(1200 Nano HPLC)、接口(Chip Cube)和四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(G6520 Q-TOF MS)3部分.芯片為Agilent G4240-65005，包括富集柱(體積40 nL)和分析柱(75 μm×43 mm)，二者填料均為Zorbax SB-C18，5 μm(如圖1所示).

圖1 MCs的化學(xué)結(jié)構(gòu)(a)和芯片示意圖(b)Fig.1 Chemical structure of MCs (a)and schematic diagram of chip (b)

標(biāo)準(zhǔn)品 MC-RR、MC-LR和MC-YR(北京伊普瑞斯公司，結(jié)構(gòu)式如圖1所示)使用甲醇∶水(體積比為2∶8)溶解，配制成 100.0 μg/mL儲(chǔ)備液，試驗(yàn)前用二次水稀釋至所需濃度.乙腈為色譜純(美國(guó) Sigma-aldrich 公司)；醋酸銨為分析純(天津市福晨化學(xué)試劑廠)；甲酸(FA)為色譜純(上海迪馬科技有限公司).Bond Elut-C18固相萃取柱(Agilent,USA).試驗(yàn)用水為二次蒸餾水，取自 Milli-Q 超純水系統(tǒng).所有溶液使用前均用0.22 μm濾膜過(guò)濾.

1.2 芯片液相色譜-質(zhì)譜條件

毛細(xì)管泵流速2 μL/min，泵沖洗選擇乙腈-水溶液，10%乙腈等度洗脫.納流泵流速600 nL/min，乙腈(B相)-水溶液(A相，含0.15% FA).0～20 min，10%～60% B相梯度洗脫.進(jìn)樣體積l μL，進(jìn)樣沖洗體積為 4 μL.

質(zhì)譜選擇正離子模式；m/z 400-1200，干燥氣流量3 L/min，霧化氣溫度 315 ℃，F(xiàn)ragmentor 175 V，毛細(xì)管電壓調(diào)節(jié)在1 750 V使噴霧良好.3種 MCs 均測(cè)得[M+H]+、[M+2H]2+信號(hào)，試驗(yàn)以[M+2H]2+作為定量離子(如表1所列).

1.3 樣品處理

明蝦和草魚(yú)購(gòu)于福州當(dāng)?shù)爻?采用固相萃取法(SPE)提取凈化樣品，過(guò)程在文獻(xiàn)[7]基礎(chǔ)上稍加改進(jìn).準(zhǔn)確稱(chēng)取魚(yú)肉或蝦肉組織1.0 g，加入5.0 mL 5% 醋酸銨溶液，勻漿攪碎，超聲20 min，浸提4 h.過(guò)濾，殘?jiān)?.5 mL 5%醋酸銨溶液重復(fù)提取兩次，合并濾液.分別用甲醇、水活化處理C18小柱后，讓濾液以一定速度上樣富集藻毒素.待樣品全部吸附，以5.0 mL 10%甲醇-水溶液沖洗C18小柱，5.0 mL甲醇洗脫目標(biāo)物，洗脫液氮吹近干，用二次水定容至1.0 mL，15 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行色譜、質(zhì)譜分析.

表1 3種 MCs 的保留時(shí)間和特征離子Table 1 Retention time and characteristic ions of three MCs

2 結(jié)果與討論

2.1 芯片液相色譜分離優(yōu)化

芯片液相色譜高度集成了芯片色譜柱分離和預(yù)富集、納流噴霧電離等技術(shù)，高度智能化、微型化的同時(shí)也具有較好的色譜分離性能.

2.1.1 樣品溶劑和上樣體積的選擇

在芯片中，樣品先預(yù)富集在富集柱上(柱體積僅40 nL)，達(dá)到設(shè)定的上樣體積時(shí)，六通閥切換使樣品在納流泵的沖洗下進(jìn)入分析柱(圖1b).若稀釋樣品的溶劑洗脫強(qiáng)度較大，則可能導(dǎo)致在預(yù)富集柱中的樣品部分排入廢液或后續(xù)分離時(shí)峰展寬.試驗(yàn)考察了5%乙腈-水、2%乙腈-水、水作為樣品溶劑時(shí)，樣品的分離效果.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，即使添加少量乙腈，3種分析物峰形都略微展寬，最終選擇使用水作為樣品溶劑.

選擇合適的上樣體積，對(duì)樣品的測(cè)定非常重要.體積太小，不能保證將所有目標(biāo)物運(yùn)送至富集柱；若體積太大，可能會(huì)導(dǎo)致弱保留化合物穿透富集柱.鑒于上樣體積一般為針座毛細(xì)管體積、自動(dòng)進(jìn)樣器到Chip Cube之間毛細(xì)管體積、在線過(guò)濾器體積之和的2～6倍，試驗(yàn)選擇4 μL為上樣體積.

2.1.2 流動(dòng)相選擇

對(duì)于芯片色譜而言，流動(dòng)相對(duì)色譜分離的影響甚大.芯片的耐受壓力約為15 MPa，若使用甲醇-水體系，較高的壓力可能超過(guò)芯片的承受范圍.使用乙腈-水體系，系統(tǒng)壓力更低，而且乙腈具有較強(qiáng)的洗脫能力，能夠獲得更好的峰形.因此，選擇乙腈-水作為流動(dòng)相.

MCs結(jié)構(gòu)中含有多種氨基酸，其極性會(huì)隨pH值改變而變化.試驗(yàn)分別考察了甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.05%～0.15%時(shí)，目標(biāo)物的分離情況(如圖2所示).

圖2 不同流動(dòng)相對(duì)分離的影響Fig.2 Effects of different mobile phase on separation(a)乙腈-H2O，(b)乙腈-0.05% FA，(c)乙腈-0.10% FA，(d)乙腈-0.15% FA毛細(xì)管泵流速2 μL/min，10%乙腈等度洗脫；納流泵流速600 nL/min，0～20 min，10-60% B相梯度洗脫進(jìn)樣體積l μL，進(jìn)樣沖洗體積為 4 μL(1)MC-RR(0.5 μg/mL)，(2)MC-YR(2.0 μg/mL)，(3)MC-LR(1.0 μg/mL)

由圖2可見(jiàn)，僅使用乙腈-水二元體系時(shí)，MC-YR和MC-LR 基本重合.隨著甲酸體積濃度增大，3種物質(zhì)的分離度增大，響應(yīng)增強(qiáng).這是因?yàn)殡S著甲酸濃度的增加，促進(jìn)了MCs的質(zhì)子化過(guò)程和極性差異情況，從而明顯改善了各組分在芯片上的保留行為.因此，最終選取體積分?jǐn)?shù)為0.15%的甲酸作為水相添加劑.

梯度洗脫有助于進(jìn)一步改善分離效果.嘗試了多種梯度洗脫程序(如圖3所示)，發(fā)現(xiàn)增大泵流速或有機(jī)相比例，可使保留時(shí)間縮短.以20%乙腈為初始有機(jī)相沖洗色譜柱時(shí)，盡管3種待測(cè)物在14 min內(nèi)完成分離，但柱效和靈敏度都明顯下降.兼顧分離效率和方法靈敏度，選擇0～20 min、10%～60% B作為后續(xù)分析條件.

圖3 不同梯度洗脫條件對(duì)分離的影響Fig.3 Effects of different gradient elutions on separation乙腈-0.15% FA；毛細(xì)管泵流速2 μL/min，10%乙腈等度洗脫；進(jìn)樣體積1 μL，進(jìn)樣沖洗體積為 4 μL(1)MC-RR(0.5 μg/mL)，(2)MC-YR(2.0 μg/mL)，(3)MC-LR(1.0 μg/mL)

2.2 質(zhì)譜檢測(cè)

在芯片液相色譜-質(zhì)譜中，流動(dòng)相組成、芯片噴針位置、芯片差異等因素都會(huì)影響納流噴霧效果.在色譜分離方面，已證實(shí)流動(dòng)相中添加少量FA有利于改善噴霧情況.試驗(yàn)繼續(xù)考察芯片因素對(duì)分離檢測(cè)的影響，結(jié)果顯示，微調(diào)芯片噴針位置，目標(biāo)物的響應(yīng)信號(hào)會(huì)隨之改變.故所有試驗(yàn)應(yīng)確保在同一個(gè)芯片上進(jìn)行，且噴針位置一經(jīng)確定后不再改變.根據(jù)噴霧狀態(tài)優(yōu)化毛細(xì)管電壓(1 500～2 000 V)，最終確定為1 750 V，在此條件下方法靈敏度更高.

MCs結(jié)構(gòu)中含有氨基、羧基和酰胺基，理論上對(duì)質(zhì)譜的正、負(fù)兩種離子檢測(cè)模式都有響應(yīng).試驗(yàn)優(yōu)化了上述兩種檢測(cè)模式下的物質(zhì)信號(hào)情況，也證實(shí)了含氮雜原子的存在，使得正離子檢測(cè)模式下目標(biāo)物的響應(yīng)峰面積更高.3種 MCs均測(cè)得[M+H]+、[M+2H]2+信號(hào)，選擇響應(yīng)較強(qiáng)的[M+2H]2+作為定量離子(如圖4所示).在高分辨質(zhì)譜中，所有目標(biāo)物的質(zhì)量偏差更小，定性準(zhǔn)確性更強(qiáng).

圖4 正離子檢測(cè)模式下3種 MCs的全掃描質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectra of three MCs under full scan with positive mode

2.3 定量方法建立

配制一系列不同濃度的MCs標(biāo)準(zhǔn)混合溶液.選擇 [M+2H]2+的峰面積定量分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線.3種MCs在2.5～2 000 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)大于 0.996 5，檢測(cè)限(LOD)最低為 0.5 ng/mL(如表2所列).目前，我國(guó)對(duì)水產(chǎn)品中MCs殘留未有明確限量，但已規(guī)定在飲用水中MC-LR限量值為1.0 ng/mL[16].該方法MC-LR的檢測(cè)限為0.8 ng/mL，因此能滿(mǎn)足痕量MCs日常監(jiān)測(cè)的要求.

考察方法的重現(xiàn)性.日間精密度以當(dāng)天7 次重復(fù)進(jìn)樣，日間精密度以連續(xù)3天進(jìn)樣.結(jié)果表明，MCs的保留時(shí)間穩(wěn)定，峰面積RSDs小于 6.81%，方法重現(xiàn)性良好.

表2 3種 MCs的分析參數(shù)Table 2 Analytical parameters of three MCs

2.4 水產(chǎn)品樣品分析

分別對(duì)魚(yú)肉和蝦肉按照1.3節(jié)方法進(jìn)行處理.樣品組織經(jīng)醋酸銨提取、C18凈化富集進(jìn)行質(zhì)譜分析.對(duì)照目標(biāo)物保留時(shí)間、精確質(zhì)荷比等信息，表明在實(shí)際樣品中未檢出MCs.在最優(yōu)條件下，進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)(如表3所列).所有樣品的回收率大于82.8%～120.3%，能夠滿(mǎn)足分析方法的要求.

表3 水產(chǎn)品的加標(biāo)回收率Table 3 Spiked recoveries of aquatic products

2.5 方法對(duì)比

將該方法與已報(bào)道的HPLC有關(guān)方法相比較(如表4所列).由表4可見(jiàn)，在進(jìn)樣體積方面，本法的進(jìn)樣體積遠(yuǎn)低于其他方法，這對(duì)于某些昂貴或稀少樣品特別重要，并符合綠色化學(xué)的要求.其次，結(jié)合經(jīng)典的SPE預(yù)處理方法，本試驗(yàn)的靈敏度可達(dá)pg級(jí)，線性范圍更廣.常規(guī)的HPLC-UV法通常需要結(jié)合一些新興樣品前處理技術(shù)(例如固相微萃取和磁性固相萃取)和制備新型吸附材料，才能獲得和本方法接近的靈敏度.此外，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)具有選擇離子、提取離子等功能，可適用于復(fù)雜樣品分析.綜上所述，本法集成樣品預(yù)富集、分離、噴霧于一塊芯片上，操作簡(jiǎn)單、快速，并具有樣品消耗量少、檢測(cè)限低等突出優(yōu)勢(shì).

表4 本法與HPLC相關(guān)方法比較Table 4 Comparison of related HPLC methods

3 結(jié)論

試驗(yàn)利用nano-flow chip LC-MS 技術(shù)，建立了同時(shí)分析3種微囊藻毒素的方法.方法檢測(cè)限在0.5～2.0 ng/mL范圍內(nèi).采用固相萃取法純化2種水產(chǎn)品，均沒(méi)有測(cè)得藻毒素殘留.方法簡(jiǎn)單、靈敏、環(huán)境友好，可推廣至其他復(fù)雜基質(zhì)中MCs的快速準(zhǔn)確分析.