耿連婷 鄭克彬 李春暉 張新婷 曾昭穆 張欣

1河北大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科（河北保定071000）；2石家莊市第四醫(yī)院醫(yī)療美容科（石家莊050000）；3河北大學(xué)醫(yī)學(xué)院（河北保定071000）

膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤［1］，其發(fā)病機(jī)制尚不明了［2］，手術(shù)和放化療效果有時并不理想，目前基因治療越來越受到重視。第10 號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因（phosohatase and tensin homolgue deleted on chromosome 10，PTEN）是重要的抑癌基因［3-4］，PTEN-Long 是PTEN的一種翻譯變體［5］，與其具有相似的磷酸酶活性。PTEN-Long 還具有特殊的細(xì)胞分泌和穿透作用［5］，在基因治療中增加了蛋白治療的可能性，避免了免疫原性風(fēng)險［6］。PTEN-Long 可抑制PI3KAKT 通路活性，此通路影響腫瘤增殖的多個關(guān)鍵步驟，核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor kappa-B，NFκB）影響細(xì)胞存活及凋亡，其異常激活和惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［7］，目前對PTEN-Long 影響下游NF-κB 的研究相對較少。本研究通過構(gòu)建PTENLong 過表達(dá)模型，探討PTEN-Long 對U251 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡的影響及與PI3K-AKT-NF-κB信號通路的關(guān)系，為基因治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 購自國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺北京總部，PTEN-Long 過表達(dá)載體質(zhì)粒構(gòu)建和慢病毒包裝由賽業(yè)公司完成。慢病毒表達(dá)載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。質(zhì)粒組成中包含目的基因hPTEN［NM_001304717.2］*/3xFLAG、EGFP：T2A：Puro 和氨芐西林抗性基因。表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，可直接用于宿主細(xì)胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子。胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基購自Gibco 公司；基因檢測引物由Invitrogen 公司合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時熒光定量試劑盒購自TaKaRa 公司；兔抗人β-Actin、辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔抗體購自Affinity 公司；兔抗人AKT1/2/3、p-Akt 抗體購自Abways 公司；兔抗人IκBα單抗購自Abcam 公司；兔抗人PTEN、NF-κB p65、p-NF-κB p65、bcl-xl 單抗購自CST 公司；CCK-8 試劑盒購自DOJINDO 公司；基底膠購自Solarbio 公司。實(shí)驗(yàn)經(jīng)河北大學(xué)醫(yī)學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)中心動物倫理委員批準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)號：2018015）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 U251 細(xì)胞在含10% FBS、1%青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃，5%CO2，飽和濕度環(huán)境的條件下連續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分3 組：（1）未感染慢病毒的U251 為對照組；（2）感染LV-EGFP的U251 為空載組；（3）感染LV-PTEN-Long-EGFP的U251 為過表達(dá)組。取對數(shù)期細(xì)胞接種至12 孔板（1×105個/孔），24 h 后觀察細(xì)胞密度，匯合度在80%為宜。更換新鮮培養(yǎng)基，加入慢病毒質(zhì)粒載體，使感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）值為50，加入Polybrene 溶液（5 μg/mL）。6～12 h 后觀察細(xì)胞形態(tài)并更換新鮮培養(yǎng)基，72 h 后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，若轉(zhuǎn)染效率為80%以上，嘌呤霉素（1.5 μg/mL）篩選3 d。

1.3 RT-PCR 檢測目的基因的mRNA 表達(dá)水平Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)試劑盒說明書制備cDNA 及RT-PCR 擴(kuò)增。PTEN-Long 基因上游引物5′-CTCCAAATTTTAAGGTGAAGCTGT-3′，下游引物5′-CTCTGGATCAGAGTCAGTGGT-3′；PTEN 基因上游引物5′-CAGAAAGACTTGAAGGCGTAT-3′，下游引物5′-AACGGCTGAGGGAACTC-3′；AKT 基因上游引物5′-GCAGCACGTATACGAGAAGA-3′，下游引物5′-GGTGTCAGTCTCCGACGTG-3′；NF-κB p65基因上游引物5′-GAGGACTGCTGCTACGTCAC-3′，下游引物5′-ACCAGGTTCAGGTTCAGCTC-3′；IκBα基因上游引物5′-AACCTGCAGCAGACTCCACT-3′，下游引物5′-ACACCAGGTCAGGATTTTGC-3′；bcl-xl基因上游引物5′-GTAAACTGGGGTCGCATTGT-3′，下游引物5′-TGCTGCATTGTTCCCAT AGA-3′；β-Actin 基因上游引物5′-CATCCCCCAAAGTTCACAAT-3′，下游引物5′-AGTGGGGTGGCTTTTAGGAT-3′。使用Applied Biosystems 7300 Fast Real-Time PCR 系統(tǒng)與SYBR 熒光染料進(jìn)行檢測，反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃30 s，1 個循環(huán)；PCR 反應(yīng)95 ℃5 s，60 ℃31 s，40 個循環(huán)。mRNA 的相對定量采用2-△△Ct法，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果經(jīng)Champ Gel 5000 全自動凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 Western blot 檢測目的蛋白表達(dá)水平 用裂解液提取蛋白，取總蛋白（60 μg）進(jìn)行SDS-PAGE電泳，穩(wěn)壓冰浴電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶封閉37 ℃2 h，一抗孵育4 ℃過夜，TBST 洗膜。二抗孵育37 ℃1.5 h，TBST 洗膜。ECL 避光孵育PVDF 膜3 min，用C-DiGit Blot Scanner 對條帶進(jìn)行定量分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 CCK-8 法、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖能力及周期變化 取對數(shù)期細(xì)胞接種至96 孔板（100 μL，5 × 103個/孔），在細(xì)胞貼壁及培養(yǎng)24、48、72 h 后，加入CCK-8 試劑（10 μL/孔）。3 h 后用酶標(biāo)儀測定450 nm 處的OD 值。收集細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 取對數(shù)期細(xì)胞接種于24 孔板（2 × 105個/孔），待細(xì)胞生長至融合度為80%～90%時，用無菌槍頭（200 μL）刮擦細(xì)胞形成縱向劃痕，PBS 清洗，在各孔中加入500 μL無血清培養(yǎng)基。在0、12、24 h 時拍照并統(tǒng)計(jì)劃痕面積，每組取5 個視野進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 Transwell 法檢測細(xì)胞侵襲能力 在上室加入100 μL 基質(zhì)膠，37 ℃放置30 min。取100 μL 細(xì)胞懸液（1 × 105個）加入上室，下室加入600 μL 完全培養(yǎng)基，37 ℃孵育24 h。用棉簽將小室上層細(xì)胞輕輕擦去，室溫下甲醇固定下層細(xì)胞20 min，晾干后置于0.1%結(jié)晶紫中染色15 min，PBS 清洗。拍照并統(tǒng)計(jì)各組侵襲細(xì)胞數(shù)，每組隨機(jī)選取5 個視野進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 進(jìn)行分析，多個樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 法，數(shù)據(jù)以表示。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3 次，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 攜帶PTEN-Long慢病毒轉(zhuǎn)染的檢測結(jié)果 當(dāng)MOI 為50 時，熒光表達(dá)率為80%以上（圖1～3）。與對照組及空載組相比，RT-PCR 結(jié)果顯示過表達(dá)組PTEN-Long 的mRNA 表達(dá)量增加（F=65.42，P＜0.01，圖4、表1），Western blot 結(jié)果顯示過表達(dá)組PTEN-Long蛋白表達(dá)量增加（F=78.99，P＜0.01，圖5、表2）。PTEN-Long 在U251 細(xì)胞中穩(wěn) 定 過表達(dá)。

圖1 U251 細(xì)胞光鏡表達(dá)（對照組，SP×100，標(biāo)尺50 μm）Fig.1 Expression of U251 cells by light microscopy（control group，SP × 100，Bar：50 μm）

圖2 LV-EGFP 轉(zhuǎn)染U251 細(xì)胞的熒光表達(dá)（空載組，SP×100，標(biāo)尺50 μm） Fig.2 Expression of EGFP in U251 cells after transfection of LV-EGFP（empty group，SP × 100，Bar：50 μm）

圖3 LV-PTEN-Long-EGFP 轉(zhuǎn)染U251 細(xì)胞的熒光表達(dá)（過表達(dá)組，SP×100，標(biāo)尺50 μm）Fig.3 Expression of EGFP in U251 cells aftertransfection of LV-PTEN-Long-EGFP（overexpressed group，SP×100，Bar：50 μm）

2.2 PTEN-Long 抑制PI3K-AKT-NF-κB 信號通路的mRNA 表達(dá) 隨著PTEN-Long 的mRNA 水平增加，過表達(dá)組與對照組及空載組比，NF-κB p65（F=53.32，P＜0.01）、bcl-xl（F=933.88，P＜0.01）表達(dá)量減少，IκBα（F=26.61，P＜0.01）表達(dá)量增加，PTEN-Long 下調(diào)PI3K-AKT-NF-κB 信號通路（圖4、表1）。

2.3 PTEN-Long 抑制PI3K-AKT-NF-κB 信號通路的蛋白表達(dá) 隨著PTEN-Long 蛋白表達(dá)水平的增加，與對照組及空載組比，過表達(dá)組p-Akt（F=56.19，P＜0.01）、NF-κB p65（F=43.65，P＜0.01）、p-NF-κB p65（F=114.68，P＜0.01）、bcl-xl（F=19.26，P＜0.01）表達(dá)量減少，IκBα（F=45.23，P＜0.01）表達(dá)量增加。PTEN-Long 下調(diào)PI3K-AKT-NF-κB 信號通路（圖5、表2）。

2.4 PTEN-Long 抑制細(xì)胞增殖 通過CCK-8 法檢測0、24、48、72 h 的OD 值。與對照組及空載組比，過表達(dá)組細(xì)胞增殖能力降低（F=18.42，P＜0.01；F=79.72，P＜0.01；F=306.47，P＜0.01）（表3）。通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，結(jié)果顯示過表達(dá)組細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1 期（F=26.32，P＜0.01）（表4）。

圖4 通過凝膠電泳分析轉(zhuǎn)染前后mRNA 表達(dá)量變化Fig.4 Changes in mRNA expression after transfection were analyzed by agarose gel electrophoresis（n=3）

表1 通過2-△△Ct分析細(xì)胞中mRNA 的相對表達(dá)量Tab.1 Relative expression of mRNA in cells by 2-△△C（tn=3） ±s

表1 通過2-△△Ct分析細(xì)胞中mRNA 的相對表達(dá)量Tab.1 Relative expression of mRNA in cells by 2-△△C（tn=3） ±s

注：與對照組及空載組比較，**P ＜0.01

組別對照組空載組過表達(dá)組PTEN 1 1.04±0.09 1.13±0.21 PTEN-Long 1 1.16±0.16 69.37±14.62**AKT 1 0.99±0.08 1.02±0.69 NF-κBp65 1 1.03±0.09 0.54±0.07**IκBα 1 1.03±0.18 1.62±0.09**bcl-xl 1 0.99±0.03 0.20±0.03**

表2 細(xì)胞中蛋白的相對表達(dá)量Tab.2 Relative expression of protein in cells（n=3） ±s

表2 細(xì)胞中蛋白的相對表達(dá)量Tab.2 Relative expression of protein in cells（n=3） ±s

注：與對照組及空載組比較，**P ＜0.01

組別對照組空載組過表達(dá)組PTEN 0.70±0.06 0.67±0.04 0.72±0.05 PTEN-Long 0.28±0.04 0.23±0.03 0.59±0.55*AKT 0.45±0.04 0.44±0.05 0.42±0.07 p-Akt 0.46±0.53 0.44±0.04 0.09±0.05**NF-κBp65 0.71±0.04 0.65±0.04 0.39±0.05**p-p65 0.51±0.04 0.52±0.02 0.20±0.02**IκBα 0.73±0.04 0.69±0.04 0.95±0.03**bcl-xl 0.55±0.06 0.54±0.07 0.29±0.04**

圖5 Western blot 檢測轉(zhuǎn)染前后各蛋白的表達(dá)Fig.5 Expression of protein detected by Western blot（n=3）

表3 PTEN-Long 對細(xì)胞增殖的影響Tab.3 The effect of PTEN-Long on cell proliferation（n=3） ±s

表3 PTEN-Long 對細(xì)胞增殖的影響Tab.3 The effect of PTEN-Long on cell proliferation（n=3） ±s

注：與對照組及空載組比較，**P ＜0.01

組別對照組空載組過表達(dá)組0 h 0.58 0.58 0.58 24 h 1.59±0.09 1.60±0.11 1.21±0.14**48 h 2.29±0.08 2.14±0.09 1.58±0.11**72 h 2.76±0.11 2.61±0.15 1.08±0.08**

2.5 PTEN-Long 抑制細(xì)胞遷移 結(jié)果顯示PTENLong 抑制U251 細(xì)胞遷移，過表達(dá)組細(xì)胞遷移數(shù)量少，速度慢。在12、24 h 后，與對照組及空載組比，過表達(dá)組細(xì)胞遷移能力受抑制（F=128.42，P＜0.01；F=90.41，P＜0.01，圖6、表5）。

表4 PTEN-Long 對細(xì)胞周期的影響Tab.4 The effect of PTEN-Long on the cell cycle（n=3） ±s

表4 PTEN-Long 對細(xì)胞周期的影響Tab.4 The effect of PTEN-Long on the cell cycle（n=3） ±s

注：與對照組及空載組比較，**P ＜0.01

組別對照組空載組過表達(dá)組G0/G1（%）55.67±4.93 56.00±10.54 90.33±0.58**

表5 PTEN-Long 對細(xì)胞遷移的影響Tab.5 The effect of PTEN-Long on the ability of cells to migrate（n=3） ±s

表5 PTEN-Long 對細(xì)胞遷移的影響Tab.5 The effect of PTEN-Long on the ability of cells to migrate（n=3） ±s

注：與對照組及空載組比較，**P ＜0.01

組別對照組空載組過表達(dá)組愈合百分比（%）12 h 42.40±4.36 42.94±3.85 11.99±1.67**24 h 63.39±7.82 57.63±5.29 20.20±1.40**

2.6 PTEN-Long 抑制細(xì)胞侵襲 結(jié)果顯示過表達(dá)組侵襲細(xì)胞數(shù)量少。與對照組（124.20±6.29）及空載組（122.10 ± 5.04）相比，過表達(dá)組（37.90 ± 7.08）細(xì)胞侵襲能力受抑制（F=632.01，P＜0.01，圖7）。

3 討論

PTEN 可通過下調(diào)PI3K-AKT 及下游信號通路發(fā)揮腫瘤抑制作用，PTEN-Long 同樣可以作為PI3K 的拮抗劑，下調(diào)PI3K-AKT 信號通路。特殊的是PTEN-Long 比PTEN 多表達(dá)的173 個氨基酸賦予其細(xì)胞分泌及穿透作用，使其產(chǎn)物通過循環(huán)系統(tǒng)在全身發(fā)揮作用。

圖6 各組細(xì)胞遷移情況，黃線區(qū)域內(nèi)為劃痕面積Fig.6 The migration of cells in each group，and the scratch area was in the yellow line region（SP×40，Bar：100 μm，n=3）

圖7 通過結(jié)晶紫染色顯示侵襲細(xì)胞Fig.7 Invasive cells were visualized by crystal violet staining（SP×100，Bar 50 μm，n=3）

NF-κB 家族成員通常與IκBs 結(jié)合并存在于胞漿中。如IκBs 與p65 結(jié)合，當(dāng)IκBα被IKK 磷酸化，NF-κB-IκBs 復(fù)合物解離，p65 轉(zhuǎn)位于細(xì)胞核與相應(yīng)靶基因結(jié)合，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。本研究的結(jié)果表明，PTEN-Long 抑制AKT 磷酸化，IκBα磷酸化水平降低，進(jìn)而抑制p65 核轉(zhuǎn)位，影響轉(zhuǎn)錄過程，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。NF-κB 及下游信號通路活化后可促進(jìn)促血管生成因子的產(chǎn)生，激活內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的血管生成信號，促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。結(jié)果顯示過表達(dá)組細(xì)胞遷移數(shù)量少，速度慢，侵襲細(xì)胞數(shù)少于對照組。所以PTEN-Long 通過下調(diào)PI3K-AKT-NFκB 信號通路抑制U251 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

NF-κB 活化后可啟動cyclinD1 的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞周期由G0/G1 期向S 期的轉(zhuǎn)換，促進(jìn)細(xì)胞增殖，導(dǎo)致細(xì)胞惡化、癌變［8］。本研究顯示過表達(dá)組抑制AKT 及NF-κB 活化，影響NF-κB 對cyclinD1 轉(zhuǎn)錄的啟動作用，細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1 期。所以PTEN-Long 通過下調(diào)PI3K-AKT-NF-κB 信號通路阻滯細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖。NF-κB 與細(xì)胞存活及凋亡密切相關(guān)，PI3K-AKT 通過激活NF-κB 誘導(dǎo)抗凋亡基因表達(dá)增加。PTEN-Long 抑制PI3KAKT-NF-κB 通路活性，進(jìn)而抑制NF-κB 激活引起的凋亡耐受作用，抑制抗凋亡基因Bcl-xl 的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，PTEN-Long 具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。

有研究表明PTEN-Long 前導(dǎo)序列本質(zhì)上是無序的［9］，富含翻譯后修飾，增加了PTEN 的治療活力，使PTEN-Long 前導(dǎo)序列可被用于遞送治療性蛋白質(zhì)的有效載體，如PTEN-L-p53 顯著抑制U251的增殖、遷移和侵襲［10］。這提供了一種新方法來改善臨床中的癌癥治療［10-11］，避免腺病毒介導(dǎo)治療的不良反應(yīng)。研究顯示PTEN-Long 表達(dá)產(chǎn)物可以降低p-Akt 水平并抑制U87 增殖［12］，抑制HCV 復(fù)制［13］，抑制腎癌細(xì)胞生長［14］，還可抑制PINK1-Parkin 介導(dǎo)的線粒體自噬［15］。鑒于PTEN-Long 的優(yōu)勢，其有可能成為基因治療的新靶點(diǎn)。

綜上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了PTEN-Long 可在U251中通過下調(diào)PI3K-AKT-NF-κB 信號通路發(fā)揮腫瘤抑制作用。特殊的是膠質(zhì)瘤的治療存在血腦屏障問題，下一步可構(gòu)建裸鼠腦腫瘤模型，繼續(xù)探索PTEN-Long 對膠質(zhì)瘤的作用及機(jī)制。

感謝：感謝河北大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室各位老師的幫助。