邱英 周娟 杜豆 馬灝川 紀佳朋 張為民，

1 廣東藥科大學（廣州510006）；2中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院腫瘤科（廣州510010）

棘皮動物微管相關蛋白樣蛋白4-間變性淋巴瘤激酶（echinoderm microtubule-associated proteinlike 4-anaplastic lymphoma kinase，EML4-ALK）的小分子酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）是EML4-ALK 融合基因陽性晚期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者的標準一線治療。從2011年第一代ALK-TKI 克唑替尼獲得FDA 批準上市到現在已經發(fā)展到第三代勞拉替尼?？诉蛱婺嵋痪€治療EML4-ALK 陽性NSCLC的ORR 為74%，中位PFS 達10.9 個月［1］。二、三代ALK-TKIs 艾樂替尼、勞拉替尼等在克唑替尼耐藥及初治人群中均顯示出良好的療效［2-3］，但最終都會發(fā)生耐藥［4-5］。發(fā)現并克服ALK-TKIs 耐藥是目前EML4-ALK 陽性晚期NSCLC 治療面臨的重要問題，遺憾的是雖然一代ALK-TKI 克唑替尼的耐藥機制較明確，第三代ALK-TKI 勞拉替尼的耐藥機制未闡明，發(fā)現勞拉替尼耐藥機制并克服其耐藥是臨床重大課題。

體外建立耐藥細胞用于模擬臨床患者的獲得性耐藥，是研究耐藥機制的主要手段之一［6］。目前國內外建立了一代ALK-TKI 克唑替尼和二代ALK-TKI 艾樂替尼耐藥細胞系［7-8］，以及一線使用三代ALK-TKI 勞拉替尼耐藥細胞系［7］，但尚無在克唑替尼耐藥基礎上建立勞拉替尼耐藥細胞系的相關研究。為探索二線使用勞拉替尼的耐藥機制，本研究選用EML4-ALK 融合基因陽性、對克唑替尼耐藥的肺癌細胞SNU-2535，予以逐步遞增勞拉替尼劑量法建立獲得性耐藥細胞株SNU-2535 LR，探討其耐藥機制，并探討是否存在逆轉其耐藥的治療策略及耐藥后對不同化療藥物敏感性的差異，為臨床勞拉替尼耐藥后選擇合適的治療策略提供依據。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要實驗材料 人NSCLC 原發(fā)性克唑替尼耐藥細胞株SNU-2535 購自美國Creative bioarray 公司。勞拉替尼、克唑替尼、APR-246 粉末制劑購于美國Selleck 公司，順鉑、紫杉醇、培美曲塞、吉西他濱、多西他賽購自MCE 公司，RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶消化液購自美國Gibco 公司，CCK-8 細胞活性檢測試劑盒購自日本Dojindo 公司，二甲基亞砜（DMSO）購自美國MP 公司，ALK 一抗、兔二抗均購自美國CST 公司，β-actin一抗購自美國Affinity 公司，免疫印跡化學發(fā)光試劑ECL 購自美國Millipore 公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及勞拉替尼耐藥細胞株SNU-2535 LR 的建立 細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育，根據細胞狀態(tài)和密度更換培養(yǎng)液或傳代。采用逐步遞增藥物濃度法建立獲得性耐藥細胞株，取對數生長期的SNU-2535 細胞，以500 nmol/L勞拉替尼為初始濃度處理細胞，24 h 后更換培養(yǎng)液，去除凋亡細胞、細胞碎片以及代謝產物，避免對活細胞造成傷害，待細胞耐受并穩(wěn)定生長后，對細胞進行1∶2 傳代，倍增藥物濃度，最終細胞能夠耐受16 μmol/L 勞拉替尼，并在終濃度下維持培養(yǎng)1 個月，歷時7 個月成功建立了勞拉替尼耐藥細胞株，將其命名為SNU-2535 LR。

1.3 CCK-8 法 檢測SNU-2535 LR 細胞的勞拉替尼耐藥性：取對數生長期的SNU-2535、SNU-2535 LR 細胞，按每孔4 000 個細胞密度接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h 后，加入不同濃度的勞拉替尼，對SNU-2535 細胞起始濃度10 μmol/L，依次3 倍稀釋共6 個濃度梯度，對SNU-2535 LR 細胞起始濃度100 μmol/L，依次10 倍稀釋共6 個濃度梯度，同時設置空白對照組，每組設置5 個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，吸去上清，每孔分別加入RPMI-1640 培養(yǎng)基100 μL 和CCK-8 試劑10 μL，繼續(xù)孵育2 h 后檢測450 nm 處OD值，用Graphpad Prism 7.0 軟件計算半數抑制濃度IC50和耐藥指數（RI），RI=IC50（SNU-2535 LR）/IC50（SNU-2535）。

檢測耐藥前后細胞對克唑替尼的敏感性：具體操作和計算方法同上，對SNU-2535 細胞克唑替尼起始濃度30 μmol/L，依次3 倍稀釋共6 個濃度梯度，對SNU-2535 LR 細胞起始濃度10 μmol/L，依次10 倍稀釋共6 個濃度梯度。

檢測APR-246 對SNU-2535 LR 細胞耐藥性的逆轉作用：具體操作和計算方法同上，測P53蛋白激動劑APR-246對SNU-2535 LR細胞增殖的抑制作用時，APR-246 起始濃度為100 μmol/L，依次10 倍稀釋共6 個濃度梯度。聯合APR-246 和勞拉替尼時，將APR-246 濃度固定在5 μmol/L（小于APR-246 單藥IC50值），勞拉替尼起始濃度為100 μmol/L，依次10 倍稀釋共5 個濃度梯度，計算出聯合IC50值。逆轉倍數=IC50（勞拉替尼單藥）/IC50（APR-246 與勞拉替尼聯用）。

檢測SNU-2535、SNU-2535 LR 細胞對不同化藥物的敏感性：具體操作和計算方法同上，所有藥物依次10 倍稀釋共5 個濃度梯度，不同藥物對不同細胞選用的藥物濃度梯度有所不同，具體分組如下：順鉑組、培美曲塞組、吉西他濱組兩株細胞起始濃度分別為1 000、100、10 μmol/L；紫杉醇組SNU-2535 LR 細胞起始濃度為10 μmol/L，SNU-2535細胞起始濃度為100 μmol/L；多西他賽組SNU-2535 LR 細胞起始濃度為1 μmol/L，SNU-2535 細胞起始濃度為100 μmol/L。

1.4 二代測序（NGS）檢測細胞ALK及其它相關基因突變 取對數生長期的SNU-2535、SNU-2535 LR細胞消化離心棄上清后，用1 mL PBS 重懸后置于4 ℃冰盒中，送燃石醫(yī)學公司行NGS 技術檢測肺癌相關168 基因突變情況。

1.5 Western Blot分析相關蛋白的表達 SNU-2535與SNU-2535 LR 細胞加入裂解液，置于冰上裂解后提取蛋白并測定濃度，等量上樣后行8% SDSPAGE 分離蛋白，轉膜，封閉，按適當比例加入相應的一抗（按說明書稀釋），4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次，再加入相應二抗，室溫搖床反應1 h，TBST 洗膜3 次，最后用ECL 顯色并采用化學發(fā)光成像系統(tǒng)成像。

1.6 統(tǒng)計學方法 以上所有試驗重復3 次，應用Graphpad Prism 7.0 軟件作圖，SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件統(tǒng)計數據，數值以均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 耐藥細胞株SNU-2535 LR 的建立 歷時7 個月成功在體外構建勞拉替尼獲得性耐藥細胞株SNU-2535 LR，用不含藥物培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)洗脫勞拉替尼4 個月后，細胞毒性實驗結果提示，隨著勞拉替尼濃度的增加，親本細胞SNU-2535 和耐藥細胞SNU-2535 LR 的存活率都逐漸降低，勞拉替尼對SNU-2535 細胞增殖的抑制作用明顯強于SNU-2535 LR 細胞，勞拉替尼對他們IC50值分別為（1.362±0.324）μmol/L和（46.433±9.562）μmol/L（P＜0.05），RI 為34.092，表明SNU-2535 LR 細胞顯示出明顯的勞拉替尼耐藥特征。見圖1A、1B。

2.2 耐藥細胞株SNU-2535 LR ALK及其他相關基因突變變化 NGS 檢測結果顯示，SNU-2535 細胞EML4-ALK 融合基因陽性，且合并ALK p.G1269A點突變（克唑替尼耐藥繼發(fā)突變基因）；耐藥細胞SNU-2535 LR 較親本細胞SNU-2535 EML4-ALK豐度（55.45%vs.28.37%）及ALK p.G1269A 豐度（34.46%vs.0）顯著降低，新出現TP53 突變，豐度接近100%，未提示ALK 激酶域的繼發(fā)突變、融合基因擴增。

2.3 耐藥細胞株SNU-2535 LR 的EML4-ALK 相關蛋白表達變化 Western Blot 結果顯示，與親本細胞SNU-2535 比較，耐藥細胞SNU-2535 LR 的EML4-ALK V1、EML4-ALK V3 蛋白表達下降（P＜0.05）。見圖2。

2.4 耐藥細胞株SNU-2535 LR 對克唑替尼敏感性的變化 CCK-8 檢測結果顯示，克唑替尼對耐藥細胞SNU-2535 LR 的IC50值為（4.726 ± 1.056）μmol/L，與親本細胞（1.211 ± 0.033）μmol/L 相比，明顯升高（P＜0.05）。表明相對親本細胞，耐藥細胞不僅對勞拉替尼敏感性下降，對克唑替尼的敏感性也明顯下降。見圖1C、1D。

2.5 APR-246 對SNU-2535 LR 細胞耐藥性的逆轉作用 APR-246（5 μmol/L）聯合不同濃度的勞拉替尼作用于SNU-2535 LR 細胞，勞拉替尼的IC50值為（9.738 ± 0.548）μmol/L。與未加APR-246 處理時的（46.433 ± 9.562）μmol/L 相比，勞拉替尼對SNU-2535 LR 細胞的IC50 值明顯下降（P＜0.05），說明聯合APR-246 和勞拉替尼可以部分恢復SNU-2535 LR 細胞對勞拉替尼的敏感性，起到逆轉耐藥作用，計算得耐藥逆轉倍數為4.768。見圖1E、1F。

圖1 不同抑制劑對相應細胞的生長抑制曲線Fig.1 The growth inhibition curves of different inhibitors in SNU-2535 and SNU-2535 LR cells

圖2 Western Blot 檢測SNU-2535、SNU-2535 LR 細胞EML4-ALK 相關蛋白的表達Fig.2 The expressions of EML4-ALK-related proteins inSNU-2535 and SNU-2535 LR cells

2.6 耐藥細胞株對不同化療藥物敏感性變化 耐藥細胞株SNU-2535 LR 對吉西他濱、多西他賽、紫杉醇敏感性均優(yōu)于順鉑和培美曲塞（P＜0.05），其中多西他賽最為敏感。對比親本細胞，耐藥細胞株SNU-2535 LR 對吉西他濱、多西他賽、紫杉醇的敏感性明顯提高（P＜0.05），對順鉑的敏感性下降（P＜0.05）；對培美曲塞敏感性均較差，不可比較。見表1。

表1 SNU-2535 和SNU-2535 LR 細胞對不同化療藥物IC50值Tab.1 The IC50 values of different chemotherapeutic drugs in SNU-2535 and SNU-2535 LR cells ±s

表1 SNU-2535 和SNU-2535 LR 細胞對不同化療藥物IC50值Tab.1 The IC50 values of different chemotherapeutic drugs in SNU-2535 and SNU-2535 LR cells ±s

注：*表示與SNU-2535細胞比，IC50值差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；#P 值無法計算

IC50值紫杉醇（nmol/L）多西他賽（nmol/L）吉西他濱（μmol/L）順鉑（μmol/L）培美曲塞（μmol/L）SNU-2535 29 266.667±4 435.147 31 256.667±4 212.010 2.036±0.206 61.820±16.385＞100 SNU-2535 LR 0.305±0.146*0.021±0.013*0.173±0.041*278.833±40.092*＞100#

3 討論

本研究選取NSCLC 克唑替尼原發(fā)性耐藥細胞SNU-2535，經NGS 檢測證實EML4-ALK 融合基因陽性且合并ALK p.G1269A突變，通過藥物濃度遞增法構建勞拉替尼獲得性耐藥細胞系SNU-2535 LR，隨著藥物濃度的提高，細胞對勞拉替尼的敏感性逐漸降低，最終產生了顯著的耐藥，RI為34.092，提示體外首次在伴G1269A 突變的克唑替尼耐藥基礎上成功建立勞拉替尼耐藥細胞模型。

為進一步對SNU-2535 LR 細胞的耐藥機制進行探討，筆者對耐藥前后細胞行NGS 檢測發(fā)現EML4-ALK 豐度明顯降低，ALK p.G1269A 突變消失，未出現ALK 激酶域的二次突變或融合基因擴增等；通過Western Blot 實驗證實了SNU-2535 LR細胞EML4-ALK 融合基因相關蛋白EML4-ALK V1、EML4-ALK V3 表達下降；此外細胞毒性實驗結果提示SNU-2535 LR 細胞勞拉替尼、克唑替尼敏感性均相對親本細胞下降。以上結果表明ALK靶點減少可能是第三代ALK-TKI 獲得性耐藥的主要機制之一，與國外既往報道結果一致。ISOZAKI等［9］通過建立艾樂替尼獲得性耐藥細胞模型，發(fā)現其中一個耐藥細胞系EML4-ALK 融合基因消失；YODA 等［5］對臨床勞拉替尼耐藥后的患者行基因檢測，發(fā)現部分患者無繼發(fā)突變，原有ALK 耐藥突變位點的消失。這些結果表明ALK 靶點減少導致的獲得性耐藥繼續(xù)使用ALK-TKIs 時效果不佳。

有研究提示p53 蛋白激活劑APR-246，能將突變型p53 蛋白重新折疊成野生型構象，從而誘導突變型p53 蛋白細胞凋亡［10］。本研究中耐藥細胞系新出現TP53 突變，且豐度較高。所以本研究選用APR-246 嘗試逆轉SNU-2535 LR 耐藥，聯用5 μmol/L APR-246 后，勞拉替尼對SNU-2535 LR 的IC50值明顯下降，逆轉倍數為4.768，提示聯合APR-246可逆轉耐藥。以上結果表明TP53突變可能是第三代ALK-TKIs 獲得性耐藥的機制之一。GAINOR等［4］對臨床二代ALK-TKI 耐藥患者進行二次活檢發(fā)現，56%病理標本出現新的基因改變，其中TP53是最主要的突變基因，但該研究耐藥前未對標本進行相應的檢測，未能明確TP53 基因突變的產生能否導致耐藥。而本研究證實了TP53 基因是勞拉替尼耐藥后新出現的最主要突變基因，且聯合P53 蛋白激活劑能逆轉耐藥。

勞拉替尼作為最新一代ALK-TKI，能克服一、二代抑制劑耐藥，使肺癌患者從中獲益［11］，其耐藥將使得ALK 靶向治療陷入困境。針對勞拉替尼耐藥后對不同治療性藥物的敏感性如何，目前暫沒有臨床大樣本研究報道，在勞拉替尼獲得性耐藥株的基礎上探索耐藥后治療具有重要意義。本研究提示勞拉替尼耐藥后發(fā)生TP53 突變時，聯用P53 蛋白激活劑APR-246 能逆轉耐藥，這為臨床勞拉替尼耐藥合并TP53 突變患者的治療提供了一個新的方向。此外，本研究還探討了勞拉替尼耐藥后對臨床常用化療藥物的敏感性，提示耐藥細胞株對吉西他濱、多西他賽、紫杉醇敏感性均優(yōu)于順鉑和培美曲塞，其中多西他賽最為敏感，而且相對耐藥前對吉西他濱、多西他賽、紫杉醇的反應明顯增強，可為臨床勞拉替尼耐藥患者后續(xù)化療方案的選擇提供一定的指導。

綜上所述，本研究首次成功在克唑替尼耐藥基礎上建立勞拉替尼耐藥細胞模型，并發(fā)現EML4-ALK 融合基因豐度下降及TP53 突變可能是其耐藥機制之一。此外還發(fā)現，P53 蛋白激動劑聯合勞拉替尼可為臨床勞拉替尼耐藥合并TP53 突變患者提供一個新的治療方向；勞拉替尼耐藥后繼續(xù)化療時可以嘗試選擇吉西他濱、多西他賽、紫杉醇。雖然對本研究為臨床勞拉替尼耐藥患者的后續(xù)治療策略選擇提供了理論支撐，但仍需要擴大樣本在動物及臨床中加以證實。