肖瑤宇 李琳 李全超 劉洋 陳曉靜

摘? 要? 本研究利用RT-PCR技術(shù)從‘云香水仙的根中克隆得到了NtNAC1基因，并通過(guò)qRT-PCR技術(shù)分析了該基因的時(shí)空表達(dá)模式以及在逆境和逆境相關(guān)激素處理下的表達(dá)變化，結(jié)合分析過(guò)表達(dá)該基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株的表現(xiàn)等解析了該基因的功能。結(jié)果顯示：NtNAC1基因全長(zhǎng)1083 bp，其ORF為918 bp，編碼306個(gè)氨基酸，N端含有NAM保守結(jié)構(gòu)域，聚分在SNAC1亞組，與香蕉MusaSNAC1、小麥TaNAC47親緣關(guān)系較近。實(shí)時(shí)熒光定量分析顯示，NtNAC1的表達(dá)水平隨花器官花瓣和副冠的發(fā)育呈先上升后下降趨勢(shì)，始花期達(dá)到峰值;NtNAC1在根和葉中高表達(dá)，受ABA、MeJA、SA、H2O2、NaCl、PEG誘導(dǎo)上調(diào)，推測(cè)該基因可能參與‘云香水仙花器官的形態(tài)建成及響應(yīng)非生物脅迫。進(jìn)一步構(gòu)建表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草，獲得9株轉(zhuǎn)基因植株。在高鹽和干旱脅迫處理下，轉(zhuǎn)基因植株根系發(fā)達(dá)、長(zhǎng)勢(shì)更好、存活率高，表明水仙NtNAC1過(guò)表達(dá)能提高煙草對(duì)高鹽、干旱的耐受性，在抗逆中起正向調(diào)控作用，可作為提高水仙抗性的優(yōu)良遺傳基因資源。

關(guān)鍵詞? ‘云香水仙;NAC轉(zhuǎn)錄因子;非生物脅迫;功能分析

中圖分類號(hào)? S682.2+1? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

Abstract? NtNAC1 was cloned by RT-PCR from the roots of Narcissus tazetta ‘Yunxiang. The gene was further characterized by analyzing its tempo-spacial expression patterns in N. tazetta ‘Yunxiang plants， as well as changes in its expression in the leaves and roots under different stresses and stress-related hormones， and by analyzing the NtNAC1 over-expressing transgenic tobacco plants. The results showed that the cloned full-length cDNA was 1083 bp long， containing an ORF of 918 bp long which would putatively encode a peptide of 306 amino acid residues. The deduced protein possessed a highly conserved DNA binding domain， NAM， at its N-terminal， and was grouped， together with its most closely related proteins， MusaSNAC1 and TaNAC47， into the SNAC1 subgroup on the phylogenetic tree. Quantitative real-time PCR results showed that the expression level of NtNAC1 in petals and coronas first increased and then decreased as the floral organs developed， and reached a peak in the early flowering period. NtNAC1 was abundantly expressed in roots and leaves， and was induced by the treatments of ABA， MeJA， SA， H2O2， NaCl and PEG， indicating that it may be involved in the morphogenesis of floral organs in addition to its principal role in the responses of plants to abiotic stresses. Nine transgenic tobacco lines carrying NtNAC1 were obtained by agrobacterium-mediated transformation and three of them were over-expressing lines. The NtNAC1 over-expressing lines showed better developed root systems and higher survival rates under the treatments of high concentrations of salt and mannitol， as compared with the non-transgenic plants. Our results showed that expressing NtNAC1 increased stress tolerance of plants and its potential in the improvement of abiotic stress resistance of N. tazetta could be further exploited.

Keywords? Narcissus tazetta‘Yunxiang; NAC transcription factor; abiotic stress; functional analysis

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.05.012

植物經(jīng)常遭受干旱、高鹽等非生物脅迫，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育造成負(fù)面影響。通過(guò)分子育種方法來(lái)改善植物的脅迫耐受性很有意義[1]。作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一的NAC（NAM、ATAF1/2、CUC2）轉(zhuǎn)錄因子除參與植物生長(zhǎng)發(fā)育外，還在抵御生物和非生物脅迫中發(fā)揮重要作用[2]，并已用于基因工程來(lái)改善植物的脅迫耐受性[3]，如，水稻OsNAC14響應(yīng)ABA、干旱、高鹽和低溫脅迫，過(guò)表達(dá)植株穗數(shù)多、灌漿率高，表現(xiàn)出優(yōu)于野生型的抗旱性[4];大豆GmNAC085轉(zhuǎn)入擬南芥，干旱脅迫下過(guò)表達(dá)植株蒸騰速率降低，生長(zhǎng)遲緩，增強(qiáng)了對(duì)干旱的耐受性[5];陸地棉GhSNAC3受高鹽、干旱和ABA處理誘導(dǎo)表達(dá)，過(guò)表達(dá)該基因的轉(zhuǎn)基因煙草在逆境脅迫下初生根伸長(zhǎng)、鮮重增加，抗旱性和耐鹽性提高[6];菊花DgNAC1在ABA、鹽、干旱、低溫處理下上調(diào)表達(dá)，過(guò)表達(dá)該基因的轉(zhuǎn)基因菊花的葉水勢(shì)、相對(duì)含水量升高，具有更高的抗旱性和耐鹽性[7];堿蓬S1NAC8通過(guò)調(diào)節(jié)脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性[8];多毛番茄ShNAC1受PEG、4 ℃和鹽脅迫上調(diào)，但過(guò)表達(dá)ShNAC1負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)基因植株的抗寒/旱和耐鹽能力[9];御谷PgNAC21在ABA和鹽脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)，在擬南芥中過(guò)表達(dá)該基因使GSTF6、COR47、RD20等脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)量上調(diào)，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株種子萌發(fā)、根系伸長(zhǎng)，提高植株對(duì)鹽脅迫的耐受性[10]。但目前對(duì)中國(guó)水仙NAC轉(zhuǎn)錄因子在逆境脅迫下的調(diào)節(jié)作用知之甚少。

中國(guó)水仙為冬季主要觀賞花卉之一，但其產(chǎn)量和品質(zhì)在很大程度上受外界環(huán)境因子影響。這是因?yàn)槠澉[莖肥大，且根為肉質(zhì)根，生長(zhǎng)發(fā)育期間對(duì)水分要求高。水仙需要在夏季打破休眠萌芽，全球氣溫變暖和旱季延長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致水仙休眠期延長(zhǎng)、萌芽期推遲、全生育期縮短、發(fā)育不良、產(chǎn)品質(zhì)量下降等后果，這種影響在水仙主產(chǎn)地漳州日益顯現(xiàn)。因此，提高水仙對(duì)脅迫的耐受性，培育抗逆水仙新品種有著現(xiàn)實(shí)需求。

李夢(mèng)思等[11]從‘云香水仙中克隆了NtNAC3153，表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)NtNAC3153在ABA、高鹽和50 ℃脅迫下能被誘導(dǎo)，故該基因可能和其他作物的同類基因一樣參與抗逆調(diào)控。本研究以抗性強(qiáng)的水仙新品種‘云香為研究材料，克隆獲得1條NAC基因NtNAC1，分析了其在組織及逆境脅迫下的表達(dá)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試材料為多花水仙新品種‘云香。2017年10月初選取三年生種球置于4 ℃低溫下處理1個(gè)月，之后進(jìn)行外源激素和非生物脅迫處理：0.1 mmol/L脫落酸（ABA）、0.1 mmol/L茉莉酸甲酯（MeJA）、2 mmol/L水楊酸（SA）、10 mmol/L過(guò)氧化氫（H2O2）、250 mmol/L氯化鈉（NaCl）和20%聚乙二醇（PEG6000），以未經(jīng)處理（0 h）為對(duì)照，處理期間分別采集根和葉。常溫下水培種球至開(kāi)花，期間分別采集根、葉、鱗莖等組織部位，以及花器官整個(gè)發(fā)育時(shí)期的花瓣和副冠。具體處理過(guò)程和取樣方式參照溫秀萍等[12]的方法。所采樣品用EZNA Plant RNA Kit（OMEGA）試劑盒提取樣品總RNA，電泳檢測(cè)選取完整的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）合成cDNA，無(wú)酶水稀釋至工作濃度10 μmol/L，?20 ℃保存，用于后續(xù)PCR試驗(yàn)。

1.2? 方法

1.2.1? NtNAC1基因的全長(zhǎng)cDNA的克隆與分析? 從‘云香水仙轉(zhuǎn)錄組中查找NAC基因，選取ORF完整且差異表達(dá)的序列，經(jīng)Blastp比對(duì)分析選取1條可能與抗性相關(guān)的基因進(jìn)行研究。Primer 6.0設(shè)計(jì)引物NtNAC1-F：5-CAAGAATGAGGGCTGAAGTT-3和NtNAC1-R：5′-GAAGAAGAATGGGAAGAAGGAC-3′，以根尖cDNA為模板，用TaKaRa Ex Taq進(jìn)行基因RT-PCR擴(kuò)增，具體擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序參照試劑盒參數(shù)，退火溫度為58 ℃。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，凝膠成像儀觀測(cè)割取目的條帶，EZNA Gel Extraction Kit（OMEGA）試劑盒膠回收純化，連接pMD18-T（TaKaRa）轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，過(guò)夜培養(yǎng)挑取單菌落，菌液PCR鑒定后送測(cè)序。

為預(yù)測(cè)NtNAC1蛋白的生物學(xué)功能，利用在線工具Protparam、TMHMM、SignalP、Netphos等分別分析氨基酸理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽、磷酸化位點(diǎn);利用SOPM、Swiss-model預(yù)測(cè)蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu);利用Blastp進(jìn)行同源蛋白基因的檢索，MEGA 6.0鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.2? NtNAC1基因的表達(dá)分析? 設(shè)計(jì)qRT-PCR引物NtNAC1-YG-F：5′-GGTTGGATGATTGGGTTCTC-3′和NtNAC1-YG-R：5′-CGTGTCCTCGTTTGCTTCTA-3′，內(nèi)參同前人研究[13]，引物為Actin-F：5′-TGCCCAGAAGTGCTATTCCAG-3′和Actin-R：5′-GTTGACCCACCACTAAGAACAATG-3′。擴(kuò)增體系參照SYBR? Premix Ex Taq?（TaKaRa）試劑盒參數(shù)選用25 μL體系，反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，39個(gè)循環(huán)數(shù)。65～95 ℃每隔0.5 ℃分析溶解曲線，檢測(cè)引物的專一性。每個(gè)處理均重復(fù)3次，采用2???Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3? NtNAC1表達(dá)載體構(gòu)建? 根據(jù)載體構(gòu)建酶切原則，選用Spe Ⅰ和Asc Ⅰ（NEB）在37 ℃下雙酶切載體pMDC140，電泳檢測(cè)回收大片段線性化載體。同時(shí)采用In-Fusion克隆技術(shù)，設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)的引物NtNAC1-V-F：5′-CGACTCTAGAA CT AGTCAAGAATGAGGG CTGAAGTT-3′（Spe I）和NtNAC1-V-R：5′-TAGA GTCGAGGCGCGC CG AAGAAGAATGGGAAGA AGGAC-3′（Asc I）擴(kuò)增目的基因，產(chǎn)物回收純化，通過(guò)5X In-Fusion HD Enzyme Premix連接得到2× 35S ：： NtNAC1-G US融合載體。

1.2.4? 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化及分子檢測(cè)? 以無(wú)菌組培苗齡5周的煙草葉片為材料，切成1～2 cm2的葉盤(pán)預(yù)培養(yǎng)3 d后，將2×35S ：： NtNAC1-GUS植物表達(dá)載體通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV1301菌株中，28 ℃下培養(yǎng)液體菌液OD600值為0.4～0.6，4000 r/min離心15 min收集菌體，再以含100 mmol/L AS（乙酰丁香酮）的MS液體培養(yǎng)基重懸菌體，室溫靜置5 h后，葉盤(pán)法[14]轉(zhuǎn)化煙草。通過(guò)含有潮霉素（Hyg）的MS培養(yǎng)基篩選愈傷組織、抗性芽至獲得抗性植株，以TransDirect Plant Tissue PCR Kit（TRAN）試劑盒提取DNA，用于PCR鑒定，同時(shí)GUS組織化學(xué)法染色幼嫩葉片觀察顯色結(jié)果，于顯微鏡下拍照。

1.2.5? NtNAC1轉(zhuǎn)基因煙草抗旱性和耐鹽性鑒定? 篩選飽滿的T1代種子，消毒后置于含有Hyg的1/2 MS培養(yǎng)基室溫培養(yǎng)，同時(shí)將野生型種子置于1/2 MS平板培養(yǎng)至種子萌發(fā)，一部分幼苗分別轉(zhuǎn)移到含有10 μmol/L ABA、150 mmol/L NaCl、150 mmol/L甘露醇的1/2 MS平板垂直培養(yǎng)，以1/2 MS平板為對(duì)照，培養(yǎng)7 d后測(cè)量根長(zhǎng)。另一部分幼苗移栽花盆營(yíng)養(yǎng)土（泥炭土∶蛭石=3∶1）培養(yǎng)，3～4葉期時(shí)分別進(jìn)行不同脅迫處理，以野生型植株做對(duì)照。室溫條件下連續(xù)干旱脅迫處理15 d，觀測(cè)植株長(zhǎng)勢(shì)。高鹽處理之前需控制土壤水分，防止土壤水分過(guò)大稀釋鹽溶液，影響脅迫效果，控水10 d后，以400 mmol/L NaCl連續(xù)脅迫處理15 d，每3 d澆灌150 mL，觀測(cè)植株表型。

1.3? 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次技術(shù)及生物學(xué)重復(fù)。采用SPSS 20軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，進(jìn)行單因素方差分析不同脅迫隨處理時(shí)間變化的差異顯著性（P<0.05），并使用Sigmaplot 12軟件作圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? NtNAC1基因cDNA全長(zhǎng)的克隆與分析

采用RT-PCR克隆方法，擴(kuò)增得到1條長(zhǎng)度為1083 bp的目的條帶，命名為NtNAC1（GenBank：MG755187.1）。NtNAC1基因的ORF為918 bp，編碼306個(gè)氨基酸，組成蛋白分子式C1579H2395N439O484S12，分子量為35.7 ku，等電點(diǎn)為5.83，其中帶負(fù)電的氨基酸（Asp+Glu）43個(gè)，帶正電的氨基酸（Arg+Lys）39個(gè)，不穩(wěn)定系數(shù)為54.53，脂肪系數(shù)為52.91，親水性總平均系數(shù)為?0.995，推測(cè)其屬于酸性、親水性、不穩(wěn)定型蛋白。NtNAC1蛋白沒(méi)有檢測(cè)到跨膜區(qū)域和信號(hào)肽，且亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)位于細(xì)胞核，推測(cè)該蛋白為非分泌型蛋白和核蛋白。絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化修飾位點(diǎn)分別有19、9、4個(gè)，該蛋白以絲氨酸修飾為主導(dǎo)，可能參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)發(fā)育等生理過(guò)程。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)元件主要由58.50%無(wú)規(guī)則卷曲、24.18%α-螺旋、14.05%延伸鏈、3.27%-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)組成;蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模參考與抗性相關(guān)的水稻SNAC1蛋白，結(jié)構(gòu)相似性達(dá)84.62%，推測(cè)NtNAC1具有相似功能，參與抗逆性調(diào)控。

2.2? NtNAC1蛋白同源比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析

利用NCBI搜索NtNAC1蛋白同源序列進(jìn)行多序列比對(duì)，分析發(fā)現(xiàn)與單葉植物石刁柏（Asparagus officinalis）、番紅花（Crocus sativus）和雙子葉植物睡蓮（Nelumbo nucifera）、博落回（Macleaya cordata）相似性分別為79%、69%、65%、63%，而與同一品種‘云香NtNAC3153蛋白序列一致性僅為31.05%。NtNAC1蛋白氨基端同源性高，第15～141位氨基酸殘基組成NAM結(jié)構(gòu)域，包含A～E等5個(gè)子域，其中子域A、C、D相較B、E同源性高，C子域含有核定位信號(hào)（NLS：PRDRKYP），而羧基端同源性低，由此認(rèn)為NtNAC1是NAC轉(zhuǎn)錄因子家族新成員。選取已知具有抗逆脅迫功能的水稻、擬南芥、小麥等不同植物的NAC氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)聚類分析，NtNAC1主要聚集SNAC1亞組，與香蕉MusaSNAC1和小麥TaNAC47親緣關(guān)系較近。

2.3? NtNAC1基因組織表達(dá)分析

‘云香水仙NtNAC1基因在各個(gè)器官、組織以及不同的花發(fā)育時(shí)期中均有表達(dá)，在根中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，為鱗莖的31.32倍?；ò旰透惫谥蠳tNAC1表達(dá)量在花蕾期沒(méi)有發(fā)生顯著變化，

之后該基因的表達(dá)量隨花器官發(fā)育呈先上升后下降趨勢(shì)，始花期副冠中NtNAC1的表達(dá)量達(dá)到峰值，為花苞期的2.68倍，盛花期花瓣中NtNAC1的表達(dá)量到達(dá)峰值，為花苞期的4.52倍。同一發(fā)育時(shí)期，除花蕾期花瓣中NtNAC1的表達(dá)量稍微低于副冠，其余時(shí)期高于副冠，

2.4? NtNAC1在非生物脅迫下表達(dá)分析

通過(guò)qRT-PCR技術(shù)分析NtNAC1基因在外源激素ABA、MeJA、SA和H2O2、NaCl、PEG非生物脅迫處理下的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，同一處理時(shí)間點(diǎn)根中NtNAC1上調(diào)表達(dá)量大于葉片，具有組織表達(dá)特異性;同一組織中NtNAC1的表達(dá)量隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)不同程度上調(diào)，且差異顯著。外源激素ABA和MeJA誘導(dǎo)下，葉和根中NtNAC1的表達(dá)水平上調(diào)8～16倍，SA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)量相對(duì)較低在4倍以下。H2O2脅迫下，NtNAC1的表達(dá)量在葉片先下降后上升，24 h時(shí)達(dá)到峰值，為對(duì)照的5.72倍;根中的表達(dá)量與葉片相反，先上升后下降至對(duì)照水平，而后急劇上升12 h時(shí)達(dá)到峰值，為對(duì)照的7.57倍。NaCl和PEG脅迫下，葉和根中NtNAC1的表達(dá)量上調(diào)20倍以上，均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，葉片NaCl脅迫12 h時(shí)出現(xiàn)峰值為對(duì)照的23.79倍，而PEG脅迫峰值出現(xiàn)較晚，24 h時(shí)出現(xiàn)峰值為對(duì)照的28.80倍;根中NaCl和PEG表達(dá)量均在6 h時(shí)達(dá)到峰值，分別為對(duì)照的42.88倍、34.61倍。結(jié)果表明‘云香水仙NtNAC1基因能被ABA、MeJA、SA、H2O2、NaCl、PEG等非生物逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。

2.5? NtNAC1轉(zhuǎn)基因煙草的分子鑒定

隨機(jī)選擇12株抗性植株，稀釋其DNA至同一濃度，PCR擴(kuò)增1～9號(hào)泳道出現(xiàn)約1000 bp特異性條帶，與重組質(zhì)粒長(zhǎng)度一致，獲得9株陽(yáng)性株系。GUS染色顯示，陽(yáng)性株系呈現(xiàn)藍(lán)色且維管束部分顏色較深。以上結(jié)果均表明‘云香NtNAC1已成功導(dǎo)入煙草中，選取條帶明亮的2、3、9號(hào)株系繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)轉(zhuǎn)基因植株的功能鑒定。

2.6? NtNAC1轉(zhuǎn)基因煙草株系抗逆性鑒定

T1代陽(yáng)性株系根長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，正常生長(zhǎng)條件下（對(duì)照組1/2 MS），野生型與轉(zhuǎn)基因植株根長(zhǎng)無(wú)明顯差別。模擬逆境脅迫下根長(zhǎng)均受到不同程度的抑制，野生型植株根系伸長(zhǎng)嚴(yán)重受阻，其中ABA處理后，植株根長(zhǎng)小于10 mm受抑制程度最嚴(yán)重，甘露醇、NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因株系根長(zhǎng)較野生型發(fā)育良好，這表明NtNAC1過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草根系對(duì)ABA的敏感性和對(duì)干旱、高鹽的耐受性。

煙草植株WT和3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（TP-2、TP-3、TP-9）3～4葉期時(shí)進(jìn)行抗逆性鑒定，對(duì)照組正常生長(zhǎng)條件，過(guò)表達(dá)NtNAC1轉(zhuǎn)基因植株和野生型表型無(wú)顯著差異;實(shí)驗(yàn)組15 d脅迫處理后發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草相較對(duì)照組生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，葉片表面積小，野生型植株葉片開(kāi)始變黃，而轉(zhuǎn)基因植株長(zhǎng)勢(shì)良好;鹽脅迫下大部分植株葉片萎蔫發(fā)黃，甚至枯萎，野生型枯萎速度高于轉(zhuǎn)基因植株，表明水仙NtNAC1過(guò)表達(dá)減輕了逆境脅迫產(chǎn)生的損害，提高了煙草的抗性。

不同小寫(xiě)字母表示在相同組織中不同處理時(shí)間點(diǎn)的差異顯著性（P<0.05）。

3? 討論

NAC轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于植物中，參與響應(yīng)高鹽、干旱、低溫或高溫等非生物脅迫，其基因功能的多效性在轉(zhuǎn)基因應(yīng)用中非常有益，即通過(guò)改變1個(gè)NAC基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)多種定向改良[15]，因此克隆和鑒定優(yōu)良非生物脅迫相關(guān)NAC轉(zhuǎn)錄因子具有重要意義?！葡闼奢^其他多花水仙品種抗性強(qiáng)[16]，本研究利用RT-PCR技術(shù)從‘云香水仙中克隆了1個(gè)新的NAC轉(zhuǎn)錄因子基因NtNAC1，其編碼的蛋白與同一品種‘云香NtNAC3153蛋白相似性低，在C端幾乎沒(méi)有相同的殘基，表明兩者分化較久，在功能上可能有所分化。這一現(xiàn)象也出現(xiàn)在其他植物中，包括擬南芥AtNAM[17]、大豆GmNAC1～6[18]、陸地棉GhNAC1～6[19]、鷹嘴豆CarNAC1～6[20]等。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果，NtNAC1聚分在SNAC1亞家族。同一亞家族中，小麥TaNAC47在擬南芥中過(guò)表達(dá)時(shí)增加了植株對(duì)外源ABA的敏感度，增強(qiáng)了對(duì)干旱、鹽和低溫脅迫的耐受性[21];香蕉MusaSNAC1通過(guò)提高干旱脅迫下保衛(wèi)細(xì)胞中H2O2含量來(lái)誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉，減少水分損失，從而提高過(guò)表達(dá)株系的抗旱性[22]。由此，可推測(cè)NtNAC1與這些蛋白具有相似功能，即響應(yīng)逆境脅迫，提高植株的抗性。

本研究中，NtNAC1的表達(dá)水平主要受ABA、MeJA、SA、H2O2、NaCl、PEG脅迫誘導(dǎo)，具有時(shí)空特異性。這一表達(dá)模式不僅與‘云香NtNAC3153相似，即均能被ABA、高鹽誘導(dǎo)（NtNAC1峰值表達(dá)量高于NtNAC3153，其基因功能可能更強(qiáng)大），還與SNAC1亞家族其他植物基因類似，例如，擬南芥ANAC019、ANAC072在葉和根中高表達(dá)，鹽脅迫下葉和根中的表達(dá)量上調(diào)[23];小麥TaNAC29、TaNAC2D在葉中高表達(dá)，根中表達(dá)量相對(duì)較低，鹽、干旱、ABA等非生物脅迫下葉和根中的表達(dá)量均急劇上升[24];小麥TaNAC47受ABA、4 ℃、PEG、高鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[21]。顯然，抗逆基因的可誘導(dǎo)性有利于植物快速響應(yīng)不同的逆境，增加在逆境下的生存能力。本文發(fā)現(xiàn)，NtNAC1的表達(dá)具有時(shí)空特異性，比如在根中表達(dá)量高、葉中次之;在花瓣和副冠中的表達(dá)模式也不同，除可能與這些組織或器官的發(fā)育階段不同對(duì)逆境的抵抗力不同這一解釋外，我們不能排除該基因還有其他潛在的生物學(xué)功能。

大量研究表明，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將NAC過(guò)表達(dá)，能不同程度地提高對(duì)非生物脅迫的耐受性。如，小麥TaRNAC1在根系過(guò)量表達(dá)，可以促進(jìn)根發(fā)育、增加生物量和產(chǎn)量，提高抗旱性[25];陸地棉GhNAC79過(guò)表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥、棉花的抗旱性[26];鷹嘴豆CarNAC6在擬南芥中過(guò)表達(dá)，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株根系生長(zhǎng)，提高其對(duì)干旱和高鹽的耐受性[27]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將水仙NtNAC1轉(zhuǎn)入煙草中過(guò)表達(dá)，促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因植株的根系發(fā)育，增加了干旱和鹽脅迫下的存活率，表型觀察未發(fā)現(xiàn)NtNAC1過(guò)表達(dá)有明顯的負(fù)面影響，表明該基因作為抗旱、耐鹽的良好遺傳資源，在水仙的抗性分子改良上有潛在應(yīng)用價(jià)值。

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