吳　駿　羅　漫　郝志華　謝玉凱　黃曉冰　馬維苑　田　鈴

?

家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其應(yīng)用

吳駿羅漫郝志華謝玉凱黃曉冰馬維苑田鈴

（華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院 廣東廣州 510642）

自家蠶基因組測序完成以來，家蠶的相關(guān)研究進入了后基因組時代，也使得家蠶的轉(zhuǎn)基因技術(shù)得以迅速的發(fā)展。文章介紹了家蠶中轉(zhuǎn)基因的技術(shù)及其發(fā)展現(xiàn)狀，為今后的基因編輯技術(shù)、轉(zhuǎn)基因家蠶研究以及生物反應(yīng)器等應(yīng)用提供了借鑒與參考。

家蠶；轉(zhuǎn)基因；基因編輯；生物反應(yīng)器

自20 世紀80年代開始，在世界范圍內(nèi)掀起了動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究熱潮。1984年，我國開始了轉(zhuǎn)基因動物的研究，并取得了一系列成果，如：含人—珠蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建[1]、含乙型肝炎表面抗原基因的轉(zhuǎn)基因兔的獲得，以及我國首例轉(zhuǎn)基因克隆牛的誕生[2]，這些都標志著我國在轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域有了一定的研究進展。

家蠶（）為鱗翅目絹絲昆蟲，是我國重要的特種經(jīng)濟動物，主要以桑葉為食，分泌的蠶絲是一種天然的紡織原料。蠶絲產(chǎn)業(yè)曾在我國出口創(chuàng)匯和脫貧致富中發(fā)揮著重要的作用，但是隨著我國經(jīng)濟結(jié)構(gòu)的調(diào)整以及社會需求的轉(zhuǎn)變，傳統(tǒng)蠶桑產(chǎn)業(yè)已經(jīng)發(fā)展到瓶頸期，如何進行傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)改革、利用家蠶進行多元化開發(fā)已成為當今家蠶研究領(lǐng)域的一個熱點與難點。

2004年我國科學家率先完成了家蠶基因組的測序工作，使得我國家蠶遺傳或是分子生物學的研究開始走在世界的前列。同時，隨著基因組學相關(guān)技術(shù)的不斷深入與發(fā)展，尤其是基因組精準編輯技術(shù)和轉(zhuǎn)基因家蠶技術(shù)的不斷推進，使其在家蠶科學研究中的應(yīng)用也越來越廣泛。以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為工具，對家蠶的功能基因進行遺傳操作，進而嘗試表達目的蛋白或者改變家蠶經(jīng)濟性狀已經(jīng)成為了研究熱點。本文綜述了近年來適用于家蠶轉(zhuǎn)基因的技術(shù)和轉(zhuǎn)基因應(yīng)用成果，以期為今后的相關(guān)研究提供參考。

1 家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)

1.1 家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作的方法

轉(zhuǎn)基因技術(shù)指的是將外源DNA片段利用基因工程技術(shù)導入特定的受體中，使之與受體的基因進行重組，并穩(wěn)定表達的一種實驗技術(shù)。在家蠶中常用的操作方法有：顯微注射法、精子介導法、基因槍法等。

1.1.1 顯微注射法

顯微注射技術(shù)是一種通過顯微注射操作儀將外源物質(zhì)、細胞核或細胞注入到受體中的微操作技術(shù)，應(yīng)用廣泛且效果良好。Tamura[3]等于1990年建立家蠶顯微注射操作技術(shù)，并成功獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因家蠶品系。目前，利用顯微注射法進行家蠶轉(zhuǎn)基因操作已經(jīng)非常成熟，并有了很多創(chuàng)新，如Sun[4]等構(gòu)建了兩個轉(zhuǎn)基因RNAi載體，并利用顯微注射法獲得了具有濃核病抗性的轉(zhuǎn)基因家蠶品系。但是，該方法對儀器和操作人員的技術(shù)有一定的要求，且可能會導致卵體受傷、孵化率低等問題。

1.1.2 精子介導法

精子介導法是一種利用精子能瞬間吸收外源基因的特性，將整合了外源目的基因的載體與精子進行預培養(yǎng)，使部分精子帶上外源基因，在受精時與卵細胞結(jié)合，達到基因重組目的的一種方法。具體可分為先注后交法、先交后注法、人工受精法。郭秀洋[5]等、Zhou[6]等都利用該方法成功得到轉(zhuǎn)基因家蠶，驗證了該方法的可行性。

1.1.3 基因槍導入法

基因槍導入法又被稱為粒子轟擊技術(shù)，孟智啟[7]等于1992年首次使用該方法，成功將金屬粒子以550 ～ 600 m/s的轟擊速度沖破卵殼打入卵內(nèi)，經(jīng)過檢測大多數(shù)卵發(fā)育正常，利用該方法一些科學家獲得了表達目的基因的轉(zhuǎn)基因家蠶品系。

1.1.4 其他方法

除上述幾種常用的方法外，轉(zhuǎn)基因家蠶的操作方法還包括壓力滲透導入法 (osmoticmethod, OM)[8]、脈沖場電泳法(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)、電穿孔導入法(electroporation)及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等，都有一定的可行性。

1.2 家蠶轉(zhuǎn)基因載體

轉(zhuǎn)基因載體是一類裝載有外源 DNA并且能使其隨自身復制而得到擴增的DNA構(gòu)造，它可以將外源DNA在一定條件下插入到宿主基因中。轉(zhuǎn)基因載體包括一些固有的元件，如啟動子、轉(zhuǎn)座子序列等。在進行轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灂r，除了注意目的基因的導入方法和導入時期外，選擇合適的啟動子和構(gòu)建合適類型的載體也是影響實驗的關(guān)鍵因素。

1.2.1 家蠶轉(zhuǎn)基因所用載體的啟動子

啟動子是一段能識別、結(jié)合RNA聚合酶并使自身活化、啟動轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。在轉(zhuǎn)家蠶基因的研究中，適合的啟動子是決定外源基因能否成功表達的重要因素之一。目前常見的家蠶轉(zhuǎn)基因所用載體的啟動子有肌動蛋白A3啟動子[9]、人工啟動子3Xp3[10]、熱激蛋白啟動子[11]、抗菌肽啟動子、家蠶絲心蛋白啟動子[12]和家蠶核型多角體病毒早期即刻蛋白基因啟動子[13]等。

1.2.2 家蠶轉(zhuǎn)基因所用載體類型

1.2.2.1 基于轉(zhuǎn)座子的載體

piggyBac轉(zhuǎn)座子是一種DNA轉(zhuǎn)座子，由于存在可攜帶較長的基因片段、整合效率較高等優(yōu)點，它在家蠶的轉(zhuǎn)基因技術(shù)中得到了廣泛應(yīng)用。在2000年，Tamura[14]等首次將piggyBac轉(zhuǎn)座子應(yīng)用于家蠶中，其將家蠶細胞質(zhì)肌動蛋白（BmA3）啟動子和綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）基因連在含piggyBac的末端重復序列的質(zhì)粒上，與含有piggyBac轉(zhuǎn)座酶基因的輔助質(zhì)粒共同注射于胚胎前期蠶卵中，雖然成功獲得轉(zhuǎn)基因品系，但是表達效果并不理想。針對BmA3啟動子效率較低的問題，Horn和Wimmer將piggyBac載體進行改進，之后Thomas[15]用改進的piggyBac載體注射蠶卵，并取得較好的表達效果。

minos轉(zhuǎn)座子是一種可在家蠶胚胎和營養(yǎng)細胞中轉(zhuǎn)移DNA的轉(zhuǎn)座元件[16]，Shimizu[17]、Uchino[18]等先后將其應(yīng)用于家蠶轉(zhuǎn)基因研究中。Mosl元件也可應(yīng)用于家蠶轉(zhuǎn)基因研究中，Wang[19]等利用其成功將外源基因?qū)塍w外培養(yǎng)的家蠶細胞（Bm5）中，由于minos轉(zhuǎn)座子和Mosl元件都具有插入位點不確定性的缺點，因此后來都被piggyBac轉(zhuǎn)座子所取代[20]。

1.2.2.2 基于病毒的載體

研究發(fā)現(xiàn)，桿狀病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒也可以充當載體，將目的基因高效地整合到家蠶基因組中，是一種良好的家蠶轉(zhuǎn)基因工具。桿狀病毒主要以家蠶核型多角體病毒 （BmNPV）和苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（AcMNPV）為主，其原理主要是將目的基因插入到病毒的特定位點，利用病毒的特性，使外源基因整合到家蠶基因組中。相關(guān)的研究有，張峰[21]等利用家蠶細胞質(zhì)肌動蛋白基因（A3）啟動子和NPV病毒即刻早期蛋白IE啟動子成功在家蠶細胞中表達了GFP基因。

逆轉(zhuǎn)錄病毒的應(yīng)用起步于20世紀90年代末，Nikolaev[22]等、Chan等先后利用逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR序列分別介導外源基因整合到家蠶、牛的基因組中；后來，河本夏雄等利用反轉(zhuǎn)錄病毒的LTR序列將GFP基因?qū)爰倚Q體細胞，并對G0代幼蟲進行了RCR檢驗，發(fā)現(xiàn)了病毒載體成功侵入胚胎細胞中，逆轉(zhuǎn)錄出了cDNA。

1.2.2.3 基因打靶載體

隨著相關(guān)技術(shù)的提升，基因打靶技術(shù)在轉(zhuǎn)基因家蠶研究中得到一定的應(yīng)用，即利用同源重組原理，將外源基因定向地融合進靶細胞基因組中的某個位點。自20世紀80年代興起后，逐漸被科學家用來對某一確定位點的基因進行定點突變，以達到修飾基因的目的。相較于較常用的piggyBac轉(zhuǎn)座子載體，它可以有效的克服轉(zhuǎn)座子隨機整合的問題。1999年，Yamao[23 ]等將GFP基因與絲素輕鏈第7外顯子融合，利用AcMNPV載體，將GFP基因打靶進蠶卵母細胞基因組絲素輕鏈中，并得以表達。2002年，朱成鋼[24]等將基因與家蠶絲心蛋白輕鏈基因融合，構(gòu)成一種新型的轉(zhuǎn)基因家蠶打靶載體pBacF53 TG。

1.2.2.4 其他基因載體

據(jù)相關(guān)報道，YAC載體也可應(yīng)用于家蠶轉(zhuǎn)基因中。李振剛[25]等利用YAC載體將天蠶絲基因整合于家蠶基因組中，獲得綠繭家蠶品系。

2 基因編輯技術(shù)在家蠶轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用

基因編輯技術(shù)是指通過人工核酸酶對動物特定的內(nèi)源性基因進行目地性的修飾, 如敲除、敲入、定點突變等, 并結(jié)合體細胞核移植與胚胎移植等技術(shù)手段, 以此獲得被修飾編碼的個體。基因編輯技術(shù)最早適用于基因的定點突變和敲除，其目的主要是在未引入外源基因的情況下對生物體進行基因組上的精準操作。但是隨著技術(shù)的發(fā)展，通過基因編輯工具，也可以實現(xiàn)準確和簡便的基因敲入，所以也可以把基因敲入編輯的生物認為是轉(zhuǎn)基因生物。

目前，基因編輯技術(shù)主要發(fā)展了3代：分別是鋅脂核酸內(nèi)切酶(zinc finger endonucleases, ZFNs)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸內(nèi)切酶(transcription activatorlike effector endonucleases, TALENs) 和CRISPR/Cas9 [clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/Cas9(CRISPR associated 9) ]技術(shù)[26]。其中 TALEN技術(shù)和CRISPR/Cas9 技術(shù)目前應(yīng)用最為廣泛，兩者各有優(yōu)點，TALEN技術(shù)具有高度的特異性，而CRISPR/Cas9 技術(shù)的操作更簡便。

表1　 基于人工核酸內(nèi)切酶的基因組靶向編輯技術(shù)在家蠶轉(zhuǎn)基因中的應(yīng)用

截止2018年部分數(shù)據(jù)

3 家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用

在眾多科學家的不懈努力情況下，家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)開始應(yīng)用于各個領(lǐng)域，主要在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域、家蠶遺傳育種和生物反應(yīng)器方面的應(yīng)用。

3.1 在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的應(yīng)用（功能基因組領(lǐng)域）

轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以應(yīng)用于家蠶功能基因的研究，探究家蠶基因的作用和家蠶生長發(fā)育的調(diào)控機制。例如，Uhliová[31]等人利用piggyBac轉(zhuǎn)座子介導的轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功地研究了核受體基因的功能。結(jié)果顯示，的表達在家蠶每次蛻皮過程中受蛻皮激素的控制。在研究家蠶幼蟲體壁半透明基因基因的過程中，F(xiàn)ujii[32]等利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)現(xiàn)，該基因突變后的家蠶與油蠶幼蟲表皮中尿酸轉(zhuǎn)化成尿酸顆粒的過程受到抑制。除此之外，Tan[33]、Hongjiu[34]等也通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合GAL4/ USA雙元轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)進行了一系列研究。

在不同品種的轉(zhuǎn)基因家蠶中，外源基因的表達效果可能存在差異，所以將家蠶基因的啟動子或者增強子序列與基因形成融合基因，再以此獲得轉(zhuǎn)基因家蠶，則可通過基因的表達情況，來顯示目的基因的表達調(diào)控，確定有利于目的基因表達的家蠶品系。Kurihara[35]等人就通過相關(guān)實驗發(fā)現(xiàn)絲膠缺乏家蠶在轉(zhuǎn)基因方面的應(yīng)用潛力。

3.2 在家蠶遺傳育種領(lǐng)域的應(yīng)用

隨著現(xiàn)代社會的高速發(fā)展，傳統(tǒng)品系的家蠶已經(jīng)難以滿足多元化的市場需要。相對于傳統(tǒng)的家蠶育種方式，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行家蠶育種，將特定的功能基因?qū)爰倚Q中，使之表達特定的性狀，這樣的品種往往能表現(xiàn)出傳統(tǒng)家蠶品系沒有的特征。目前已經(jīng)有很多科學家從事這方面工作，并取得了一些進展。

3.2.1 抗性品種培育

自古以來，蠶病一直就是困擾蠶桑產(chǎn)業(yè)的一大難題。目前，主要的蠶病有病毒病、細菌病、真菌病等。其中，BmNPV病毒病具有易傳染、致病性強的特點，是蠶桑產(chǎn)業(yè)中最容易造成經(jīng)濟損失的病原之一，也是蠶?？茖W研究的主要對象。在2004年，Isobe[36]等人首次利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將RNA干擾BmNPV的片段在家蠶中過表達，使家蠶對BmNPV有了一定的抵抗力，這為培育家蠶抗病品種提供了新的思路。隨后，Kanginakudru[37]等人通過干擾BmNPV的基因，發(fā)現(xiàn)得到的轉(zhuǎn)基因家蠶抗BmNPV感染力有了明顯的提升。在此基礎(chǔ)上，蔣亮[38]等科學家也對此做了一系列后續(xù)研究，取得了突破性的進展。

3.2.2 蠶絲品質(zhì)改良

蠶絲主要以絲素和絲膠為主，還含有蠟、碳水化合物、色素、灰份和天然雜質(zhì)等，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白纖維[39]，但蠶絲也存在不抗皺、不耐磨、產(chǎn)量不足等缺點。2011年，馬俐[40]等利用GAL4/UAS雙元轉(zhuǎn)換系統(tǒng)將促癌基因在家蠶體內(nèi)過量表達，大大提高了蠶絲產(chǎn)量，證實了轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用的可能性。除此之外，蠶絲的多元化應(yīng)用也成為了研究重點，如李珍[41]等成功研究出了具有抗菌功能的蠶絲。

3.3 在生物反應(yīng)器領(lǐng)域的應(yīng)用

目前家蠶生物反應(yīng)器主要是利用 piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)將外源基因在家蠶后部絲腺中表達外源蛋白，形成家蠶絲腺生物反應(yīng)器（包括絲膠表達系統(tǒng)和絲素表達系統(tǒng)），同時也有研究人員開始進行家蠶脂肪體生物反應(yīng)器和家蠶血淋巴生物反應(yīng)器的研究，嘗試以不同特點的家蠶組織表達不同類型的蛋白。

3.3.1 絲腺生物反應(yīng)器

家蠶絲腺分為前部絲腺、中部絲腺和后部絲腺三個部分，前部絲腺具有導管作用；中部絲腺合成絲膠蛋白，其中主要由、、三個基因編碼；后部絲腺合成絲素蛋白，由 391 kDa的絲素重鏈（Fib-H）、26 KDa的絲素輕鏈(Fib-L)和 30 KDa的 P25 蛋白以6∶6∶1的摩爾比組成并作為蠶絲的基本結(jié)構(gòu)單位[42]。家蠶絲腺具有高效的合成和分泌蛋白的能力，所以大多數(shù)科學家都用絲腺來表達外源基因，并取得了不錯的進展。

在2002年，Tomita[43 ]等首次利用 piggyBac轉(zhuǎn)座子介導的轉(zhuǎn)基因成功利用家蠶絲腺合成了人 III型前膠原蛋白，經(jīng)檢驗在蠶繭中發(fā)現(xiàn)了該種蛋白。這有力地證明了絲腺作為生物反應(yīng)器的可能性。Ogawa[44]等在2007年利用piggyBac載體在轉(zhuǎn)基因家蠶蠶繭的絲膠層中成功表達并分離了重組人血清白蛋白（recombinant human serum albumin, rHSA），并通過研究發(fā)現(xiàn)其構(gòu)象和功能與天然產(chǎn)物相同。后續(xù)還有研究表明家蠶的絲腺可以產(chǎn)生小鼠蛋白的單抗[45]、人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子[46]、狂犬病毒核蛋白[47]等。

此外，2018年Xu[48]等人還利用 TALEN技術(shù)，將家蠶絲素蛋白 H鏈敲除并敲入了蜘蛛絲蛋白基因，成功利用家蠶絲腺高表達了蜘蛛絲蛋白，其方法和意義值得關(guān)注和研究，家蠶絲腺作為生物反應(yīng)器的應(yīng)用前景巨大，值得進一步研究。

3.3.2 脂肪體生物反應(yīng)器

脂肪體是昆蟲體內(nèi)的中間代謝器官，它起到了合成和代謝蛋白質(zhì)、脂類和糖類、降解有毒物質(zhì)等重要生理作用[49]。其分泌的蛋白有儲存蛋白、脂蛋白等多種功能蛋白[50]。

部分學者針對這些功能，進行了相關(guān)研究。幸俊逸[51 ]等于2010年通過顯微注射技術(shù)，將含有主要抗原位點的O型口蹄疫病毒VPI結(jié)構(gòu)蛋白基因為標靶的piggyBac表達載體成功導入家蠶胚胎，獲得轉(zhuǎn)基因蠶。經(jīng)驗證，重組口蹄疫 VPI蛋白成功在家蠶脂肪體中表達。劉耀文[52]等也成功通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在家蠶脂肪體表達了重組植酸酶。此外，胡瑩瑩[53]等利用非轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)培育轉(zhuǎn)基因家蠶，在脂肪體中也得到了有效表達。

3.3.3 血淋巴生物反應(yīng)器

家蠶血淋巴是家蠶血液與家蠶淋巴液的混合體，是一個開放的系統(tǒng)，內(nèi)含物豐富，其中就含有大量的蛋白質(zhì)，它們在家蠶的生長發(fā)育過程中起到了重要作用。

Susumu[54]等于1985年利用了桿狀病毒表達載體在家蠶中成功表達了人α-干擾素，活性達到了5×107U/50 μg。隨著研究的深入，重人乳蛋白[55]、P25 蛋白和 Fib-L蛋白[56]、Aβ42 和 CTB-Aβ15 蛋白[57]等都被科學家在家蠶血淋巴中成功地表達。可見，以家蠶血淋巴作為生物反應(yīng)器的可行性還是非常高的。

4 存在的問題

家蠶作為鱗翅目的模式昆蟲，具有生長周期短、易飼養(yǎng)、繁殖率高、遺傳背景清楚等優(yōu)點。在進行轉(zhuǎn)基因研究時，家蠶可以使用人工飼料飼養(yǎng)，且成蟲無法飛行，即可以隔離飼養(yǎng)，這也為轉(zhuǎn)基因研究帶來了便利，當然存在的問題也很明顯：

（1）轉(zhuǎn)座子隨機整合：轉(zhuǎn)座子隨機整合會導致目的基因的表達發(fā)生變化，即上調(diào)表達、下調(diào)表達和異位。這可能會導致轉(zhuǎn)基因家蠶出現(xiàn)基因?qū)哟蔚呢撁孀兓?，進而影響整個實驗。目前已經(jīng)有部分科學家正在研究條件基因打靶技術(shù)解決轉(zhuǎn)座子隨機整合問題[58]。

（2）標記基因保留帶來的隱患：上文中提到，在家蠶轉(zhuǎn)基因相關(guān)操作中，標記一般會保留在轉(zhuǎn)基因個體的基因組中，但是這會增加轉(zhuǎn)基因逃逸的可能性，且存在影響目的基因表達的可能性。針對這一問題，位點特異性重組法是目前轉(zhuǎn)基因動植物中應(yīng)用比較廣泛的解決方法之一。早在2012年，Long等[59]利用一種基于釀酒酵母（）的FLP/FRT系統(tǒng)的方法，成功定點敲出了標記基因。

（3）外源基因?qū)牒蟮谋磉_效率：和很多轉(zhuǎn)基因生物一樣，轉(zhuǎn)基因家蠶也存在外源基因表達效率不高等問題。尤其是在家蠶生物反應(yīng)器方面，外源基因的整合率和表達水平較低一直困擾著研究人員。

5 結(jié)語和展望

隨著遺傳學和分子生物學技術(shù)的發(fā)展，越來越多的新技術(shù)、新成果將應(yīng)用于家蠶轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域。伴隨研究的深入，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在家蠶育種及資源的品質(zhì)創(chuàng)新等方面展現(xiàn)了其他技術(shù)無法比擬的優(yōu)勢和潛力，如果我們加以合理的應(yīng)用，必將為傳統(tǒng)蠶桑產(chǎn)業(yè)的升級發(fā)展和創(chuàng)新應(yīng)用帶來新的機遇。

[1]陸德裕,金振華,李光三,等.人β-珠蛋白基因注入小鼠受精卵的研究[J].科學通報,1984(14):880-882.

[2]龔國春.利用體細胞克隆技術(shù)進行大家畜轉(zhuǎn)基因的研究進展[A].中國遺傳學會、海南省科學技術(shù)協(xié)會、海南省遺傳學會、華南熱帶作物生物技術(shù)國家重點實驗室.中國的遺傳學研究——中國遺傳學會第七次代表大會暨學術(shù)討論會論文摘要匯編[C].中國遺傳學會、海南省科學技術(shù)協(xié)會、海南省遺傳學會、華南熱帶作物生物技術(shù)國家重點實驗室:中國遺傳學會,2003:6.

[3] Tamura T ,Kanda T ,Takiya S ,et al.Transient expression of chimeric CAT genes injected into early embryos of the domesticated silkworm Bombyx mori[J].Idengaku Zasshi,1990,65(6):401.

[4] Qiang S ,Liang J ,Huizhen G ,et al.Increased antiviral capacity of transgenic silkworm via knockdown of multiple genes on,Bombyx mori,bidensovirus[J].Developmental & Comparative Immunology,2018:S0145305X18301344-.

[5]郭秀洋,周澤揚,馮麗春,等.利用精子介導法向蠶卵導入外源基因的研究[J].生物化學與生物物理進展,2001,28(3).

[6]Zhou W ,Gong C ,Xue R ,et al.Germline Transformation of the Silkworm Bombyx mori L.by Sperm-Mediated Gene Transfer[J].Biology of Reproduction,2012,87(6):144-144.

[7]孟智啟,姚山麟,王為民,等.基因槍噴射技術(shù)在家蠶外源基因轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用[J].浙江農(nóng)業(yè)學報,1992(2):93-95.

[8]趙昀,張峰,陳秀,等.用綠色熒光蛋白進行轉(zhuǎn)基因蠶研究[J].高技術(shù)通訊,1999(06):18-21.

[9]劉春,徐漢福,陳玉琳,等.家蠶轉(zhuǎn)基因研究及肌動蛋白A3啟動子的表達分析[J].蠶學通訊,2007(03):1-6.

[10]Thomas J L,Da R M,Besse A,et al.3xP3-EGFP marker facilitates screening for transgenic silkworm Bombyx mori L.from the embryonic stage onwards.[J].Insect Biochemistry & Molecular Biology,2002,32(3):247-253.

[11] Uhlí?ová M,Asahina M,Riddiford L M,et al.Heat-inducible transgenic expression in the silkmoth Bombyx mori[J].Development Genes & Evolution,2002,212(3):145-151.

[12]趙愛春,夏慶友,魯成,等.利用家蠶絲心蛋白重鏈啟動子大量表達外源蛋白的方法.中國,200610054442.X[P],2006-7-14.

[13]張峰,陳秀,趙昀,等.抗NPV-核酶轉(zhuǎn)基因蠶的研究[J].生物化學與生物物理學報（英文）,1999(3):331-333.

[14]Tamura T,Thibert C,Royer C,et al.Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L.using a piggyBac transposon-derived vector.[J].Nature Biotechnology,2000,18:81-84.

[15]Thomas J L,Rocha M D,Besse A,et al.3×P3-EGFP marker facilitates screening for transgenic silkworm Bombyx mori L.from the embryonic stage onwards[J].2002,32(3):0-253.

[16]王林玲,陳克平,姚勤,等.家蠶基因工程載體研究新進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2006(03):510-512.

[17] Shimizu K ,Kamba M ,Sonobe H ,et al.Extrachromosomal transposition of the transposable element Minos in embryos of the silkworm Bombyx mori[J].Insect Molecular Biology,2000,9(3):277-281.

[18]Uchino K.Germ line transformation of the silkworm,Bombyx mori,using the transposable element Minos[J].Mol.Genet.Genomics,2007,277(3):213.

[19]Wang W,Swevers L,Iatrou K.Mariner（Mosl）transposase and genomic integration of foreign sequences in Bombyx mori cells[J].Insect Mol Biol,2000,(9):145-155

[20]張昊堃.Gai4/UAS轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)表達BmKIT_3~R對家蠶蛹期發(fā)育的影響[D].蘇州大學,2012,18

[21]張峰,趙昀,黃榮,等.綠色熒光蛋白在家蠶細胞中的表達[J].蠶業(yè)科學,1997(03):135-136.

[22]Nikolaev A I,Tchkonia T T,Kafianieristavi C A,et al.Preferential extrachromosomal localization of exogenous DNA in transgenic silkworm Bombyx mori L.[J].Molecular Genetics and Genomics,1993: 326-330.

[23]Yamao,Katayama,Masafumi,et al.Gene targeting in the silkworm by use of a baculovirus [J].Genes and Development,1999,13:511-516

[24]朱成鋼,金勇豐,史鋒,等.用絲心蛋白輕鏈基因構(gòu)建轉(zhuǎn)基因家蠶基因打靶載體[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報,2002(02):171-175.

[25]李振剛,周叢照,唐恒立,等.YAC介導的天蠶絲素基因向家蠶的轉(zhuǎn)移及其在F_2代中的表達[J].科學通報,1995(24):2267-2269.

[26]張泗舉,欒維江.基因編輯技術(shù)原理及其在動植物研究中的應(yīng)用[J/OL].天津師范大學學報(自然科學版):1-13[2019-03-18].http://kns.cnki.net/kcms/detail/12.1337.N.20190103.1319.002.html.

[27]Daimon T,Kiuchi T,Takasu Y.Recent progress in genome engineering techniques in the silkworm,Bombyx mori[J].Development Growth & Differentiation,2014,56(1):14-25.

[28]Nakade S ,Tsubota T ,Sakane Y ,et al.Microhomology-mediated end-joining-dependent integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas9[J].Nature Communications,2014,5:5560.

[29]Wang Y ,Tan A ,Xu J ,et al.Site-specific,TALENs-mediated transformation of Bombyx mori[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology,2014,55:26-30.

[30]Zhu L ,Mon H ,Xu J ,et al.CRISPR/Cas9-mediated knockout of factors in non-homologous end joining pathway enhances gene targeting in silkworm cells[J].Scientific Reports,2015,5:18103.

[31]Uhliová M, Asahina M, Riddiford LM, et al.Heat- inducible transgenic expression in the silkmoth Bombyx mori[J].Dev Genes Evol.2002,212(3):145- 51.

[32]Fujii T ,Daimon T ,Uchino K ,et al.Transgenic analysis of the BmBLOS2 gene that governs the translucency of the larval integument of the silkworm,Bombyx mori[J].Insect Molecular Biology,2010,19(5):659-667.

[33]Tan A ,Tanaka H ,Tamura T ,et al.Precocious metamorphosis in transgenic silkworms overexpressing juvenile hormone esterase[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2005,102(33):11751-11756.

[34]Hongjiu,Wang,Rongjing,et al.Knockdown of ecdysis-triggering hormone gene with a binary UAS/GAL4 RNA interference system leads to lethal ecdysis deficiency in silkworm[J].生物化學與生物物理學報：英文版,2008,40(9):790-795.

[35]Kurihara H,Sezutsu H,Tamura T,et al.Production of an active feline interferon in the cocoon of transgenic silkworms using the fibroin H-chain expression system[J].Biochemical & Biophysical Research Communications,2007,355(4):976-980.

[36]Isobe R,Kojima K T,Quan G X,et al.Use of RNAi technology to confer enhanced resistance to BmNPV on transgenic silkworms[J].Archives of Virology,2004,149(10):1931-1940.

[37]Kanginakudru S ,Royer C ,Edupalli S V ,et al.Targeting iegene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in transgenic silkworms[J].Insect Molecular Biology,2007,16(5):635-644.

[38]Jiang L,Zhao P,Cheng T,et al.A transgenic animal with antiviral properties that might inhibit multiple stages of infection.[J].Antiviral Res,2013,98(2):171-173.

[39]馮麗春,沈衛(wèi)德.蠶體解剖生理學[M].北京：高等教育出版社,2015(9).

[40]馬俐.家蠶后部絲腺過表達Ras1CA提高蠶絲產(chǎn)量的研究[D].中國科學院上海生命科學研究院,2011.

[41]Li Z ,Jiang Y ,Cao G ,et al.Construction of transgenic silkworm spinning antibacterial silk with fluorescence[J].Molecular Biology Reports,2015,42(1):19-25.

[42]趙曉明,劉云壘,毛鈺霞,等.用保幼激素和蛻皮激素處理離體培養(yǎng)家蠶絲腺對絲蛋白基因表達的影響[J].蠶業(yè)科學,2017,43(03):414-421.

[43]Tomita M ,Munetsuna H ,Sato T ,et al.Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons[J].Nature Biotechnology,2002,21(1):52-56.

[44]Ogawa S ,Tomita M ,Shimizu K ,et al.Generation of a transgenic silkworm that secretes recombinant proteins in the sericin layer of cocoon: production of recombinant human serum albumin.[J].Journal of Biotechnology,2007,128(3):531-544.

[45]Iizuka M ,Ogawa S ,Takeuchi A ,et al.Production of a recombinant mouse monoclonal antibody in transgenic silkworm cocoons[J].Febs Journal,2009,276(20):5806-5820.

[46]段建平,徐漢福,馬三垣,等.人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因(hBDNF)在轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺中的特異表達[J].蠶業(yè)科學,2009,35(2).

[47]尤征英,危浩,阮系真,等.家蠶絲腺生物反應(yīng)器表達狂犬病病毒核蛋白[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2013(18).

[48]Xu J,Dong Q,Yu Y,et al.Mass spider silk production through targeted gene replacement in Bombyx mori[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2018,115(35):8757-8762.

[49]馮麗春,沈衛(wèi)德.蠶體解剖生理學[M].北京：高等教育出版社,2015.

[50]田江海.添食TiO_2 NPs對家蠶脂肪體生理功能的影響[D].蘇州大學,2017.

[51]幸俊逸.利用轉(zhuǎn)基因家蠶脂肪體表達口蹄疫病毒VP1蛋白的研究[D].西南大學,2010.

[52]劉耀文.利用轉(zhuǎn)基因家蠶脂肪體表達重組植酸酶（rphyA）的研究[D].西南大學,2012.

[53]胡瑩瑩,薛仁宇,曹廣力,等.利用非轉(zhuǎn)座子載體介導的轉(zhuǎn)基因家蠶表達人胰島素樣生長因子I[J].蠶業(yè)科學,2012,38(4):658-664.

[54]Maeda S ,Kawai T ,Obinata M ,et al.Production of human alpha-interferon in silkworm using a baculovirus vector.[J].Nature,1985,315(6020):592-594.

[55]劉濤.家蠶生物反應(yīng)器表達人乳鐵蛋白及其功能研究[D].浙江大學,2005.

[56]陳愛春.無標簽重組蛋白在家蠶中的表達與純化[D].江蘇科技大學,2013.

[57]李司.家蠶蛹表達的重組Aβ42,CTB-Aβ42和CTB-Aβ15蛋白對阿爾茨海默癥模型鼠的口服免疫和保護作用研究[D].2016.

[58]龍定沛,郝占章,向仲懷,等.家蠶安全轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究現(xiàn)狀與展望[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2018(2).

[59]Long D P ,Zhao A C ,Chen X J ,et al.FLP Recombinase-Mediated Site-Specific Recombination in Silkworm,Bombyx mori[J].PLOS ONE,2012(7).

10.3969/j.issn.2095-1205.2019.04.01

國家自然科學基金項目(31472042，31672368)；華南農(nóng)業(yè)大學創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(2018年)。

田鈴，教授。

吳駿(1999- )，男，安徽池州人，本科生，研究方向：蠶學。

S882.6

A

2095-1205(2019)04-01-05