王英姿，李銀花，陳金華，劉仲華，黃建安*

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外源一氧化氮對低溫脅迫下茶樹幼苗生理特性的影響

王英姿1,2，李銀花1,2，陳金華1,2，劉仲華1,2，黃建安1,2*

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學教育部茶學重點實驗室，湖南 長沙 410128；2. 國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128

為探究外源一氧化氮（Nitric oxide，NO）供體硝普鈉（Sodium nitroprusside，SNP）對低溫脅迫下茶樹幼苗的緩解作用，采用人工氣候室模擬低溫脅迫試驗，研究了葉面噴施不同濃度SNP對低溫脅迫下兩年生碧香早茶苗葉片膜脂過氧化程度、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量及抗氧化酶活性的影響。結(jié)果表明，適宜SNP濃度可降低低溫脅迫下茶樹葉片相對電導率，抑制丙二醛含量的升高，促進脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖的大量積累，提高超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性，從而緩解低溫脅迫對茶樹葉片的傷害。試驗結(jié)果表明，噴施濃度為200?μmol·L-1的SNP效果最佳。

茶樹；低溫脅迫；外源NO；硝普鈉；生理特性

茶樹[（L.）O. Kuntze]是一種喜溫畏寒的多年生常綠木本植物。低溫是茶樹栽培過程中常遇的非生物脅迫之一，已成為限制茶產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要因素[1]。在生產(chǎn)中，早春茶園易遭受低溫冷害或氣溫回暖后的“倒春寒”危害，使茶樹生理代謝出現(xiàn)絮亂，嚴重時導致茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)下降。大量研究表明，茶樹抗寒性與體內(nèi)丙二醛（MDA）、可溶性糖、可溶性蛋白含量和超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性等密切相關[2-3]?？购暂^強的茶樹體內(nèi)可溶性糖含量較高，可溶性蛋白含量積累增多[4-5]，SOD、CAT活性維持較高水平，SOD同工酶總活性及譜帶數(shù)量明顯增強[5-7]。因此，研究茶樹對低溫脅迫的響應機理，探索茶樹抵抗低溫和冷害具有重要意義。

一氧化氮（Nitric oxide，NO）作為生物體內(nèi)重要的信號分子，對植物抗逆防御起重要的信號調(diào)節(jié)作用[8]，目前關于NO參與植物逆境脅迫的應答反應已成為研究熱點。Tian等[9]研究發(fā)現(xiàn)，外源NO能誘導干旱脅迫下小麥葉片氣孔關閉而減少水分的損失，提高葉片中SOD、CAT活性，降低MDA和H2O2含量。Zheng等[10]研究報道了外源NO能促進高鹽脅迫下小麥種子萌發(fā)，增強小麥葉片中SOD、CAT活性和脯氨酸含量，降低細胞膜通透性，抵抗對葉片中線粒體氧化的傷害。Liu等[11]研究表明，外源NO可以提高低溫脅迫下黃瓜幼苗體內(nèi)的保護酶活性，從而增強植株對低溫脅迫的適應性。陳銀萍等[12]研究表明，低溫脅迫下不同濃度硝普鈉（SNP）能顯著提高玉米種子的發(fā)芽率，抑制葉片MDA含量的升高，降低葉片質(zhì)膜相對透性，增加相對含水量、脯氨酸含量和葉綠素含量。外源NO針對禾本科、豆科、蔬菜和林木等植物在水分、鹽度、溫度等非生物脅迫的研究較多，但關于逆境脅迫下NO介導的茶樹生理反應研究較少，尤其是NO對于低溫脅迫下茶樹生理特性的影響尚未深入研究。因此，本研究通過對碧香早茶苗葉面噴施外源NO供體SNP，探討不同濃度SNP對低溫脅迫下茶樹主要生理指標的影響，以期篩選出提高茶苗抗低溫能力的適宜SNP濃度，為進一步深入研究外源NO提高茶樹幼苗抵抗低溫冷害等非生物脅迫能力提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為湖南省茶葉研究所高橋基地提供的兩年生碧香早茶樹盆栽苗。選擇長勢基本一致的茶苗移栽于盆口直徑為30?cm的聚乙烯盆中，每盆種植3株，培養(yǎng)土為70%茶園土混以30%有機肥料，定期澆水。試驗在湖南農(nóng)業(yè)大學茶學教育部重點實驗室進行，溫室內(nèi)溫度控制在20~25℃，相對濕度60%~75%，緩苗3個月。

試驗所用NO供體SNP [Na2Fe(CN)5]純度為98.5%，購自上海生工生物有限公司。先將其配制成100?mmol·L-1母液，4℃保存，用時按所需濃度稀釋。

1.2 試驗方法

1.2.1試驗設計

選取大小和長勢一致，生長健壯且無病蟲、傷殘葉的盆栽茶苗，移至人工智能氣候箱培養(yǎng)，箱內(nèi)溫度控制在(25±1)℃，相對濕度保持在(60±5)%，光照周期為12?h·d-1，培養(yǎng)3?d。3?d后對幼苗進行葉面噴施處理，每次定量噴施250?mL，均勻噴施至葉片正反面水珠欲滴為止，1?d噴1次，連續(xù)噴施3?d。試驗共設4個處理：（1）–2℃低溫脅迫＋清水處理（CK）；（2）–2℃低溫脅迫＋200?μmol·L-1SNP（C1）；（3）–2℃低溫脅迫＋500?μmol·L-1SNP（C2）；（4）–2℃低溫脅迫＋1?000?μmol·L-1SNP（C3）。每處理重復3次，每個重復15株苗。

1.2.2低溫處理

將已噴施的茶苗移至–2℃的人工氣候培養(yǎng)箱進行低溫處理，光照周期設為12?h·d-1，相對濕度(60±5)%。分別于低溫脅迫的第0、6、24、48?h和72?h時進行取樣，取第1片成熟葉片測定電導率，取一芽二葉測定各項生理指標，立即裝入封口袋內(nèi)，迅速放入液氮中速凍，保存至–70℃冰箱備用。

1.3 測定項目與方法

采用電導法測定相對電導率[13]；采用考馬斯亮藍G-250染色法測定可溶性蛋白含量[14]；采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量[15]；采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛含量[15]；采用茚三酮顯色法測定脯氨酸含量[15-16]；采用氮藍四唑（NBT）顯色法測定SOD活性[17]；采用H2O2紫外吸收法測定CAT活性[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)處理，SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進行方差分析和差異顯著性分析，多重比較采用Duncan法。

2 結(jié)果與分析

2.1 對低溫脅迫下茶樹葉片相對電導率的影響

如圖1所示，隨著低溫脅迫時間延長，茶樹葉片相對電導率整體上升，不同處理間波動較大，均在72?h時達到峰值。低溫脅迫過程中，茶樹葉片相對電導率以200?μmol·L-1SNP（C1）最低，6、24、48、72?h時較清水處理（CK）分別顯著降低36.07%、43.80%、13.37%和27.94%（＜0.05）。500?μmol·L-1SNP（C2）在48?h前均顯著高于CK；72?h時低于CK，較CK顯著降低7.16%（＜0.05）。1?000?μmol·L-1SNP（C3）在24~72?h時間段均高于CK，較CK顯著增加2.34%~5.18%（＜0.05），這表明高濃度SNP對降低茶樹幼苗低溫脅迫下葉片電導率無明顯的促進作用。

2.2 對低溫脅迫下茶樹葉片MDA含量的影響

由圖2-A可以看出，低溫促使茶樹葉片產(chǎn)生MDA，并隨低溫脅迫時間延長而逐漸升高，72?h時葉片MDA含量達到峰值。低溫脅迫下，外源NO可明顯降低葉片中MDA含量，并隨著脅迫時間的延長不同SNP濃度對降低葉片MDA含量的效果也存在一定差異。C1處理的茶樹葉片MDA含量在48?h和72?h時較CK分別顯著降低了15.16%和39.81%（＜0.05），C2和C3處理在6~72?h時分別顯著降低了14.24%~26.31%和11.86%~27.76%（＜0.05）。說明低濃度SNP處理對抑制低溫脅迫下茶樹葉片MDA含量升高的效果更好。

注：CK為常溫對照，C1：–2℃低溫處理+200?μmol·L-1 SNP，C2：–2℃低溫處理+500?μmol·L-1 SNP，C3：–2℃低溫處理+1?000?μmol·L-1 SNP。圖中不同字母表示同一品種不同濃度處理間在P＜0.05水平上顯著性差異。下同

圖2 外源NO對低溫脅迫下茶樹葉片丙二醛和脯氨酸含量的影響

2.3 對低溫脅迫下茶樹葉片脯氨酸含量的影響

由圖2-B可知，隨著低溫脅迫時間延長，茶樹葉片脯氨酸含量呈上升趨勢。低溫脅迫下噴施不同濃度SNP的葉片脯氨酸含量均高于CK，并在72?h時達到峰值，其中C1處理最高，顯著高于C2和C3處理。與CK處理相比，C1處理的脯氨酸含量在低溫脅迫6、24、48、72?h時分別顯著增加24.54%、28.05%、43.67%和66.67%（＜0.05），C2處理在低溫脅迫24~72?h時分別顯著增加9.84%~49.68%（＜0.05），C3處理在低溫脅迫48?h和72?h時分別顯著增加9.02%和35.74%（＜0.05），說明低濃度SNP對增加低溫脅迫下茶樹葉片脯氨酸含量的效果顯著。

2.4 對低溫脅迫下茶樹葉片可溶性蛋白含量的影響

如圖3-A所示，茶樹葉片在低溫脅迫過程中可溶性蛋白含量均呈上升趨勢，噴施SNP處理的可溶性蛋白含量均顯著高于CK（＜0.05），72?h時均達到最高值，其中C1處理最高，顯著高于C2和C3處理。較CK處理，C1處理的可溶性蛋白含量在低溫脅迫6、24、48?h和72?h時分別顯著增加51.73%、51.72%、42.62%和32.94%（＜0.05），C2和C3處理在低溫脅迫6~72?h時分別顯著增加9.92%~40.68%和28.93%~44.03%（＜0.05），C2和C3處理對增加低溫脅迫下茶樹葉片可溶性蛋白含量的累積效果較C1處理差。

2.5 對低溫脅迫下茶樹葉片可溶性糖含量的影響

圖3-B可以看出，低溫脅迫使茶樹葉片的可溶性糖含量不同程度的增加，72?h時達到最高值，不同濃度SNP處理的茶樹葉片可溶性糖含量的變化趨勢與可溶性蛋白基本一致。C1處理在低溫處理各時段均最高，顯著高于其他處理，低溫脅迫6、24、48?h和72?h時C1處理較CK分別顯著增加18.91%、12.57%、28.03%和33.20%（＜0.05）；C2和C3處理在低溫脅迫6~72?h時較CK分別顯著增加3.06%~19.89%和2.73%~18.11%（＜0.05）。

2.6 對低溫脅迫下茶樹葉片CAT活性的影響

由圖4-A可知，低溫脅迫下茶樹葉片CAT活性呈先上升再下降的趨勢，SNP處理的葉片CAT活性波動較大，CK在0~6?h間CAT活性有所下降，24?h時顯著增加，之后下降。C1處理在0~6?h時CAT活性變化較小，6~24?h活性顯著增強，之后有所下降，整個低溫脅迫過程中CAT活性以C1處理最高，在6、24、48、72?h時較CK處理分別顯著增加53.06%、100.00%、49.66%和59.43%（＜0.05）；C2處理的CAT活性僅高于CK，低溫脅迫過程中與CK處理差異不顯著；C3處理的CAT活性在6~72?h時較CK顯著增加了43.09%~64.88%（＜0.05），但較C1處理效果差。

圖3 外源NO對低溫脅迫下茶樹葉片可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響

圖4 外源NO對低溫脅迫下茶樹葉片過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性的影響

2.7 對低溫脅迫下茶樹葉片SOD活性的影響

圖4-B所示，低溫脅迫過程中，茶樹葉片SOD活性總體呈先上升后下降的趨勢，24?h時SOD活性達到峰值。噴施不同濃度SNP能不同程度提高茶樹葉片的SOD活性，且顯著高于CK（＜0.05）。低溫脅迫過程中SOD活性以C1處理最高，在6、24、48?h和72?h時C1處理較CK在分別顯著增加9.79%、14.81%、23.29%和19.43%（＜0.05）；C2和C3處理間差異較小，C2處理在低溫脅迫24~72?h時和C3處理在低溫脅迫48~72?h時較CK分別顯著增加10.37%~17.81%和6.64%~12.33%（＜0.05）。

3 討論

NO是參與植物生理過程中的信號傳導分子，它在植物生長和發(fā)育中起著至關重要的作用，其信號系統(tǒng)可以誘導和激活植物抗氧化系統(tǒng)。研究表明，SNP可以明顯提高多種作物中CAT、POD、SOD等酶的活性，并提高作物在遭受低溫逆境后的成活率[26-27]，這與本試驗結(jié)果一致。由此推測可能是NO與含鐵的CAT等相關酶類具有很強的親和性，能夠調(diào)節(jié)含血紅素鐵的酶類活性，并抑制含非血紅素鐵的順烏頭酸酶等靶酶的活性[28]。SOD活性的提高可能是在低溫脅迫下NO作為信號分子來誘導SOD編碼基因的表達[29]。適當濃度的SNP處理能夠提高SOD和CAT等抗氧化酶的活性，有效清除低溫脅迫引起的植物體內(nèi)積累的活性氧，提高低溫耐受性的能力，減輕低溫脅迫對植物的傷害。

4 結(jié)論

低溫脅迫下茶樹葉片的相對電導率和MDA含量明顯升高，脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量顯著增加，SOD和CAT的活性升高。外源NO處理顯著降低了低溫脅迫下茶樹幼苗葉片的相對電導率，抑制了MDA含量升高，進一步促進了脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖的積累，顯著提高了抗氧化酶（SOD、CAT）的活性，從而增強了茶樹幼苗抵抗低溫脅迫的能力。綜上所述，低溫脅迫下，外源NO供體SNP濃度為200?μmol·L-1處理碧香早茶樹品種緩解效果最好，而較高SNP濃度對其緩解作用較差。

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Effects of Exogenous Nitric Oxide on Physiological Characteristics of Tea Plants Under Cold Stress

WANG Yingzi1,2, LI Yinhua1,2, CHEN Jinhua1,2, LIU Zhonghua1,2, HUANG Jian'an1,2*

1. Key Laboratory of Tea Science of Ministry of Education, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. National Research Center of Engineering & Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

In order to investigate the alleviation effect of exogenous nitric oxide (NO) donor sodium nitroprusside (SNP) on tea rooted cuttings under cold stress, artificial climate chamber was used to simulate cold stress on tea rooted cuttings. The effects of SNP on membrane lipid peroxidation, osmotic adjustment substance and antioxidant activity of biennial ‘Bixiangzao’ rooted cuttings under cold stress were studied by foliar spray of SNP. The results show that suitable SNP concentration treatment could reduce the relative conductivity of tea leaves, inhibit the elevated malondialdehyde content, promote the accumulation of proline, soluble protein and sugar, and increase the superoxide dismutase, catalase activities, thereby alleviate the damage of cold stress on tea leaves. In addition, the optimal concentration of SNP was 200?μmol·L-1.

tea plant, low temperature stress, exogenous nitric oxide, sodium nitroprusside, physiological characteristics

S571.1；S339.4

A

1000-369X(2019)03-335-07

2018-09-29

2018-12-02

湖南省教育廳科學研究項目（17C0767）、?？茖W基金項目（16QN09）

王英姿，女，實驗師，主要從事茶樹品質(zhì)形成及調(diào)控方面的研究，83075688@qq.com。*通信作者：jian7513@sina.com