黃 潔 裴晏梓 劉 陽 陳海燕 孫 寧△

(1復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系 上海 200032; 2復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心臟超聲診斷科 上海 200032)

心肌肥大是一種較常見的原發(fā)性心臟病,主要特點是心肌細胞體積增大及細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成增加,這也是多種心血管類疾病共有的病理過程[1]。心肌肥大本質(zhì)上是一種代償性反應(yīng),往往源于心臟超負荷,臨床經(jīng)常表現(xiàn)為左室的異常肥大,室壁增厚,心室腔縮小,可能發(fā)展為進行性心衰、致死性心律失常[2],甚至是心源性猝死[3-4]。

去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)作為一種刺激因子可以誘導(dǎo)心肌細胞肥大[5],哌唑嗪(prazosin,PRA)對此具有一定的拮抗效果[6-7]。研究表明,NE可以通過心臟的腎上腺素能受體(adrenoceptor,AR)α和β[8],進一步激活細胞內(nèi)PLC、PKC、MAPK等信號通路,進而使得心肌細胞的結(jié)構(gòu)基因(如細胞骨架蛋白基因myosin、actin、titin等)過度或異常表達[9-11]。

目前臨床上仍缺乏治療心肌肥大的特效藥物。β-AR是一種比較理想的藥物靶點,但是關(guān)于α受體的研究相對缺乏。由于人類心肌細胞在體外無法擴增,來源稀少,人類心臟疾病的體外細胞模型建立及大規(guī)模藥物篩選一直無法開展。隨著胚胎干細胞體外中胚層定向分化的技術(shù)成熟,可大量獲得人源性心肌細胞,這為人類心血管疾病的研究與藥物篩選提供了有力的工具[12-13]。本研究在人類胚胎干細胞(human embryonic stem cells,hESCs)的基礎(chǔ)上大量獲取人源性心肌細胞(hESCs-cardiomyocytes,hESCs-CMs),進一步探索α受體拮抗劑PRA對NE誘導(dǎo)的心肌細胞肥大的影響,為今后運用hESCs-CMs進行人類心肌肥大的建模及大規(guī)模藥物篩選提供一定的實驗基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

主要試劑與儀器 哌唑嗪鹽酸鹽(美國Sigma Aldrich公司),重酒石酸去甲腎上腺素注射液(上海禾豐制藥有限公司),DMEM/F12培養(yǎng)液、RPMI 1640培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液(美國Corning公司),mTeSR培養(yǎng)基(加拿大STEMCELL公司)、FBS、0.25%無EDTA胰酶 (Trypsin)、B27添加劑、B27不含胰島素添加劑、鼠來源的肌鈣蛋白T(cardia troponin T,TNNT2)單克隆抗體,Alexa Fluor 488熒光標記的山羊抗小鼠IgG二抗、Trizol(美國Thermo Fisher公司),兔來源的肌球蛋白輕鏈2(myosin light chain 2v,MLC2v)多克隆抗體、PE熒光標記的抗兔IgG二抗、細胞流式試劑盒、基質(zhì)膠(美國BD公司),Ⅰ型膠原酶、IWR-1、DAPI(美國Sigma Aldrich公司),CHIR-99021(美國Selleckchem公司),防熒光淬滅封片劑(美國Vector公司),Triton-X100 (北京鼎國公司),山羊血清封閉工作液、4%多聚甲醛固定液(中國谷歌生物公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑、SYBR GREEN Realtime PCR Master Mix (日本TOYOBO公司),熒光倒置顯微鏡(德國Leica公司),實時定量PCR儀(瑞士Roche公司),12孔細胞培養(yǎng)板、激光共聚焦皿(無錫耐思生物科技有限公司),Leica顯微鏡FelixGX細胞動緣檢測系統(tǒng),流式細胞儀(美國BD公司)。

hESC系H7的培養(yǎng)及心肌的定向分化 將hESCs-H7用mTeSR培養(yǎng)液培養(yǎng)在6孔板中(包被有基質(zhì)膠),待細胞生長至密度為75%～85%,將培養(yǎng)液替換為含有10 μmol/L CHIR99021的B27無胰島素/RPMI 1640培養(yǎng)液,48 h后去除CHIR99021,替換為新的B27無胰島素/RPMI 1640培養(yǎng)液,24 h后換成含有5 μmol/L IWR-1的B27無胰島素/RPMI 1640培養(yǎng)液,48 h后去除IWR-1,替換為新的B27無胰島素/RPMI 1640培養(yǎng)液,48 h后換為B27含胰島素/RPMI 1640培養(yǎng)液,隔天換液,分化至8～10天可于顯微鏡下看見自主搏動的心肌細胞,繼續(xù)培養(yǎng)以進行后續(xù)實驗。

心肌細胞分化效率的流式檢測 取分化至25天的心肌細胞,先用膠原酶Ⅰ于37 ℃消化30 min,DPBS洗去剩余的膠原酶Ⅰ后即加入0.25%不含EDTA的胰酶進行消化,盡量將心肌細胞消化為單細胞。367×g離心2 min,收集細胞沉淀,使用試劑盒內(nèi)固定液將收集的心肌細胞于4 ℃固定30 min,離心(同上)棄上清,使用1×BD洗滌緩沖液清洗細胞沉淀2次,再用洗滌緩沖液將細胞重懸,分為3組,即空白對照、二抗陰性對照(只加二抗1∶200稀釋)和正常實驗組(先加一抗1∶100稀釋,后加二抗),每組細胞密度約為1×106個/mL。一抗4 ℃孵育1 h,洗去后加入二抗,4 ℃避光孵育30 min,洗去后PBS重懸細胞,上機檢測。

心肌細胞免疫熒光染色 取分化至25天的心肌細胞,盡量消化為單細胞,并接種在鋪有無菌玻片的12孔板中,使用10%FBS/DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),接種24 h后加入相應(yīng)的藥物處理,培養(yǎng)5天,每2天換液1次,以保證心肌細胞完全鋪展開。接種的心肌細胞分為3組(每組設(shè)4個復(fù)孔):對照組不含NE和Prazosin;NE組只加入20 μmol/L NE處理5天;PRA組,先加入15 μmol/L PRA 處理3 h,再加入20 μmol/L NE共同處理5天。將3組細胞用4%多聚甲醛固定后,染cTNT、熒光二抗及DAPI,使用熒光顯微鏡進行拍攝,計算每個視野的細胞個數(shù)并進行統(tǒng)計分析,所有視野均隨機采集。利用imageJ軟件分析細胞大小形態(tài),首先測量采集圖像右下角標尺的像素距離,并修改相應(yīng)的比例尺,使用不規(guī)則圖形工具圈出細胞輪廓進行測量分析,同一條件下計算心肌細胞的相對面積并進行比較。

qRT-PCR檢測心肌細胞肥大相關(guān)基因 心肌細胞消化后接種于鋪有基質(zhì)膠的12孔板中,分組同上,藥物處理5天后收集細胞,并用Trizol裂解細胞,提取mRNA,測定濃度,反轉(zhuǎn)錄為cDNA進行PCR反應(yīng)。以GAPDH作為內(nèi)參基因,引物序列參見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab 1 The primers sequence of qRT-PCR

心肌細胞收縮力檢測 心肌細胞消化為單細胞后接種于鋪有基質(zhì)膠的激光共聚焦皿中,分組同上,接種48 h后加入藥物再處理24 h,用FelixGX細胞動緣檢測系統(tǒng)測定并分析心肌細胞的收縮功能及跳動情況。

結(jié) 果

心肌細胞定向分化及分化效率檢測 按圖1A描述的步驟對hESCs-H7進行中胚層定向誘導(dǎo)分化,成功得到hESCs-CMs。收集分化至30天的心肌細胞進行流式檢測,檢測指標為心室肌細胞所特有表達的蛋白—肌球蛋白輕鏈2(MLC2v),結(jié)果發(fā)現(xiàn)MLC2v陽性細胞可達到90 %以上(圖1B),說明我們所建立的分化體系相對成熟,所分化出來的心肌細胞純度較高,絕大部分為心臟工作細胞——心室肌細胞。

PRA與NE對心肌細胞面積的影響 對分化25天的心肌細胞用藥物處理5天,進行免疫熒光染色(圖2A),用image J軟件對細胞面積進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn):與對照組相比,NE組心肌細胞面積有明顯增大的趨勢(P<0.000 1);與NE組相比,PRA組心肌細胞面積減少(P<0.01),然而并未完全恢復(fù)到對照組水平,說明PRA可以在一定程度上抑制NE誘導(dǎo)的心肌細胞面積增大(圖2B)。我們還統(tǒng)計了每個視野的細胞個數(shù),分析發(fā)現(xiàn)NE與PRA處理均未引起心肌細胞數(shù)目變化(圖2C)。

A:Schematic diagram of differentiation of hESCs to CMs.B:Representativeflow cytometry assay ofMLC2vexpression in CMs at D30 after differentiation.Over 90% cells wereMLC2vpositve CMs (n=5,93.76%±0.38%).Isotype control was used as a negative control to set the gating parameters.

圖1 hESCs-CMs定向分化與流式檢測
Fig 1 Differentiation and flow cytometry assay of hESCs-CMs

A:Representative immunofluorescence staining ofTNNT2 andDAPIat D30 after differentiation (scale bar:100 μm).CON:PBS;NE:20 μmol/L NE;PRA+NE:15 μmol/L PRA+20 μmol/L NE.B:Quantification of cell size by pixels (n>100);C:Quantification of cell numbers per field (n>30).(1)P<0.000 1;(2)P<0.01.

圖2 PRA處理前后hESCs-CMs的免疫熒光染色(×200)
Fig 2 Immunofluorescence staining of hESCs-CMs before and after PRA treatment (×200)

PRA與NE對心肌細胞肥大相關(guān)基因mRNA表達的影響 利用qRT-PCR方法檢測PRA和NE處理5天后的心肌細胞肥大相關(guān)基因mRNA表達水平的變化,我們發(fā)現(xiàn),NE處理組肥大相關(guān)的標志B型鈉尿肽(brain natriuretic peptide,BNP)較對照組表達明顯增高(P<0.001),肌小節(jié)蛋白相關(guān)基因TNNT2、肌細胞增強因子2C(myocyte-specific enhancer factor 2c,Mef2C)、肌漿網(wǎng)Ca2+ATP酶2a (sarcoplasmic reticulum Ca+-ATPase 2a,Serca2a)及肌球蛋白重鏈7(myosin heavy cgain 7,MYH7)與MYH6比值表達均上升(P分別<0.01和<0.05);與NE處理組相比,加入PRA后,BNP和TNNT2表達均下調(diào)(P<0.05),Serca2a和MYH7/MYH6比值有下降趨勢。這表明,PRA可以抑制NE誘導(dǎo)的hESCs-CMs肥大相關(guān)基因BNP、TNNT2表達的上調(diào)(圖3)。

Cardiac hypertrophic-related genes’ mRNA levels in hESCs-CMs were analyzed by qRT-PCR,and normalized toGAPDHexpression.CON:PBS;NE:20 μmol/L NE;PRA+NE:15 μmol/L PRA+20 μmol/L NE.(1)P<0.05;(2)P<0.01;(3)P<0.001.

圖3 PRA處理前后心肌肥大相關(guān)基因表達
Fig 3 The expression of cardiac hypertrophy-associated genes before and after PRA treatment

PRA與NE對心肌細胞收縮力及跳動頻率的影響 我們檢測了分化約30天的心肌細胞在藥物處理24 h后的細胞收縮情況,NE處理后可以產(chǎn)生類似正性肌力的作用,可明顯提高心肌細胞的收縮力及搏動頻率(P<0.000 1);而PRA處理后,心肌細胞的收縮強度及跳動頻率均有所減弱(P<0.000 1)。這表明PRA可以抑制NE引起的心肌細胞收縮力及跳動頻率的增加(圖4)。

討 論

心肌肥大可分為生理性肥厚和病理性肥厚,生理性肥厚常常見于孕婦、運動員等[14-15],病理性肥大常常見于高血壓、心梗、先心病等[16]。目前心肌肥大已是公認的導(dǎo)致猝死、心衰等心血管疾病的危險因素之一[17-18],然而臨床上尚無針對性治療的藥物,因此探明發(fā)生機制、尋找藥物靶點、開發(fā)特效藥物已成為心血管領(lǐng)域的重要研究方向。

引起心肌肥大的因素通常分為3類:(1)機械性因素,如壓力負荷過度、容積超負荷等[19];(2)神經(jīng)體液內(nèi)分泌性因素,如加壓素、血管緊張素Ⅱ、去甲腎上腺素等[20-21];(3)遺傳性因素,如肌節(jié)蛋白突變引起的肥大型心肌病等[22]。NE是一種常用的刺激因子,能導(dǎo)致心肌細胞肥大,甚至是細胞的凋亡[23]。

在新生乳鼠的原代心肌細胞上,PRA可以抑制NE誘導(dǎo)的心肌肥大[24]。本研究中,通過體外二維分化培養(yǎng),我們將hESCs-H7成功誘導(dǎo)分化為心肌細胞,獲得hESCs-CMs[25]。研究表明,hESCs-CMs無論是從基因表達的模式,還是細胞電生理、收縮功能等多個方面,都比鼠的心肌細胞更接近人類的心肌組織[26-28],而我們在此基礎(chǔ)上進行研究也更加接近于臨床患者心肌肥大的治療。我們發(fā)現(xiàn)NE可誘導(dǎo)hESCs-CMs肥大,進一步肯定了NE促肥大的效果,具體表現(xiàn)為心肌細胞面積增加,肥大相關(guān)基因mRNA表達的上調(diào),心肌細胞收縮強度及跳動頻率的增加,而α受體拮抗劑PRA能夠部分抑制細胞面積的增加,使肥大相關(guān)基因BNP、TNNT2表達下調(diào),收縮力及跳動頻率降低,表明PRA能改善NE誘導(dǎo)的肥大效果。

A:Representative images showing the contraction force measuredby FelixGX detection system.B:Quantification of contractility in cardiomyocytes 24 h after PRA treatment (n>50).C:Quantification of beating frequency 24 h after PRA treatment.CON:PBS;NE:20 μmol/L NE;PRA+NE:15 μmol/L PRA+20 μmol/L NE.(1)P<0.000 1.

圖4 PRA處理前后單個hESC-CM收縮力及跳動頻率檢測
Fig 4 The contractility and beating frequency detection of the single hESC-CM before and after PRA treatment

心肌細胞分布有α受體和β受體,研究表明這兩種受體均參與心肌肥大的過程[29-31]。在心肌組織中,β受體表達相對較多,包括β1和β2受體,這些受體表達在心肌細胞膜的表面,與心肌的收縮功能關(guān)系密切[32-33]。針對α受體,NE表現(xiàn)為強烈的興奮作用,而對β受體作用較弱,α受體的經(jīng)典拮抗劑PRA能夠抑制NE導(dǎo)致的收縮力增強,表明心肌細胞的收縮功能在某種程度上也與α受體有關(guān)。

綜上所述,本研究表明PRA對hESCs-CMs可改善NE導(dǎo)致的心肌肥大,為運用hESCs-CMs進行人類心肌肥大建模及大規(guī)模藥物篩選提供一定的實驗基礎(chǔ)。而PRA發(fā)揮作用的具體機制以及α受體能否作為臨床治療心肌肥大的有效藥物靶點還有待進一步的研究。