高瓊媚 劉丹陽 周仲文 張喬安 劉國元 曾文姣△

(1復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系 上海 200032; 2復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院病理科 上海 200011;3復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院病理科,4皮膚科 上海 200040)

肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上第6位常見惡性腫瘤,占腫瘤致死率的第2位[1],同時也是我國最為常見的惡性腫瘤之一。HCC治療方法有多種,包括手術(shù)切除、化療、放療、肝臟移植等,但患者治療后存在著復(fù)發(fā)率高和耐藥現(xiàn)象,因此有必要進(jìn)一步深入研究HCC發(fā)生發(fā)展的分子機制。

血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF)是相對分子質(zhì)量為28 000～35 000的多肽生長因子,主要促進(jìn)間葉來源的細(xì)胞增殖、生存和遷移。PDGF-A是PDGF家族中重要的一員。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,PDGF-A主要通過與其受體PDGFR-α結(jié)合,激活下游信號分子如PI3K/AKT、ERK、STAT、SHP2等,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[2]。最新的大數(shù)據(jù)分析顯示,與相應(yīng)正常組織比較,包括HCC在內(nèi)的多種腫瘤(如多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、前列腺腺癌、胃腺癌等)組織中PDGF-A表達(dá)升高[3]。酪氨酸激酶抑制劑Sorafenib已被批準(zhǔn)為晚期HCC臨床用藥。2016年的一項HCC隨機治療試驗[4]發(fā)現(xiàn)放療聯(lián)合Sorafenib減弱了PDGF反應(yīng),提示其主要作用機制可能是下調(diào)PDGF。臨床觀察發(fā)現(xiàn)部分手術(shù)后行干擾素α治療的患者,中途停藥后,HCC在短時間內(nèi)復(fù)發(fā);動物模型研究發(fā)現(xiàn)PDGF-A上調(diào)是HCC復(fù)發(fā)及干擾素α治療失敗的原因,聯(lián)合給予PDGF受體抑制劑可提高再治療的效果[5]。

雖然PDGF-A在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的機制研究較多,但其在人HCC組織中的研究較少。少量文獻(xiàn)報道了PDGF-A在HCC中表達(dá)及臨床特點之間的關(guān)系,但僅采用免疫組化染色分析[6]。本研究在人HCC組織檢測了PDGF-A基因表達(dá),分析其與BCLC分期的關(guān)系;檢測了7株肝癌細(xì)胞株P(guān)DGF-A蛋白質(zhì)水平;運用免疫組化染色顯示組織中PDGF-A蛋白質(zhì)定位;并首次應(yīng)用免疫熒光雙重染色技術(shù)顯示4種炎癥細(xì)胞(CD4+、CD8+、CD19+、和CD68+細(xì)胞)可以表達(dá)PDGF-A。

材 料 和 方 法

組織標(biāo)本 選取2010—2011年在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝臟外科施行肝癌切除術(shù)的50例HCC標(biāo)本,包括-80 ℃凍存的癌組織和癌旁肝組織,以及石蠟組織塊,患者臨床病理資料見表1。8例正常肝組織來源于該院肝血管瘤切除標(biāo)本旁的非瘤正常肝組織,作為正常對照肝組織。另有5例HCC石蠟組織來源于復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院,用于免疫熒光染色。

巴塞羅那臨床肝癌(Barcelona Clinic Liver Cancer,BCLC)分期系統(tǒng)在臨床廣泛使用,根據(jù)腫瘤情況和臨床表現(xiàn)將肝癌患者劃分為5期(0、A、B、C、D期)[7]。因D期患者不進(jìn)行手術(shù)治療,所以本研究標(biāo)本來自于0至C期HCC患者。0期:單個腫瘤≤2 cm、膽紅素正常、無門脈高壓;A期:少于3個腫瘤且均≤3 cm、Child-Pugh A-B;B期:多于3個腫瘤、Child-Pugh A-B;C期:有血管侵犯或轉(zhuǎn)移、Child-Pugh A-C。

細(xì)胞株和培養(yǎng)基 Hep3B、SMMC-7721、MHCC97-H、BEL-7402肝腫瘤細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心,L02正常肝細(xì)胞和HepG2、Huh7、HCCLM3肝腫瘤細(xì)胞株獲贈于復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所。所有細(xì)胞株均采用Gibco高糖DMEM培養(yǎng)基,37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng),取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

定量RT-PCR檢測 組織總RNA用Trizol常規(guī)抽提,經(jīng)甲醇變性瓊脂糖凝膠電泳,證實未有降解。逆轉(zhuǎn)錄采用PrimeScriPt RT試劑盒(日本Takara公司),按說明書操作?？缤怙@子的引物和Taqman探針購自美國Applied Biosystems公司,包括內(nèi)參TBP(Hs00427620_mL)和PDGF-A(Hs00964426_mL)。每個樣本做3個復(fù)孔,蒸餾水為空白對照。每個反應(yīng)體系包含10 ng cDNA(1 μL),定量RT-PCR在ABI7900HT實時定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)上完成。用TBP基因標(biāo)準(zhǔn)化PDGF-A基因數(shù)據(jù)得到其相對表達(dá)值。

Western blot檢測 收集處于對數(shù)生長期的細(xì)胞,提取總蛋白、定量、SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。兔抗人PDGF-A抗體(1∶1 000稀釋,ab9701,英國Abcam公司) 4 ℃孵育過夜,辣根過氧化物酶HRP-羊抗兔IgG抗體(1∶1 000稀釋,SA00001-2,美國Proteintech公司)室溫孵育1 h,ECL試劑曝光顯色。內(nèi)參選用兔抗β-tubulin抗體(1∶1 000稀釋,10068-1-AP,美國Proteintech公司)。

免疫組化染色及分析 5 μm石蠟切片,脫蠟,0.3%過氧化氫甲醇溶液去內(nèi)源性過氧化物酶,檸檬酸緩沖液(pH 6.0)微波修復(fù)10 min,正常羊血清封閉。隨后,兔抗PDGF-A抗體(1∶50稀釋,sc-128,美國Santa Cruz公司)37 ℃孵育1 h,4 ℃過夜,HRP-羊抗鼠/兔IgG抗體 (稀釋比例1∶3,K5007,丹麥DAKO公司) 37 ℃孵育45 min,DAB顯色,蘇木精復(fù)染1 min,中性樹膠封片。

對癌細(xì)胞染色陽性程度進(jìn)行半定量分析。染色強度分為:0,無染色/可疑著色;1,有確切著色;2,有明顯著色;3,強烈著色。陽性細(xì)胞數(shù)量分為:1,少量細(xì)胞(<30%);2,較多細(xì)胞(30%～60%);3,大量細(xì)胞(>60%)。兩者的乘積為該例癌細(xì)胞PDGF-A分值,設(shè)定<1分為陰性,1～3分為陽性,>3分為強陽性。

使用多光譜切片流式細(xì)胞儀(CLS140089,美國Perkin Elmer公司)配合拍照及分析軟件,對間質(zhì)區(qū)域陽性細(xì)胞進(jìn)行定量分析。每例選取癌和癌旁各5個×200視野拍照(Vectra 2.0.8);拆圖、建立光譜數(shù)據(jù)庫(Nuance 3.0.1.2);選出間質(zhì)區(qū)域,計算陽性細(xì)胞占比(Inform 2.0.2)。視野的選擇:癌組織中的周邊部位為HCC代表(因該部位最能反映腫瘤的侵襲能力及惡性程度),同一切片上與癌組織稍遠(yuǎn)的肝組織作為對照(避開直接與腫瘤接觸的區(qū)域)。

雙重免疫熒光染色 5 μm石蠟組織切片貼附于多聚賴氨酸預(yù)處理載玻片,脫蠟,0.3%過氧化氫甲醇溶液去內(nèi)源性過氧化物酶,檸檬酸緩沖液(pH 6.0)微波高溫修復(fù)10 min,正常羊血清封閉非特異性結(jié)合,兔抗PDGF-A抗體(1∶50稀釋,sc-128,美國Santa Cruz公司)室溫1 h,HRP-羊抗鼠/兔IgG抗體(稀釋比例1∶3,K5007,丹麥DAKO公司)室溫10 min,熒光染料(OpalTM4-color試劑盒,NEL794001KT,美國Perkin Elmer公司)避光孵育10 min。隨后檸檬酸緩沖液(pH 6.0)微波10 min,洗去前面結(jié)合抗體。正常羊血清封閉,分別加鼠抗CD4、CD8、CD19或CD68單克隆抗體(1∶50稀釋,sc-32811、7188、69736、17832,美國Santa Cruz公司)室溫1 h,HRP-羊抗鼠/兔IgG抗體室溫10 min,熒光染料避光孵育10 min。DAPI室溫避光孵育10 min,甘油封片。在多光譜切片流式細(xì)胞儀上觀察及拍照。

統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,獨立樣本t檢驗比較組間差異,配對樣本t檢驗比較腫瘤和相應(yīng)瘤旁組織的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 HCC患者的臨床病理特征統(tǒng)計數(shù)據(jù)Tab 1 The pathological features of patients with HCC (n)

結(jié) 果

PDGF-A mRNA水平及其與BCLC臨床分期關(guān)系 采用定量RT-PCR方法,檢測8例正常肝組織、50例HCC及相應(yīng)癌旁非腫瘤肝組織中PDGF-A mRNA水平。28例HCC癌組織PDGF-A基因表達(dá)高于正常肝組織平均值,其中19例是正常肝組織均值的2倍及以上。與相應(yīng)癌旁組織相比,HCC癌組織PDGF-A基因表達(dá)升高(P<0.01,圖1A),其中24例HCC癌組織表達(dá)量是癌旁組織的2倍及以上。分析各BCLC分期病例,PDGF-A的mRNA在各期的癌組織均較癌旁組織高,其中0、C期的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,圖1B)。

A:PDGF-A mRNA levels in normal livers (n=8),HCC and corresponding adjacent livers (n=50).B:PDGF-A mRNA levels in normal livers (n=8),HCC with BCLC 0 stage (n=6),A stage (n=25),B stage (n=13) and C stage (n=6).NL:Normal liver tissue;Adjancent:Adjancent liver tissue;(1)P<0.01.

圖1 正常肝、HCC及其相應(yīng)癌旁肝組織的PDGF-A mRNA水平
Fig 1 PDGF-A mRNA levels in normal livers,HCC and corresponding adjacent liver tissues

肝腫瘤細(xì)胞株中PDGF-A蛋白質(zhì)水平 運用Western blot方法檢測正常肝細(xì)胞株L02和7株肝腫瘤細(xì)胞中PDGF-A蛋白質(zhì)水平,結(jié)果如圖2。 L02、SMMC-7721、HCCLM3、MHCC97-H細(xì)胞株中表達(dá)PDGF-A蛋白質(zhì),其水平在MHCC97-H細(xì)胞中最高,其次是SMMC-7721,然后是HCCLM3和L02。另4株細(xì)胞未檢測到PDGF-A蛋白質(zhì),包括HepG2、Hep3B、Huh7和BEL-7402細(xì)胞。

PDGF-A protein is detected in L02,SMMC-7721,HCCLM3 and MHCC97-H cell lines;while HepG2,Hep3B,Huh7 and BEL-7402 have no detectable PDGF-A protein.

圖2 正常肝及肝癌細(xì)胞株中PDGF-A蛋白質(zhì)水平
Fig 2 PDGF-A protein levels in liver cell and hepatoma cell lines

PDGF-A在HCC組織中的分布及表達(dá) 在HCC組織石蠟切片上進(jìn)行的免疫組化染色顯示,PDGF-A蛋白質(zhì)陽性染色存在于肝癌細(xì)胞和間質(zhì)炎癥細(xì)胞中(圖3)。癌細(xì)胞中PDGF-A蛋白質(zhì)分布有2種類型:彌漫分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(圖3D),在細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞膜局部聚集(圖3E、F)。對癌細(xì)胞染色陽性程度進(jìn)行半定量分析顯示,癌細(xì)胞PDGF-A蛋白質(zhì)陽性表達(dá)見于33.3% (14/42)的病例,強陽性表達(dá)見于26.2% (11/42)的病例,其余40.5% (17/42)病例無/極微弱表達(dá)。

PDGF-A在HCC組織間質(zhì)炎癥細(xì)胞中的表達(dá)分析 運用圖像分析技術(shù)定量測定間質(zhì)中PDGF-A陽性細(xì)胞百分比,HCC癌間質(zhì)區(qū)域PDGF-A陽性率(67.0%)高于相應(yīng)的癌旁肝(18.3%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001,圖4A)。BCLC各期病例分析均顯示,HCC癌間質(zhì)區(qū)域PDGF-A陽性率高于相應(yīng)的癌旁肝間質(zhì)區(qū)域,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖4B)。

CD4+、CD8+、CD19+和CD68+炎癥細(xì)胞表達(dá)PDGF-A 為明確組織間質(zhì)中PDGF-A陽性細(xì)胞的類型,運用免疫熒光雙染色技術(shù),檢測4種免疫細(xì)胞標(biāo)志物(CD4、CD8、CD19、和CD68)與PDGF-A的共定位 。PDGF-A蛋白質(zhì)與CD4、CD8、CD19、和CD68均有共表達(dá)(圖5),表明CD4+、CD8+、CD19+和CD68+的炎癥細(xì)胞均可以表達(dá)PDGF-A。

PDGF-A positive staining exists in HCC tumor cells and interstitial inflammatory cells.A and B:The junction between tumor and surrounding tissue.C:Positive staining of inflammatory cells in tumor interstitium.D:PDGF-A is diffusely distributed in the cytoplasm of tumor cells.E and F:PDGF-A aggregates in local cytoplasm and/or cell membrane (Scale bar:50 μm.Original magnification A-B 200×,C-F 400×).

圖3 HCC組織中PDGF-A蛋白質(zhì)的分布
Fig 3 PDGF-A protein distribution in HCC tissues

A:Percentage of PDGF-A positive cells in tumor interstitium is higher than that in corresponding adjacent liver interstitium (n=43).B:In all stages,interstitial PDGF-A positive percentages are higher in tumor than that in corresponding adjacent liver.(1)P<0.05,(2)P<0.000 1.

圖4 HCC間質(zhì)中PDGF-A陽性細(xì)胞比例
Fig 4 Percentage of PDGF-A positive cells in HCC interstitium

Immunofluorescence double staining shows that CD4,CD8,CD19 and CD68 positive cells (red) have PDGF-A expression (green),respectively.Scale bar:50 μm.Original magnification 400×.

圖5 HCC組織中PDGF-A與CD4、CD8、CD19和CD68共表達(dá)
Fig 5 Co-expression of PDGF-A with CD4,CD8,CD19 and CD68 in HCC tissues

討 論

PDGF-A是功能最強的生長因子之一,通過自分泌或旁分泌調(diào)節(jié),對多種腫瘤的進(jìn)展至關(guān)重要,并與患者不良預(yù)后相關(guān)[3,8-9]。本文運用定量RT-PCR檢測了人HCC組織中PDGF-A的mRNA,發(fā)現(xiàn)其在癌組織中的表達(dá)水平高,近50%(24/50例)的癌組織PDGF-A基因表達(dá)量是癌旁組織的2倍及以上,尤其在早期和進(jìn)展期(BCLC 0和C期)的HCC病例中。因本文病例較少,PDGF-A是否在HCC早期促進(jìn)腫瘤的生長,在HCC晚期促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移,尚有待更多的實驗數(shù)據(jù)驗證。

雖然HCC屬于PDGF及其受體基因缺陷發(fā)生率低的腫瘤[10],但有多篇文獻(xiàn)顯示PDGF-A在HCC癌組織中表達(dá)升高。運用高密度寡核苷酸陣列檢測38例HCV相關(guān)HCC,發(fā)現(xiàn)與正常肝組織相比,癌組織PDGF-A基因表達(dá)高[11]。國內(nèi)學(xué)者[6]運用免疫組化研究了44例HCC患者,發(fā)現(xiàn)癌組織表達(dá)PDGF-A高于相應(yīng)的癌旁和正常肝組織,且低分化者高于高分化者,伴門靜脈癌栓者高于無門靜脈癌栓者,提示PDGF-A與腫瘤的增殖分化及浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)。對PDGF-A受體PDGFR-α的研究顯示,雖然該受體基因表達(dá)整體下調(diào),但其蛋白質(zhì)水平在人HCC中顯著高于癌旁肝組織,其過表達(dá)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和預(yù)示患者預(yù)后差,可作為預(yù)后指標(biāo)和治療的靶點[12]。

本文檢測了培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株中PDGF-A蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)其表達(dá)于3株肝癌細(xì)胞株(MHCC97-H、SMMC-7721、HCCLM3)以及L02肝細(xì)胞株(人胚胎肝細(xì)胞)。MHCC97-H是復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院建立的高侵襲轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株,動物模型肺轉(zhuǎn)移率達(dá)100%[13],之后又從該細(xì)胞系得到更高轉(zhuǎn)移潛能的HCCLM3細(xì)胞系[14]。SMMC-7721來源于我國1名50歲男性原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌,生長較迅速且較穩(wěn)定,免疫缺陷小鼠體內(nèi)成瘤率高[15]。4株細(xì)胞(HepG2、Hep3B、Huh7和BEL-7402)在本實驗條件下未檢測到PDGF-A蛋白質(zhì),其中3株細(xì)胞系屬分化程度高的肝腫瘤:HepG2是從阿根廷1名15歲高加索男孩的原發(fā)性肝胚細(xì)胞瘤中分離出并建立的,低轉(zhuǎn)移,在裸鼠中成瘤率較差;Hep3B分離自8歲美國黑人男童的肝癌組織,在裸鼠中能致瘤,但基本不轉(zhuǎn)移;Huh-7是從1名57歲日本男性肝癌組織標(biāo)本上培養(yǎng)而得,高度分化[16]。

本文的免疫組化結(jié)果顯示HCC組織中PDGF-A有多個來源,一是癌細(xì)胞本身表達(dá),二是腫瘤間質(zhì)區(qū)域和緊鄰癌組織的間質(zhì)區(qū)域的炎癥細(xì)胞。近60%病例的肝癌細(xì)胞表達(dá)PDGF-A,陽性染色有兩種分布方式:彌漫于胞質(zhì)內(nèi),在細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞膜局部聚集。這兩種分布形式在其發(fā)揮功能中是否有差異,尚需進(jìn)一步研究。腫瘤間質(zhì)區(qū)域和緊鄰癌組織的癌旁間質(zhì)區(qū)域的大量炎癥細(xì)胞PDGF-A陽性,提示HCC癌細(xì)胞不僅可以接受本身PDGF-A的自分泌刺激,也可能接受來源于鄰近組織間質(zhì)炎細(xì)胞分泌PDGF-A的旁分泌刺激。有文獻(xiàn)報道PDGF家族分子與腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞之間相互作用。PDGF-D可結(jié)合腫瘤微環(huán)境中活化的自然殺傷細(xì)胞,促其分泌干擾素γ、腫瘤壞死因子α等促炎因子和趨化因子,激活免疫應(yīng)答,誘導(dǎo)促炎反應(yīng),限制癌細(xì)胞在體外和體內(nèi)的生長[17]。PDGF-B可負(fù)向調(diào)節(jié)jumonji域蛋白6的表達(dá)水平,從而促進(jìn)T細(xì)胞衰竭[18]。目前尚無HCC微環(huán)境中PDGF-A與免疫細(xì)胞之間關(guān)系的研究報道。

生理情況下,PDGF主要表達(dá)于血小板α顆粒內(nèi)。當(dāng)肝損傷發(fā)生時,PDGF可高表達(dá)于巨噬細(xì)胞、受傷的內(nèi)皮細(xì)胞和激活的肝星狀細(xì)胞[19]。已有文獻(xiàn)報道人肝病組織內(nèi)PDGF-A表達(dá)的細(xì)胞類型。Malizia等[20]在因多種疾病而進(jìn)行肝移植患者的肝組織中,運用原位雜交技術(shù)顯示PDGF-A mRNA在單個核細(xì)胞和增生小膽管細(xì)胞大量表達(dá),也表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞,且通過連續(xù)切片的CD68免疫組化染色,證明巨噬細(xì)胞表達(dá)PDGF-A mRNA。Pinzani等[21]研究顯示,正常人肝中PDGF-A表達(dá)很少,而肝硬化組織PDGF-A表達(dá)顯著增加,免疫組化顯示其分布于硬化結(jié)節(jié)的血竇結(jié)構(gòu),原位雜交顯示其主要位于肝細(xì)胞和增生小膽管,也出現(xiàn)在纖維間隔內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞,偶爾出現(xiàn)在纖維間隔和硬化結(jié)節(jié)內(nèi)浸潤的炎癥細(xì)胞中。目前尚無文獻(xiàn)關(guān)注HCC組織中PDGF-A在癌細(xì)胞以外的細(xì)胞表達(dá)。本文首次應(yīng)用免疫雙熒光染色技術(shù)顯示4種炎癥細(xì)胞(CD4+、CD8+、CD19+和CD68+細(xì)胞)可以表達(dá)PDGF-A,不僅提示多種間質(zhì)炎細(xì)胞能通過分泌PDGF-A影響HCC細(xì)胞,也為后續(xù)HCC免疫微環(huán)境的研究提供了線索。