王國光， 孟令平， 胡明秀， 洪玉萍， 官兵

肝臟寄生蟲感染是引起纖維化-肝硬化的原因之一，在東南亞包括中國，以日本血吸蟲感染最為多見，它既可以感染人類，也可以在動(dòng)物身上出現(xiàn)[1]，曾經(jīng)在全球多地區(qū)爆發(fā)流行，極大地?fù)p害了人類以及畜類動(dòng)物的健康[2]。人體感染血吸蟲后，主要發(fā)病器官為肝臟及結(jié)腸，肝臟的慢性病理侵害是血吸蟲病引起臨床癥狀的主要原因，而且如果慢性血吸蟲性肝硬化晚期患者同時(shí)患上乙型肝炎，會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞損害加劇，增加誘發(fā)肝癌的風(fēng)險(xiǎn)[3]。因此，積極預(yù)防、早期發(fā)現(xiàn)血吸蟲肝纖維化和肝硬化對有效治療血吸蟲病患者具有非常重要的意義。MRS(magnetic resonance spectrum，MRS)是目前唯一從分子水平反映組織生理代謝改變的一種無創(chuàng)性檢查技術(shù)，本研究主要討論血吸蟲性肝纖維化的1H-MRS波譜表現(xiàn)。

材料與方法

1.動(dòng)物模型建立

選用健康新西蘭大白兔，雄性，清潔級，體重大約2～3 kg，共25只，動(dòng)物生產(chǎn)單位河南百儀寧生物科技公司，動(dòng)物飼養(yǎng)單位中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海市獸醫(yī)研究所松江實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。標(biāo)準(zhǔn)方法飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程對動(dòng)物的各項(xiàng)處置均符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新西蘭大白兔隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組19只，采用經(jīng)腹部尾蚴貼片法誘導(dǎo)血吸蟲肝纖維化，對照組6只，以不含尾蚴的去氯水進(jìn)行空白處理。

2.磁共振檢查

模型成功建立后，分別于第6周、第9周隨機(jī)選擇實(shí)驗(yàn)組大白兔5只、空白組2只，第12周實(shí)驗(yàn)組大白兔8只、空白組2只行磁共振檢查。

腹腔注射，麻醉劑為10%水合氯醛，用藥劑量4～5 mL/kg，麻醉深度：角膜反射遲緩、肢體肌力明顯下降，嗜睡狀態(tài)。受試兔采取仰臥位，四肢固定于特制木板上(防止受試兔中途醒來或肢體亂動(dòng)造成運(yùn)動(dòng)偽影)；同時(shí)腹部采用棉紗布包裹及用病服覆蓋(防止受試兔在檢查過程中由于磁共振機(jī)房溫度較低而死亡)。

檢查儀器為荷蘭Philips Achieva 1.5T超導(dǎo)型磁共振成像儀，呼吸門控，線圈選用本單位的常規(guī)人體膝關(guān)節(jié)掃描的8通道體部相控陣表面線圈。受試兔仰臥固定于檢查板上位，將檢查板置于線圈內(nèi)，上腹部位于中心，掃描范圍為膈頂?shù)诫p腎下極。

行肝臟常規(guī)MRI及MRS檢查。MRS：采用PRESS序列，掃描參數(shù)：TR 2000 ms，TE 144 ms，層厚5 mm，視野15 mm×15 mm，體素4 mm×15 mm(AP×RL)，激勵(lì)次數(shù)16次。首先選取常規(guī)MRI序列進(jìn)行肝臟三平面掃描，選擇最合適的層面及檢查區(qū)域，一般在肝左葉上方層面放置興趣區(qū)(region of interest,ROI)容積，興趣區(qū)約10 mm×10 mm×10 mm，盡量選擇肝臟實(shí)質(zhì)中間區(qū)域，遠(yuǎn)離肝臟及肝裂，避開較大的血管及膽管，也不能太過靠近肝臟邊緣，會(huì)受到皮下脂肪和腸管的影響。首先進(jìn)行預(yù)掃描，在ROI周圍放置飽和帶，降低周圍組織的影響；預(yù)掃描結(jié)束后，利用PRESS序列對選定的體素進(jìn)行1H-MRS檢查。

3.病理檢查

磁共振檢查完成后，于病理科過量麻醉實(shí)驗(yàn)大白兔，剖腹取出新鮮肝臟標(biāo)本，測量大小并記錄，然后標(biāo)本固定。根據(jù)MRI波譜檢查選取的感興趣區(qū)進(jìn)行肝臟取材制作標(biāo)本切片，行HE染色、網(wǎng)狀纖維染色、Masson染色。

由1位病理科醫(yī)師及1位病理科主任醫(yī)師采用雙盲法，觀察顯微鏡下肝細(xì)胞有無細(xì)胞壞死，肝血竇及匯管區(qū)的結(jié)構(gòu)，血吸蟲蟲卵結(jié)節(jié)，纖維組織間隔增生情況，假小葉生成情況等。按組織病理學(xué)進(jìn)行肝纖維化分級[4]，共分5級。S0：無纖維化。S1：匯管區(qū)周圍纖維化，星芒狀纖維，局限竇周纖維化或小葉內(nèi)纖維瘢痕，仍存在完整的肝小葉。S2：可以見到纖維間隔形成，即橋接纖維化，主要由橋接壞死發(fā)展而來，雖有纖維間隔形成，但是小葉結(jié)構(gòu)大部分仍保留。S3：可以見到大量纖維間隔形成，分隔并破壞小葉，導(dǎo)致小葉結(jié)構(gòu)混亂，但未見到明顯的假小葉，此期可出現(xiàn)門脈高壓和食管靜脈曲張。S4：早期肝硬化期，彌漫性纖維增生，大部分肝小葉被破壞，被分隔的肝細(xì)胞團(tuán)呈不同程度的再生和假小葉形成。此期炎癥多尚在進(jìn)行，纖維間隔寬大疏松，改建尚不充分。這與肝硬化不同，在肝硬化時(shí)，纖維包繞于假小葉周圍，間隔內(nèi)膠原及彈力纖維經(jīng)改建，多環(huán)繞假小葉呈平行排列。

4.數(shù)據(jù)采集

常規(guī)MRI圖像采用雙盲法進(jìn)行診斷，由2名高年資的、具有豐富的MRI影像診斷經(jīng)驗(yàn)的主治醫(yī)師閱片，并對實(shí)驗(yàn)組和空白對照組所有兔的T1WI、T2WI序列圖像的肝臟形態(tài)變化、信號特點(diǎn)及其他相關(guān)并發(fā)癥做出診斷分析。

獲取1H-MRS原始圖像后，在Philips工作站上利用軟件程序進(jìn)行后處理，使1H-MRS波譜圖像基線平穩(wěn)，得到3個(gè)代謝物的波峰：水峰(H2O)、膽堿峰(Cho)及LIP 峰，水峰定位于4.6～4.7 ppm，膽堿峰定位于3.2～3.3 ppm，脂質(zhì)峰則是位于1.3～1.44 ppm處。通過后處理軟件獲取水峰(H2O)、膽堿峰(Cho)及LIP峰的峰值數(shù)據(jù)，以及水峰下面積、Lip峰下面積的數(shù)據(jù)，峰下面積可以代表代謝物的濃度；用Microsoft office Excel 2007搜集數(shù)據(jù)，并計(jì)算脂肪分?jǐn)?shù)(fat fraction)，脂肪分?jǐn)?shù)=Lip峰下面積/(Lip峰下面積+Water峰下面積)×100%。

圖1 肝病理切片，HE染色(4×100)。a) 對照組S0期； b) 實(shí)驗(yàn)組S1期； c) 實(shí)驗(yàn)組S2期； d) 實(shí)驗(yàn)組S3-4期。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。首先對1H-磁共振波譜數(shù)據(jù)結(jié)果采用方差齊性檢驗(yàn)及正態(tài)性檢驗(yàn)(單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn))，對符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)結(jié)果采用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與血吸蟲性肝纖維化病理分級相關(guān)性，進(jìn)行Pearson相關(guān)分析。對不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)結(jié)果用中位數(shù)(四分位數(shù))表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis檢驗(yàn))分析。與血吸蟲性肝纖維化病理分級相關(guān)性，采用Spearman相關(guān)分析。

結(jié) 果

1.血吸蟲肝纖維化模型的建立結(jié)果

實(shí)驗(yàn)大白兔感染血吸蟲后，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長，病情進(jìn)展，病兔體格消瘦，毛發(fā)紊亂，色澤發(fā)黃，食欲較差，精神不振；實(shí)驗(yàn)組兔(n=18)于第9周末死亡1只，死亡率為1/18。正常對照組兔全部存活(n=6)，精神狀態(tài)可，體格健壯，毛發(fā)光澤，食欲可，未及其他癥狀。

2.病理學(xué)檢查結(jié)果

對照組6例，新西蘭大白兔實(shí)驗(yàn)組病肝共18例，其中S1期(輕度肝纖維化)5例，S2期(中度肝纖維化)7例，S3-4期(重度肝纖維化及早期肝硬化)6例(圖1)。

3.MRS波譜分析結(jié)果

所有1H-MRS譜線均可以看到在4.6～4.7 ppm處出現(xiàn)一高尖的水峰(H2O)，清晰顯示肝臟H2O峰及其峰下面積，同時(shí)在1.3～1.4 ppm處可以看到一低矮的脂質(zhì)峰(Lip)，脂質(zhì)峰及其峰下面積顯示也比較清晰，部分譜線還可以在3.2～3.3 ppm處看到一低平的膽堿峰(Cho)。

健康對照組6例，5例得到成功1H-MRS譜圖(圖2a)；實(shí)驗(yàn)組大白兔18例，共得到肝臟1H-MRS波譜圖像15例，其中S1期有5例(圖2b)，S2期有6例(圖2c)，S3～4期有4例(圖2d)。

通過后期處理軟件計(jì)算得到水峰(H2O)、膽堿峰(Cho)及Lip峰峰值以及波峰下面積的數(shù)據(jù)，并計(jì)算脂肪分?jǐn)?shù)(fat fraction，表1～4)。

隨著血吸蟲性肝纖維化的進(jìn)展，1H-MRS波譜水峰(H2O)峰值呈下降趨勢(P<0.05)，二者呈輕度負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.615 (P<0.05)，其中S0期與S2及S3期差異明顯(P<0.05)；其余各期之間無顯著差別(P>0.05)。水峰(H2O)下面積亦呈下降趨勢，r=-0492 (P<0.05)，其中S0期與S3～4期差異較顯著(P<0.05)，其余各期之間無顯著差別(P>0.05)。膽堿峰(Cho)呈上升趨勢(P<0.05)，與血吸蟲肝纖維化分期呈輕度正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r=0.528(P<0.05)。血吸蟲肝纖維化實(shí)驗(yàn)組脂質(zhì)峰(Lip)、脂質(zhì)峰(Lip)下面積、脂肪分?jǐn)?shù)及Cho/Lip與對照組差異不明顯(P>0.05)，但脂質(zhì)(Lip)峰下面積呈輕度上升趨勢，與血吸蟲肝纖維化分期呈輕度正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.615(P<0.05)。

圖2 1H-MRS圖譜。a) 對照組S0期； b) 實(shí)驗(yàn)組S1期； c) 實(shí)驗(yàn)組S2期； d) 實(shí)驗(yàn)組S3-4期。

表1 兔血吸蟲肝纖維化模型1.5T 1H-MRS結(jié)果定量分析

注：P<0.05為統(tǒng)計(jì)結(jié)果有意義。符合方差齊性與正態(tài)分布，采用單因素方差分析(P<0.05)。

表2 兔血吸蟲肝纖維化模型1.5T 1H-MRS結(jié)果定量分析中位數(shù)(四分位數(shù))

注：P<0.05為統(tǒng)計(jì)結(jié)果有意義。符合正態(tài)分布，但不符合方差齊性，采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)分析(P<0.05)。

討 論

血吸蟲性肝纖維化-肝硬化的發(fā)展是一個(gè)長期漸進(jìn)的過程，目前早期治療效果較好，而晚期血吸蟲性肝硬化期難以逆轉(zhuǎn)，對患者肝臟功能造成損害[5]。迫切需要一種可靠、無創(chuàng)傷性的、具有良好可重復(fù)性的方法來評價(jià)和觀察血吸蟲肝纖維化的進(jìn)展、轉(zhuǎn)歸以及藥物治療效果。

Orlacchio等[6]研究發(fā)現(xiàn)丙型肝炎患者采用3T磁共振進(jìn)行1H-MRS檢查，肝內(nèi)代謝物的變化與病理對照結(jié)果具有高度一致性，所以，Orlacchio等認(rèn)為MRS可以代替肝臟穿刺活檢，準(zhǔn)確評估肝纖維化的分級。MRS屬于磁共振功能成像技術(shù)，是采用磁共振現(xiàn)象和化學(xué)位移作用，利用射頻脈沖激勵(lì)被檢物質(zhì)的原子核，再將獲得的含有特別信息的磁共振信號經(jīng)傅立葉函數(shù)變換，以波形的樣式在化合物固定的頻率位置上顯示出來的成像技術(shù)。它可以定量分析某些特定的原子核及其化合物，在不損傷機(jī)體的前提下研究反應(yīng)活體生物組織生理代謝并在細(xì)胞水平上檢測能量代謝變化[7]，使醫(yī)學(xué)影像學(xué)不再局限于單純的大體形態(tài)診斷，在細(xì)胞分子水平反映功能代謝的研究有了很大的發(fā)展[8-10]。目前，主要有1H、31P、19F、23Na、3He、39K、14N、13C等原子核應(yīng)用于MRS的研究，1H在人體內(nèi)天然豐度最高，不需要再引入外源性代謝物，并且可與常規(guī)MRI檢查共享相同的裝置，因此1H-MRS的臨床研究及臨床應(yīng)用最廣泛。目前在神經(jīng)系統(tǒng)特別是腦部的腫瘤檢查應(yīng)用中最多見，在慢性肝病以及惡性腫瘤的診斷研究、反映肝臟疾病治療效果中的應(yīng)用也越來越廣泛。本實(shí)驗(yàn)采用PRESS序列，單體素技術(shù)進(jìn)行1H-MRS檢查。Miriam等[11]研究發(fā)現(xiàn)屏氣狀態(tài)下與采用呼吸門控方式進(jìn)行1H-MRS得到的波譜結(jié)果無明顯差異，兩者具有高度的一致性。有文獻(xiàn)報(bào)道[12]，3.0T MR的信噪比較1.5T MR顯著提高，但由于動(dòng)物腹部呼吸和胃腸道氣液體等因素的影響，3.0T MR會(huì)出現(xiàn)更明顯的運(yùn)動(dòng)偽影和磁敏感偽影，導(dǎo)致圖像顯著失真變形。本研究利用1.5T MR采用呼吸門控式1H-MRS對所有大白兔進(jìn)行檢查。

表3 1.5T 1H-MRS結(jié)果與肝纖維化分級相關(guān)性

注：采用Pearson相關(guān)分析，P<0.05為統(tǒng)計(jì)結(jié)果有意義。

表4 1.5T 1H-MRS結(jié)果與肝纖維化分級相關(guān)性

注：采用Spearman相關(guān)分析，P<0.05為統(tǒng)計(jì)結(jié)果有意義。

本研究主要測定新西蘭大白兔1H-MRS 譜線上的水峰(H2O)、膽堿峰(Cho)和脂質(zhì)峰(Lip)。其中水峰(H2O)可以反映肝細(xì)胞內(nèi)外水的代謝情況；膽堿峰(Cho)通過檢測肝細(xì)胞膜磷脂化合物的代謝水平，可以反映細(xì)胞增殖狀況；脂質(zhì)峰(Lip)可以觀察、檢測肝臟局部組織內(nèi)脂質(zhì)代謝的變化情況。

本研究1H-MRS結(jié)果顯示血吸蟲性肝纖維化組水峰的峰值、峰下面積與正常對照組差異較大。血吸蟲病的基本病變是由蟲卵在組織中沉積所引起的蟲卵結(jié)節(jié)。在肝臟感染血吸蟲病早期，蟲卵內(nèi)的毛蚴可以產(chǎn)生大量可溶性蟲卵抗原(soluble egg antigen,SEA)，機(jī)體受到SEA的刺激，引起機(jī)體急性炎癥反應(yīng)，形成炎性肉芽腫[13]。肉芽腫中央為蟲卵，蟲卵外環(huán)繞炎性細(xì)胞，多數(shù)為嗜酸性細(xì)胞，周圍有新生肉芽組織包裹，形成急性蟲卵結(jié)節(jié)，所以肝臟內(nèi)水的代謝變化不大。隨時(shí)間進(jìn)展，蟲卵內(nèi)的毛蚴進(jìn)入凋亡期，崩解并鈣化，周圍有較多類上皮細(xì)胞，異物巨細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤包繞，類似結(jié)核干酪樣壞死，壞死蟲卵被肉芽組織包裹，形成慢性蟲卵結(jié)節(jié)，最后結(jié)節(jié)發(fā)生纖維化。隨著肝纖維化的進(jìn)展，星狀細(xì)胞(HSC)活化[14]變?yōu)槌衫w維細(xì)胞，產(chǎn)生大量膠原纖維并逐步沉積于肝組織，肝小葉重構(gòu)、假小葉形成，壓迫肝血竇[15]；同時(shí)肝竇區(qū)域的內(nèi)皮下基底膜形成，誘導(dǎo)肝竇向毛細(xì)血管轉(zhuǎn)化，致使肝竇的滲透減壓功能受損；肝硬化結(jié)節(jié)期出現(xiàn)新生及不成對血管，蟲卵阻塞靜脈分支形成較多閉塞血管，導(dǎo)致肝臟實(shí)質(zhì)微循環(huán)穩(wěn)態(tài)受損、肝實(shí)質(zhì)血流灌注下降；由于肝內(nèi)門靜脈匯管區(qū)周圍纖維組織增生, 使門靜脈分支管壁毛糙增厚，門靜脈血流灌注下降，等一系列因素導(dǎo)致肝纖維化晚期肝內(nèi)水分子含量減低[16,17]。

王秋實(shí)等[18]研究發(fā)現(xiàn)隨著肝纖維化的進(jìn)展，膽堿峰(Cho)峰值逐漸升高，本研究的結(jié)果與其相一致。在S0期及S1期的肝臟1H-MRS譜形中幾乎見不到膽堿峰，僅能用后處理軟件默認(rèn)測量3.2～3.3ppm處峰值。膽堿峰代表了肝臟內(nèi)肝細(xì)胞膜磷脂類代謝物的水平，可以有效地反映當(dāng)前狀態(tài)下肝臟內(nèi)細(xì)胞增殖的水平。在正常對照組中，肝細(xì)胞新陳代謝處于正常水平，肝細(xì)胞膜磷脂代謝處于一個(gè)平穩(wěn)水平，所以幾乎檢測不到膽堿峰；而在血吸蟲肝病早期，以急性蟲卵結(jié)節(jié)形成為主，肝細(xì)胞變性壞死較為少見，并無異常肝細(xì)胞膜磷脂代謝，所以很少能檢測到膽堿峰。而在肝臟纖維化中后期，肝細(xì)胞發(fā)生變性壞死，小葉結(jié)構(gòu)破壞，膠原纖維增生，假小葉形成，在此過程中，肝細(xì)胞新陳代謝旺盛，細(xì)胞增殖能力提升，對能量儲(chǔ)存、利用逐漸增加，所以可見檢測到明顯的膽堿峰。

肝臟在機(jī)體脂肪成分的新陳代謝過程中擔(dān)任著非常重要的角色，是脂類合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和消耗的工廠。所以肝臟內(nèi)脂質(zhì)代謝的過程深受肝臟功能狀態(tài)的影響。近年來，肝臟1H-MRS的研究越來越多，但是慢性肝臟纖維化病變進(jìn)程中脂質(zhì)的變化情況目前還留存著很多爭議，肝臟脂質(zhì)含量的變化與肝纖維化分級是否存在相關(guān)性眾說紛紜。王秋實(shí)等[18]研究發(fā)現(xiàn)隨著肝纖維化的進(jìn)展，脂質(zhì)峰(Lip)峰值逐漸降低。王六紅等[19]研究認(rèn)為在慢性肝纖維化病變的發(fā)展進(jìn)程中，1H-MRS 脂質(zhì)波峰的變化是一個(gè)比較復(fù)雜的過程。Cho等[20]研究發(fā)現(xiàn)，健康肝臟的脂質(zhì)波峰峰高明顯高于慢性肝病，但隨著肝病的進(jìn)展，慢性肝病后期肝內(nèi)脂質(zhì)的含量反而呈上升趨勢。周麗鳳等[21]研究發(fā)現(xiàn)正常對照組的脂質(zhì)峰與早期肝硬化患者之間存在差異，主要是因?yàn)殡S著肝硬化的進(jìn)展肝細(xì)胞受損，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)不同程度的水腫、變性以及脂肪浸潤，對脂肪的代謝功能受到影響。

本研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大白兔血吸蟲性肝纖維化期脂質(zhì)峰高低于健康對照組，而脂肪分?jǐn)?shù)隨著血吸蟲性肝纖維化的病程進(jìn)展而呈上升趨勢(P>0.05)。本研究認(rèn)為在肝臟感染血吸蟲早期，主要病變是急性蟲卵結(jié)節(jié)的形成，肝臟內(nèi)脂質(zhì)代謝功能未受明顯影響。而受急性炎癥的影響，肝臟腫大，質(zhì)量增加，所以相應(yīng)體素內(nèi)肝臟含量相對減少，所以1H-MRS 脂質(zhì)波峰在血吸蟲肝病早期會(huì)輕度下降。但隨著血吸蟲肝纖維化的發(fā)展，蟲卵沉積在肝內(nèi)有分布差異，血吸蟲肝纖維化進(jìn)程在肝內(nèi)并非同步進(jìn)行，所以血吸蟲肝臟內(nèi)脂肪代謝功能的變化有較大的差異；同時(shí)肝內(nèi)脂肪信號會(huì)受到蟲卵結(jié)節(jié)鈣化的影響，感興趣區(qū)的選擇不能避開鈣化的影響，所以1H-MRS 脂質(zhì)波峰的變化會(huì)出現(xiàn)不同的結(jié)果。

目前肝臟1H-MRS的臨床研究和應(yīng)用已經(jīng)取得了巨大進(jìn)展，但是仍然存在很多問題：(1)檢查時(shí)間都比較長, 受呼吸運(yùn)動(dòng)影響較大，不同病變波譜成功率不一致。(2)信噪比(SNR)比較差，數(shù)據(jù)后處理過程較為復(fù)雜。但是隨著MRI/MRS硬件的改進(jìn)、軟件功能的完善及臨床研究的深入發(fā)展，MRS檢查時(shí)間進(jìn)一步縮短，SNR提高，MRS的可信度會(huì)越來越高。MRS作為一種可以無創(chuàng)性檢測活體機(jī)體組織及細(xì)胞內(nèi)部生化信息的功能成像檢查技術(shù)，有著廣闊的發(fā)展空間。