呂日英 許超宇 付少萍 李仕雄 江 波

(廣西醫(yī)科大學(xué)第八附屬醫(yī)院感染科，貴港市 537100，電子郵箱：lvriying@163.com)

近年來，持續(xù)開展的高效聯(lián)合抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy，HAART)顯著降低了發(fā)展中國家AIDS相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生率和死亡率[1-2]。由于HIV具有高速復(fù)制的特點，在治療過程患者體內(nèi)會出現(xiàn)復(fù)雜混合的病毒準(zhǔn)種，而隨后在藥物選擇壓力下，耐藥毒株逐漸成為體內(nèi)的優(yōu)勢毒株，并對一種或者多種藥物產(chǎn)生耐藥[3]，最終會降低HAART的療效[4]，故耐藥被認(rèn)為是導(dǎo)致治療失敗的主要因素[5]。因此，本研究選擇首次接受HAART治療并發(fā)生治療病毒學(xué)失敗的HIV感染/AIDS患者為研究對象，分析其基因型耐藥的發(fā)生情況，以及發(fā)生基因型耐藥的影響因素，以期為制定適合本地區(qū)實際情況的AIDS綜合防治措施以及提高HAART治療效果提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 根據(jù)國家艾滋病病人綜合防治信息系統(tǒng)，選擇廣西貴港市所有醫(yī)院內(nèi)2007年1月1日至2016年4月1日接受HAART治療并發(fā)生病毒學(xué)失敗的311例HIV-1感染/AIDS患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：開始接受抗病毒治療時年齡≥18歲；均為首次接受HAART治療；治療時間≥6個月；隨訪時間間隔不超過3個月；符合HAART治療病毒學(xué)失敗的判定標(biāo)準(zhǔn)[6]，即HAART治療時間≥6個月，病毒載量仍>1 000拷貝/mL。排除標(biāo)準(zhǔn)：復(fù)治患者；缺失關(guān)鍵信息資料者?；颊呔鶎Ρ狙芯恐橥獠⒑炇鹬橥鈺?。

1.2 基因型耐藥檢測 患者發(fā)生病毒學(xué)失敗時立即進(jìn)行耐藥檢測。采集患者肘靜脈血5 mL，3 000 r/min離心15 min后取上層血漿。采用NucliSENS@miniMag@核酸提取系統(tǒng)(生物梅里埃中國有限公司)從血漿中提取HIV RNA，反轉(zhuǎn)錄為DNA后采用巢式PCR的方法擴(kuò)增HIV-1 pol區(qū)基因片段，擴(kuò)增范圍為HIV-1 pol區(qū)蛋白酶基因全序列和反轉(zhuǎn)錄酶1～219位密碼子序列，擴(kuò)增使用的引物序列見表1。第一輪PCR反應(yīng)總體系為25 μL,運(yùn)行程序：50℃ 30 min，95℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min 30 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min。第二輪PCR反應(yīng)總體系為50 μL，運(yùn)行程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 2 min 30 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min。制備濃度為0.8%～1.0%瓊脂糖凝膠，然后吸取5 μL PCR產(chǎn)物加入上樣孔，以5 V/cm電壓電泳20～30 min后，將凝膠置于凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司，型號：TS-3000)內(nèi)觀察結(jié)果。將擴(kuò)增陽性產(chǎn)物送北京博邁德科技發(fā)展有限公司進(jìn)行測序，之后采用ChromasPro 1.3軟件對序列進(jìn)行編輯、拼接和校正。將合格的序列提交到斯坦福大學(xué)艾滋病病毒耐藥數(shù)據(jù)庫(http://hivdb.stanford.edu)進(jìn)行耐藥性分析。該數(shù)據(jù)庫將耐藥程度分為敏感、潛在耐藥、低度耐藥、中度耐藥、高度耐藥5個水平，本研究將低度及以上耐藥性定義為基因型耐藥[6]。

表1 擴(kuò)增使用的引物序列

1.3 分組和資料收集 根據(jù)基因型耐藥發(fā)生情況將患者分為耐藥組和對照組。從艾滋病綜合防治信息系統(tǒng)—抗病毒治療管理數(shù)據(jù)庫中收集所有患者的相關(guān)基線信息及隨訪信息，包括性別、治療時基線年齡、婚姻狀態(tài)、感染途徑、職業(yè)、服藥依從性(已服藥量/處方所開藥量×100%)、基線病毒載量水平、基線CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)、治療前世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)臨床分期、治療前復(fù)方新諾明服用史、治療前結(jié)核病史、治療前HBV及HCV感染情況、治療前機(jī)會性感染種數(shù)、治療前癥狀(發(fā)熱、呼吸系統(tǒng)感染、消化系統(tǒng)感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、皮膚病變)數(shù)量、HAART治療方案。本研究中，患者采用的HAART治療方案均為一線治療方案，分為以司他夫定(stavudine，d4T)/齊多夫定(zidovudine，AZT)/替諾福韋(tenofovir，TDF)為基礎(chǔ)的方案，以及以奈韋拉平(nevirapine，NVP)/依非韋倫(efavirenz，EFV)為基礎(chǔ)的方案。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Logistic回歸模型分析病毒學(xué)失敗者發(fā)生基因型耐藥的影響因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者一般資料比較 311例HAART治療后病毒學(xué)失敗的HIV感染/AIDS患者中，共167例發(fā)生基因型耐藥(53.7%)。耐藥組(n=167)和對照組(n=144)患者在基線年齡、婚姻狀態(tài)、基線CD4+T細(xì)胞水平、治療時間、基線病毒水平、依從性、治療前癥狀數(shù)量、治療前機(jī)會性感染種數(shù)、基線臨床分期及治療方案等方面比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者的資料比較[n(%)]

2.2 HAART治療病毒學(xué)失敗患者發(fā)生基因型耐藥的影響因素 以是否發(fā)生基因型耐藥為因變量，2.1中有統(tǒng)計學(xué)意義的因素為自變量，納入Logistic回歸模型進(jìn)行分析，變量賦值見表3。結(jié)果顯示，年齡、婚姻狀態(tài)、基線CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)、基線病毒載量水平、依從性、治療方案、治療時間是HAART治療失敗者發(fā)生基因型耐藥的影響因素(均P<0.05)。見表4。

表3 變量賦值

表4 多因素Logistic回歸分析結(jié)果

3 討 論

廣西是我國HIV流行較為嚴(yán)重的地區(qū)，但廣西的HIV耐藥性與抗病毒療效監(jiān)測體系尚未完善，仍缺少有關(guān)HIV耐藥性流行情況及其影響因素的研究。此外，一線治療失敗時存在的多水平耐藥會使得二線治療選擇減少。因此，及時了解HIV耐藥情況及其影響因素顯得十分重要和迫切。本組接受HAART治療發(fā)生病毒學(xué)失敗的311例患者中，有53.7%的患者發(fā)生基因型耐藥，與相關(guān)研究結(jié)果[7]相似。

多因素分析結(jié)果顯示，年齡、婚姻狀態(tài)、治療方案、依從性、治療時間、基線病毒載量水平、基線CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)均是HAART治療失敗患者發(fā)生基因型耐藥的影響因素(均P<0.05)。(1)開始抗病毒治療時，HIV感染者/AIDS患者的年齡越大，HAART治療失敗患者發(fā)生基因型耐藥的風(fēng)險越大，考慮原因如下：一方面，治療開始后，年齡較大的HIV感染/AIDS患者CD4+T淋巴細(xì)胞絕對數(shù)的增長低于低年齡者；另一方面，年齡大的HIV感染/AIDS患者更易合并高血壓、糖尿病、腦中風(fēng)、冠心病等基礎(chǔ)疾病，或并發(fā)各種機(jī)會性感染，這些疾病的發(fā)生常導(dǎo)致HAART治療中斷、服藥依從性降低，此外治療各種基礎(chǔ)疾病的藥物與抗病毒藥物之間可能存在相互作用，進(jìn)一步增加了患者發(fā)生耐藥的風(fēng)險。(2)本研究結(jié)果顯示，已婚或同居的HIV感染/AIDS患者發(fā)生耐藥的風(fēng)險低于未婚、離異(分居)或喪偶的患者。已婚或同居患者的日常生活較規(guī)律，且家屬能夠起到情感支持、督促服藥的作用，患者的服藥依從性較好，從而降低了患者發(fā)生耐藥的風(fēng)險。(3)與使用含d4T、EFV的治療方案比較，使用含AZT、TDF或NVP治療方案的患者發(fā)生耐藥的風(fēng)險更高，這可能是因為藥物的毒副反應(yīng)會影響服藥依從性，從而間接影響耐藥的發(fā)生。(4)有研究顯示，良好的服藥依從性能維持患者體內(nèi)的藥物濃度水平，從而達(dá)到對完全抑制病毒復(fù)制、減少耐藥株出現(xiàn)的目的[8]。(5)由于HIV的反轉(zhuǎn)錄酶缺乏校讀功能，易導(dǎo)致復(fù)制鏈發(fā)生堿基錯配，使得患者體內(nèi)出現(xiàn)復(fù)雜混合的病毒準(zhǔn)種；隨后在藥物選擇壓力下，耐藥毒株成為體內(nèi)的優(yōu)勢毒株，并逐漸形成對一種或者多種藥物產(chǎn)生耐藥的現(xiàn)象[3，9]。因此，隨著治療時間的延長，耐藥的發(fā)生風(fēng)險也在不斷增高。(6)本研究結(jié)果顯示，基線病毒載量越高，發(fā)生耐藥的風(fēng)險也越高，與相關(guān)研究結(jié)果[10]相似。HAART能最大限度地減少病毒載量，并將其維持在檢測不到的水平，使患者的免疫功能得以維持或重建，從而延長其生存時間并提高生活質(zhì)量。但治療前體內(nèi)的病毒載量越高，治療達(dá)到病毒抑制所需的時間也越長；而治療時間越長，患者體內(nèi)產(chǎn)生抗藥性的可能性就越大，發(fā)生耐藥的風(fēng)險也就越高。在發(fā)展中國家，開始HAART治療后，如果能定期進(jìn)行病毒載量檢測，即每年檢測病毒載量一次，可以有效監(jiān)測治療失敗的發(fā)生，從而降低耐藥的出現(xiàn)。(7)本研究結(jié)果顯示，CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)基線水平越低，耐藥發(fā)生風(fēng)險越高，與相關(guān)研究結(jié)果類似[8]。基線CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)高的患者發(fā)生機(jī)會性感染等疾病的風(fēng)險較低，因此患者的精神、睡眠、生活質(zhì)量得以保障，服藥依從性也較高；而嚴(yán)格按時、按量服藥能保證治療方案長期、有效地應(yīng)用，從而防止HIV耐藥的出現(xiàn)。

綜上所述，接受HAART治療后發(fā)生病毒學(xué)失敗的HIV感染/AIDS患者的基因型耐藥率較高，且其耐藥的發(fā)生受多種因素影響。因此，在HAART治療過程中應(yīng)采取有效措施監(jiān)測患者CD4+T淋巴細(xì)胞及病毒載量水平的變化，重點關(guān)注年齡大于60歲、婚姻狀態(tài)為未婚的患者，同時謹(jǐn)慎選擇治療方案，加強(qiáng)依從性教育，動態(tài)了解患者用藥情況，及時發(fā)現(xiàn)耐藥患者并調(diào)整治療方案，以期提高HAART治療效果、減少耐藥對患者的影響。