李 佳 劉忠義U - 付 滿 劉紅艷U - 吳小艷 - 李 汀

(1. 廣西高校北部灣特色海產(chǎn)品資源開發(fā)與高值化利用重點實驗室〔北部灣大學(xué)〕，廣西 欽州 535000； 2. 湘潭大學(xué)化工學(xué)院，湖南 湘潭 411105)

發(fā)酵肉制品在發(fā)酵及成熟過程中，由于微生物的發(fā)酵作用，使得蛋白質(zhì)、糖類和脂肪降解，產(chǎn)生多種揮發(fā)性成分如烷烴類、醇類、醛類、酮類、酯類、酚類等化合物[1-2][3]2,39-40。這些風(fēng)味物質(zhì)的存在很可能決定了產(chǎn)品的感官風(fēng)格，是評價香腸品質(zhì)的重要指標(biāo)。

頂空(HS)—固相微萃取(SPME)技術(shù)是提取樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的處理技術(shù)，具有快速簡便、無需溶劑萃取以及使用條件溫和的優(yōu)點[2,4]，可直接與氣相—質(zhì)譜連接鑒定揮發(fā)性風(fēng)味組分。目前，SPME處理技術(shù)已廣泛應(yīng)用于發(fā)酵肉制品[2][3]3-5、香精香料以及其他各類食品中揮發(fā)性化合物成分的分析[4-6]。

傳統(tǒng)的發(fā)酵肉制品一般在低溫環(huán)境經(jīng)過長時間的發(fā)酵和干燥，風(fēng)味獨特[2][3]5,12,25，但是生產(chǎn)加工周期很長，菌相復(fù)雜，且成本高昂。因此，非常有必要接種人工菌種，改進加工工藝，提高發(fā)酵肉制品的食用安全性，縮短發(fā)酵生產(chǎn)時間。有試驗表明，在32 ℃的溫度下，添加人工發(fā)酵劑發(fā)酵6～9 h可以獲得高食用安全品質(zhì)的發(fā)酵香腸[7]；在添加人工發(fā)酵劑，大幅度縮短發(fā)酵生產(chǎn)時間，低于30 g/kg食鹽添加量的條件下，也能很好保障產(chǎn)品的食用安全性[8]。

盡管已有不少關(guān)于傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品或者半發(fā)酵肉制品的相關(guān)風(fēng)味研究[1-2][3]2-5，但是基本上是以成品為研究對象，而發(fā)酵時間與肉制品風(fēng)味的關(guān)系研究較少見，尤其是基本未見接種純培養(yǎng)物短時間發(fā)酵即完成發(fā)酵的發(fā)酵肉制品的風(fēng)味研究。本研究擬采用SPME技術(shù)并結(jié)合氣相-質(zhì)譜(GC-MS)對32 ℃發(fā)酵6 h及9 h香腸的揮發(fā)性成分進行分析和鑒定，并對2種香腸的風(fēng)味品質(zhì)與質(zhì)量做進一步的比較和判斷，以期為發(fā)酵香腸的技術(shù)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

新鮮豬肉：湘潭大學(xué)購物中心；

乳酸菌發(fā)酵劑：3.12×109CFU/g，北京川秀科技有限公司；

酵母發(fā)酵劑：3.95×109CFU/g，安琪酵母股份有限公司；

腸衣：譚氏百盛電子商務(wù)有限公司；

五香粉、姜粉：食品級，上海味好美食品有限公司；

紅曲粉：食品級，上海佳杰天然食品色素有限公司；

磷酸鹽：食品級，市售；

白糖：食品級，廣州福正東海食品有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：GCMS-QP2010Plus型，美國安捷倫公司；

電子分析天平：PTX-FA-110型，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵香腸的制備 參照文獻[8]。

(1) 香腸配方(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以肉總量百分比計)：2.0%食鹽，0.2%味精，0.3%胡椒粉，0.2%姜粉，0.2%五香粉，2.4%白糖，0.1%紅曲粉，0.1%磷酸鹽，0.8%醬油，2.4%黃酒。

(2) 制備方法：瘦肉加入準(zhǔn)備好的腌制劑在2 ℃冷藏柜腌制18 h；然后肥、瘦肉按照5∶3的比例混合，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.08%(以肉總量百分比計)乳酸菌和0.04%酵母后灌腸，將其置于(32±1) ℃、相對濕度75%～80%下發(fā)酵6 h或者9 h；然后在(70±1) ℃的恒溫箱中干燥2 h。

1.2.1 GC-MS分析樣品的制備 分別將發(fā)酵6，9 h的香腸絞碎，稱取一定量的樣品置于萃取瓶內(nèi)，密封后將SPME(50 μm PDMS)針管穿透萃取瓶隔墊，插入瓶內(nèi)，推動手柄使萃取頭伸入樣品上部完成頂空吸附過程，應(yīng)保證萃取纖維頭不要觸碰到樣品，且每次試驗萃取頭與樣品距離一致，在規(guī)定條件下恒溫水浴加熱，萃取完畢迅速插入GC進樣口，解析5 min后，取出SPME手柄及萃取頭。

1.2.2 色譜條件 毛細(xì)管柱(DB-5，60 m×0.25 mm，0.25 μm)；柱溫 40 ℃保持 5 min，再以20 ℃/min程序升溫到120 ℃，而后以5 ℃/min程序升溫到190 ℃，之后以0.5 ℃/min程序升溫到198 ℃，最后以5 ℃/min程序升溫到250 ℃，保持5 min。進樣口溫度250 ℃；載氣(He)流量1 mL/min；解析溫度250 ℃；不分流模式進樣。

傳輸線溫度280 ℃；四級桿溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃；掃描范圍m/z33～450；電離電壓70 eV。

1.2.3 SPME萃取條件單因素試驗 參照文獻[2,9]，在確定解析時間為5 min的前提下研究取樣量(2.5，3.0，3.5，4.0，4.5 g 5個梯度，萃取時間50 min，萃取溫度60 ℃)、萃取時間(35，40，45，50，55 min 5個梯度，樣品量3.0 g，萃取溫度60 ℃)、萃取溫度(50，55，60，65，70 ℃ 5個梯度，選取樣品量3.0 g，萃取時間50 min)3個因素對萃取效果的影響。將總峰面積設(shè)為主要考察指標(biāo)，有效出峰數(shù)(相對峰面積≥0.1%)設(shè)為輔助指標(biāo)。

1.2.4 發(fā)酵香腸樣品的分析 按照前述單因素試驗得出的最佳萃取條件分別對32 ℃發(fā)酵6 h和9 h 2種香腸樣品揮發(fā)性物質(zhì)進行萃取后，直接在GC-MS上機分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 所有試驗重復(fù)3次。用SPSS statistix 16.0統(tǒng)計分析軟件進行均值計算及方差分析，數(shù)值以(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，P<0.05即表示差異顯著。作圖采用Origin 8.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 取樣量對萃取效果的影響

受樣品的揮發(fā)性化合物種類、萃取瓶的容量等因素的影響，樣品的質(zhì)量會影響萃取效果。如圖1所示，樣品量從2.5～3.0 g時，隨著樣品質(zhì)量的提高，出峰面積和數(shù)量隨之增加；此后，當(dāng)樣品質(zhì)量進一步增加時，出峰面積和數(shù)量隨之下降。萃取涂層對萃取品種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的吸附量與其在瓶內(nèi)的濃度有關(guān)[2,9]，當(dāng)萃取品內(nèi)揮發(fā)性化合物濃度較低時，增加其濃度能增加其萃取量。然而，固相微萃取頭的吸附量與萃取瓶的有效空間有關(guān)[2,9]，當(dāng)樣品質(zhì)量達(dá)到3.0 g以上時，樣品占了瓶內(nèi)較大的空間，擠占了萃取瓶的有效空間，導(dǎo)致出峰面積反而降低，且此時相對面積占優(yōu)勢的峰所對應(yīng)的物質(zhì)相對濃度更高，會影響相對濃度低的物質(zhì)的吸附，因此，出峰數(shù)量會同時減小。

圖1 樣品質(zhì)量對萃取效果的影響

2.2 萃取時間對萃取效果的影響

如圖2所示，隨著萃取時間的延長，出峰面積和數(shù)量在35～50 min范圍內(nèi)呈增加趨勢，萃取時間為50 min時，峰面積達(dá)到最大值。而當(dāng)萃取時間增加到55 min時，峰面積略有上升，但出峰數(shù)量略有減少。由于揮發(fā)性物質(zhì)在萃取頭、頂空相、介質(zhì)相存在擴散分配過程，SPME萃取纖維頭需要一定的時間才能達(dá)到吸附平衡[9]，因此萃取初期吸附量增加會較為迅速，隨著時間的延長，萃取頭上吸附的物質(zhì)又逐漸解吸，長時間的萃取對萃取涂層有一定的損耗以及可能導(dǎo)致組分之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，萃取時間到55 min時，峰面積增加，但出峰數(shù)量卻有所下降，可能是萃取頭上部分物質(zhì)的解吸，但個別揮發(fā)性較好的化合物濃度快速增加，因此出現(xiàn)峰面積增加但出峰數(shù)量卻略有降低，故此選擇50 min萃取時間為宜。

2.3 萃取溫度對萃取效果的影響

如圖3所示PDMS，不同溫度下具有不同的萃取效果，萃取溫度在60 ℃時具有最大的峰面積和數(shù)量，在此溫度上隨著溫度的減少和上升，峰面積均呈下降趨勢，但高于此溫度，峰面積下降的速率變緩。各揮發(fā)性物質(zhì)在各相之間的分配及速度也受溫度影響，溫度升高加快了瓶內(nèi)揮發(fā)性物質(zhì)分子的熱運動，有利于擴散，但溫度進一步升高可能使風(fēng)味物質(zhì)之間發(fā)生熱聚合反應(yīng)[2]。根據(jù)試驗結(jié)果，選擇60 ℃萃取溫度較為合適。

圖3 萃取溫度對萃取效果的影響

2.4 發(fā)酵香腸揮發(fā)性成分分析

2.4.1 發(fā)酵香腸中檢出的揮發(fā)性成分 發(fā)酵香腸的揮發(fā)性物質(zhì)的總離子流圖見圖4，風(fēng)味成分種類與其相對含量見表1。

圖4 發(fā)酵香腸的揮發(fā)性化合物總離子圖

2.4.2 2種香腸中揮發(fā)性成分的差別 如表1和表2所示，發(fā)酵6 h的香腸中相對含量最多的是酯類物質(zhì)，其后依次是醇類、酸類、醛類、烷烴、酮類，而發(fā)酵9 h香腸中相對含量最多的為醇類(主要是乙醇)、其次為酮類、酯類、烷烴類、酸類、醛類。

發(fā)酵6 h的發(fā)酵香腸中鑒定出的揮發(fā)性風(fēng)味成分有54種，主要包括烷烴類物質(zhì)5種，醛類2種、酯類19種，酮類4種、醇類9種、酸類4種、以及相對峰面積合計達(dá)43.39%的11種其他類別的化合物(包括胺類、萜烯類、含硫化合物、苯酚類及醚類物質(zhì))，在發(fā)酵香腸中，脂環(huán)化合物具有濃郁的肉香味[10-12]；其次是酯類物質(zhì)，共19種，占總揮發(fā)性風(fēng)味含量18.90%。酯類可能來源于脂質(zhì)、蛋白質(zhì)分解氧化反應(yīng)及其 Strecker 降解和 Maillard反應(yīng)[13]，此外也可能源自乳酸菌和酵母菌的發(fā)酵。含硫化合物2-苯胺基苯硫酚可能是硫胺素降解或者一些含硫氨基酸如蛋氨酸、半胱氨酸、胱氨酸產(chǎn)生[14]，其閾值較低但含量不高。

與發(fā)酵6 h相比，發(fā)酵9 h的發(fā)酵香腸中的香氣成分存在明顯的差別，測定出的揮發(fā)性風(fēng)味成分種類數(shù)目大幅減少，共20種，其中，相較發(fā)酵6 h的香腸而言，酯類香氣成分種類數(shù)大幅減少，從發(fā)酵6 h時的18種減至2種，僅為總含量的4.52%；醇類物質(zhì)含量發(fā)酵到9 h,其種類數(shù)從9種降到了4種，相對含量卻增加到了74.37%。醇類物質(zhì)的相對含量增加主要是由于酵母的發(fā)酵導(dǎo)致乙醇含量大幅增加，而種類數(shù)的減少則可能由于發(fā)生酯化反應(yīng)或氧化反應(yīng)[15]，導(dǎo)致其他醇類相對含量降低，在分析過程中被其他物質(zhì)所掩蓋而未被檢測到。相對含量過高的乙醇還可能是導(dǎo)致發(fā)酵9 h香腸中揮發(fā)性物質(zhì)被檢出種類大幅減少的關(guān)鍵原因。

表1 2種香腸的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及其相對含量

表2 兩種香腸中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的差別

(1) 酯類：發(fā)酵6 h的香腸中含有較為豐富的酯類物質(zhì)，共計檢出19種之多，與目前有關(guān)于發(fā)酵香腸的研究[10-14]差異極大，可能是由于發(fā)酵以及干燥的時間不同所導(dǎo)致的。本試驗中發(fā)酵9 h的香腸中也只檢出6-己內(nèi)酯和己二酸雙2-丁氧基乙酯2種脂類化合物。酯類多具有花香和水果香，對風(fēng)味具有特殊的貢獻。有研究[16]表明，腌制火腿的特征風(fēng)味與乙酯類物質(zhì)(尤其是帶甲基支鏈的短鏈酯)有關(guān)。發(fā)酵6 h的香腸中己二酸二丁氧基乙酯在香腸中的相對峰面積最高，達(dá)到了4.16%。此外，在發(fā)酵6 h的香腸中，還檢測出了6-己內(nèi)酯、1,5-辛內(nèi)酯、硬脂酸異丙內(nèi)酯，其相對峰面積達(dá)到了0.65%。內(nèi)酯類化合物對許多食品賦予了桃子、椰子等果香味，甚至在稀釋之后還會散發(fā)出另一種水果的香味[17]。在酯類物質(zhì)的種類和相對峰面積上，6 h的發(fā)酵香腸具有明顯的優(yōu)勢。

(2) 醇類：醇類主源于糖類的微生物發(fā)酵代謝及脂肪的氧化，香腸發(fā)酵過程中產(chǎn)生的脂肪酶對這一過程影響顯著，從而影響產(chǎn)品的最終風(fēng)味[18-19]。發(fā)酵6 h的香腸中醇類物質(zhì)的種類更為豐富，發(fā)酵9 h后的香腸則在相對峰面積上高得多，且主要是以乙醇的形式存在。醇類物質(zhì)中的芳香醇也可能來自天然香辛料。發(fā)酵6 h的香腸中檢出松油醇、薄荷醇和(+)-雪松醇，芳香醇類揮發(fā)性物質(zhì)的閾值通常較低，即較低的含量便能表現(xiàn)出較強的風(fēng)味特征，因此這些物質(zhì)在風(fēng)味構(gòu)成中的作用也不容忽視；脂肪醇主要有芳樟醇(具檸檬香味，又具有濃青帶甜的木青氣息，似玫瑰木香氣，更似剛出爐的綠茶青香，既有紫丁香、鈴蘭香與玫瑰的花香，又有木香、果香氣息)、法尼醇和三甲基戊醇等，脂肪醇揮發(fā)性相對較弱。發(fā)酵9 h后的香腸乙醇占了70.92%，同時檢出了4-庚醇及2,5-二甲基-3,4-己烷二醇(發(fā)酵6 h香腸中未檢出)。大多數(shù)醇類物質(zhì)閾值較高，但具有甜香味，并且對醛類、酯類物質(zhì)產(chǎn)生是必不可少的，對香腸整體風(fēng)味具有改善作用。

(3) 酸類：酸類物質(zhì)對酯類物質(zhì)的生成至關(guān)重要，另外，產(chǎn)品的風(fēng)味復(fù)雜性及獨有的感官風(fēng)味特點也離不開酸類物質(zhì)。發(fā)酵9 h的香腸的種類和數(shù)目較發(fā)酵6 h的香腸有一定的差異。兩組中均檢出共同成分棕櫚酸和乙酸，但發(fā)酵6 h香腸中還檢出肉豆蔻酸、硬脂酸，而發(fā)酵9 h 香腸中則還檢出酮丙二酸。

(4)酮類和醛類：酮類物質(zhì)一般由美拉德反應(yīng)產(chǎn)生，酮類物質(zhì)風(fēng)味成分一般呈奶油味[20]，并且閾值較低，是重要的香氣成分[21]。發(fā)酵6 h和發(fā)酵9 h腸中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)3-羥基-2-丁酮，其相對峰面積分別為4.32%和6.89%，發(fā)酵6 h腸中還檢測到一定的4-辛酮、4-丁基-2-氧雜卓酮、2-十九烷酮。酮類物質(zhì)是醇的氧化產(chǎn)物或酯類分解產(chǎn)物，2種腸中酮類物質(zhì)的差異可能與酯類物質(zhì)的含量有關(guān)。

值得一提的是，醛類化合物在兩種腸中種類都較少，發(fā)酵6 h的香腸中檢出壬醛和枯茗醛，其相對含量為1.89%，發(fā)酵9 h香腸中僅檢出相對含量為0.22%的壬醛。壬醛呈青草和生脂肪味，枯茗醛呈青草香和藥草香[22]。

(5) 其他化合物：發(fā)酵6 h和9 h腸中均檢出5種烴類物質(zhì)，含兩種共同成分。烴類化合物通常都具有高芳香閾值，對于香腸的整體風(fēng)味貢獻不大。

其他類型的揮發(fā)性物質(zhì)主要包括胺類5種、萜烯類3種、醚類3種、苯酚類2種。

香腸中的萜烯類物質(zhì)主要來源于添加的香辛料，萜烯類物質(zhì)通常為強呈昧的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，具有一定的香辣味，在食品調(diào)味料中有廣泛的應(yīng)用。在本試驗的腌制過程中，添加了白胡椒粉、五香粉、姜粉等香辛料，在6 h 發(fā)酵腸中檢測到了角鯊烯、8-甲基-1-癸烯和2,6-二甲基庚-1,5-二烯，其相對含量占總揮發(fā)性物質(zhì)0.64%，但9 h發(fā)酵腸中并未檢測到，可能與這類物質(zhì)較強的揮發(fā)性有關(guān)，這與張春暉的研究結(jié)果很類似[23]。

醚類中檢出的茴香腦也可能來源于添加的香料，具有八角茴香經(jīng)典氣味。

發(fā)酵6 h未檢測出苯酚類物質(zhì)，而發(fā)酵9 h檢出2-苯胺基苯硫酚、4-仲丁基-2,6-二叔丁基苯酚，占總揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)0.28%，與一些發(fā)酵香腸研究不同的是，本試驗中苯酚類物質(zhì)含量較低，主要是由于未采用煙熏工藝，少量的苯酚可能來源于苯甲醛和苯丙氨酸在微生物作用下的分解[24]。

風(fēng)味物質(zhì)的鑒定離不開人體嗅覺的感官分析，但使用儀器分析來檢測風(fēng)味成分也非常重要[25]。試驗中發(fā)現(xiàn)發(fā)酵6 h的香腸在口感及風(fēng)味上更為濃郁香醇，其感官評價得分值達(dá)81.2分；發(fā)酵9 h的香腸的口感及風(fēng)味稍差，其感官評價得分值為79分，這種口感和風(fēng)味上的差異利用HS-SPME-GC-MS技術(shù)分析得到了驗證。

3 結(jié)論

(1) 利用單因素分析方法，分析了取樣量、萃取時間、萃取溫度3個因素對萃取效果的影響，優(yōu)化了SPME的萃取條件，即樣品質(zhì)量為3.0 g、萃取時間為50 min，萃取溫度為60 ℃。

(2) 在優(yōu)化的萃取條件下，利用HS-SPME-GC-MS技術(shù)分析比較了發(fā)酵6 h和9 h香腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的差異。發(fā)酵6 h的發(fā)酵香腸中被鑒定出的揮發(fā)性風(fēng)味成分有54種，包括烷烴類物質(zhì)5種、酯類19種，酮類4種、醛類2種、醇類9種、酸類4種以及胺類、萜烯類、含硫化合物、苯酚類及醚類等其他類別的化合物11種；發(fā)酵9 h的發(fā)酵香腸中被鑒定出20種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中烷烴類5種、酯類2種、酮類1種、醛類1種、醇類4種、酸類3種及其他類化合物4種。各香氣成分中的相對含量也有明顯差異性。數(shù)據(jù)顯示，兩種香腸揮發(fā)性成分組成差異比較大，發(fā)酵6 h香腸在風(fēng)味成分的種類及成分上更具優(yōu)勢。

(3) 進一步的研究將針對不同益生菌菌種及不同菌種組合對發(fā)酵風(fēng)味的影響，確定對特征發(fā)酵風(fēng)味具有關(guān)鍵作用的主香成分，以及接種發(fā)酵香腸保藏過程中的風(fēng)味變化。