李慶崗，田廣友，吳義景，蘇世廣，許 娟

（1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽 合肥 230031；2.定遠(yuǎn)縣安康農(nóng)牧有限公司，滁州 233200）

CATSPER離子通道蛋白是由Ren等（2001）首次發(fā)現(xiàn)的[1]，后來發(fā)現(xiàn)這個離子通道是一種復(fù)雜的蛋白質(zhì)復(fù)合物，由至少6個亞單位，其中4個α亞單位（CATSPER 1-4）形成鈣選擇孔[2]，2個附加輔助子單元CATSPERB和CatSperG是跨膜蛋白，具有較大的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域[3]。人和小鼠的研究表明，CATSPER家族主要表達(dá)于睪丸組織[4]，而豬CATSPER1基因的表達(dá)不僅僅限于睪丸組織，在豬附睪、下丘腦、子宮頸和子宮角都有表達(dá)[5-6]，因此CATSPER1除了對雄性個體精子運(yùn)動和活力有關(guān)外[7]，可能對雌性的繁殖功能及生長性能有關(guān)。豬的CATSPER1基因位于2號染色體上，包含12個外顯子，共編碼722個氨基酸，本課題組在豬的重測序過程中發(fā)現(xiàn)該CATSPER1基因第一外顯子存在1個錯義突變，c.A779G（NM_001244257），該位點(diǎn)在 SNP 數(shù)據(jù)庫中的編號為rs324850126，可導(dǎo)致第227位氨基酸H突變?yōu)镽。因此，本研究以CATSPER1基因作為母豬繁殖性能的候選基因，研究定遠(yuǎn)豬母豬c.A779G位點(diǎn)多態(tài)性，并分析該位點(diǎn)多態(tài)性與初產(chǎn)母豬的產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)性，以期尋找影響產(chǎn)仔數(shù)的主效位點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

定遠(yuǎn)豬豬群飼養(yǎng)在定遠(yuǎn)縣安康農(nóng)牧有限公司，統(tǒng)計2018年5—12月期間264頭初產(chǎn)母豬的產(chǎn)仔數(shù)，并采集基礎(chǔ)群264頭母豬耳組織樣品，迅速放入裝有75%酒精的離心管中，送回實驗室，并冷凍保存，用于提取基因組DNA。基因型分析于2019年2—3月完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 采用苯酚－氯仿抽提法，TE溶解，-20℃冷凍保存。

1.2.2 引物設(shè)計合成 根據(jù)CATSPER1基因DNA序列，應(yīng)用Primer premier 5.0軟件在多態(tài)位點(diǎn)（rs324850126）兩側(cè)，設(shè)計一對引物，突變位點(diǎn)可用限制性內(nèi)切酶HhaI識別，由于該突變位點(diǎn)下游15 bp處仍有2個酶切位點(diǎn)，因此將下游引物進(jìn)行了兩處編輯（引物CATSPER1-R第15堿基由G改為T，第30位G堿基改為A），使HhaI只有突變位點(diǎn)一個識別位點(diǎn)，并在5'端增加了7個A，引物序列見表1。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 CATSPER1基因引物序列

1.2.3 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系均為（20 μL）：2×PCR Mix 10 μL，上游引物和下游引物各 0.5 μL，DNA模板 1 μL，加dd H2O至20 μL。PCR反應(yīng)條件為：變性和延伸溫度分別為95℃和72℃；退火溫度為59℃，變性、退火、延伸時間均為30 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。

1.2.4 限制性內(nèi)切酶酶切（RFLP） CATSPER1基因可用限制性內(nèi)切酶HhaI進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)體系均為 10 μL，其中內(nèi)切酶 0.3 μL（3 U），10×Buffer 1 μL，PCR產(chǎn)物5 μL，加dd H2O至10 μL。反應(yīng)溫度均為37℃，酶切過夜。

1.2.5 統(tǒng)計分析

（1）基因效應(yīng)估計如下[8]。

顯性效應(yīng)：d=AG-（AA+GG）/2；加性效應(yīng)：a=（AA-GG）/2；顯性度：D=d/a。

A 等位基因的平均效應(yīng)：α1=q[a+d（q-p）]；G 等位基因的平均效應(yīng)：α2=-p[a+d（q-p）]。

A等位基因替代G等位基因的平均效應(yīng)值α=α1-α2=a+d（q-p）。

以上各式中，p為A等位基因頻率，q為G等位基因頻率，AA、AG、GG為各基因型對應(yīng)性狀的最小二乘均值。

（2）模型構(gòu)建。

用于基因型效應(yīng)分析的母豬初產(chǎn)繁殖性狀包括總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)，采用PASW Statistics 18軟件中的一般線性模型（GLM）對CATSPER1基因多態(tài)性與部分繁殖性狀的相關(guān)性進(jìn)行最小二乘分析，所用模型如下：

其中Y為性狀觀察值（總產(chǎn)仔數(shù)或產(chǎn)活仔數(shù)）；μ為群體均值；C為CATSPER1基因型效應(yīng)；E為隨機(jī)殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CATSPER1基因PCR擴(kuò)增

CATSPER1基因PCR擴(kuò)增見圖1，PCR擴(kuò)增后為226 bp單一條帶，無雜帶，可用于RFLP酶切。

圖1 CATSPER1基因PCR擴(kuò)增電泳

2.2 CATSPER1基因型判斷

CATSPER1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)HhaI限制性內(nèi)切酶酶切后1.5%瓊脂糖凝膠電泳，見圖2，第1道為DL 2 000 Marker，酶切后會出現(xiàn)3條帶，分別為226 bp、181 bp和45 bp，由于45 bp條帶太短，無法通過瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測，因此利用226 bp和181 bp兩條帶即可判斷基因型。含有226 bp條帶的個體為AA型，如圖2中第13泳道；含有181 bp和45 bp（圖中未顯示）的個體為 GG型，如圖2中2、3、5、6、10、11、12 泳道；同時出現(xiàn) 226 bp、181 bp 和 45 bp條帶的個體為AG型，如圖2中第4、7、8、9泳道。

圖2 CATSPER1基因HhaI酶切電泳

2.3 CATSPER1在定遠(yuǎn)豬中的基因型和等位基因頻率

CATSPER1基因在定遠(yuǎn)豬中的等位基因和基因型頻率分布情況見表2。由表2可知，CATSPER1基因A 和 G 的等位基因頻率分別為 0.166 7、0.833 3，3 種基因型AA、AG和GG的檢測頻率分別為0.030 3、0.272 7 和 0.697 0，而它們的期望頻率分別為 0.027 8、0.277 8和0.694 4，基因型頻率檢測值和期望值經(jīng)χ2適合性檢驗，差異不顯著（P＞0.05），表明 CATSPER1基因在該群體中分布處于哈德-溫伯格平衡狀態(tài)。

表2 定遠(yuǎn)豬CATSPER1基因頻率及基因型頻率分布

2.4 CATSPER1對定遠(yuǎn)豬初產(chǎn)繁殖性狀的效應(yīng)分析

CATSPER1基因的AA型比AG、GG型個體的初產(chǎn)總產(chǎn)仔數(shù)分別高1.74、2.08頭，均差異極顯著（P＜0.01），AG 型個體總產(chǎn)仔數(shù)高于 GG 型個體，但差異不顯著（P＞0.05）；AA 型個體初產(chǎn)活仔數(shù)比 AG、GG型個體分別高 1.61、1.66頭，均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），而 AG 和 GG 型個體間差異不顯著（P＞0.05），詳見表3。CATSPER1基因?qū)偖a(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)表現(xiàn)出負(fù)的顯性效應(yīng)和正的加性效應(yīng)；等位基因A對總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)具有正效應(yīng)，分別為0.478和0.258；等位基因G對總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)具有負(fù)效應(yīng)，分別為-0.096 和-0.052；該基因座上基因型對總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)的加性效應(yīng)值分別為0.573和0.310，因此選擇AA基因型個體的留種可提高群體的總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)，等位基因A為該群體的優(yōu)良等位基因。

表3 CATSPER1基因多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)及基因效應(yīng)分析

3 討論

定遠(yuǎn)豬是中國江淮流域優(yōu)良的豬種之一，由于其生長速度慢、瘦肉率低、飼料報酬低，導(dǎo)致社會飼養(yǎng)量銳減。近幾年，定遠(yuǎn)豬不斷進(jìn)行產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新模式的探索，形成了規(guī)?；B(yǎng)殖和產(chǎn)業(yè)開發(fā)相結(jié)合，形成了從原種、祖代和父母代的繁育體系。繁殖性能好一直以來都是我國地方品種的優(yōu)良特性，定遠(yuǎn)豬初產(chǎn)總產(chǎn)仔數(shù) 10.9～11.3 頭，初產(chǎn)活仔數(shù)為 10.4～10.7頭[8-9]，而本研究中統(tǒng)計分析了264窩未經(jīng)選育的初產(chǎn)定遠(yuǎn)豬產(chǎn)仔情況，發(fā)現(xiàn)初產(chǎn)總產(chǎn)仔數(shù)為10.45頭，產(chǎn)活仔數(shù)僅為9.65頭。產(chǎn)仔數(shù)性狀是微效多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，遺傳力低，通過表型選育，進(jìn)展緩慢，因此開發(fā)更多的分子標(biāo)記，根據(jù)標(biāo)記進(jìn)行選擇顯得尤為重要。CATSPER1基因是一種鈣離子通道蛋白，不僅表達(dá)于公豬睪丸組織中，在下丘腦和母豬子宮頸、子宮角中也有表達(dá)，因此推廣與母豬的繁殖性能可能存在一定的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)c.A779G位點(diǎn)在定遠(yuǎn)豬群體中存在多態(tài)性，并處于哈德-溫伯格平衡狀態(tài)，說明該群體對該位點(diǎn)未進(jìn)行選擇。多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)間的相關(guān)分析表示，AA型個體總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)最高，AG型次之，GG型個體最少。AA型總產(chǎn)仔數(shù)均極顯著高于AG和GG型（P＜0.01），AG和GG型個體間差異不顯著（P＞0.05）；AA型產(chǎn)活仔數(shù)均顯著高于 AG 和 GG 型（P＜0.05），AG 和GG型間差異不顯著（P＞0.05）。等位基因A對定遠(yuǎn)豬總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)具有正效應(yīng)，等位基因A替代G的效應(yīng)值分別為0.573和0.310，因此等位基因A是定遠(yuǎn)豬的優(yōu)良等位基因，AA型是定遠(yuǎn)豬的優(yōu)良基因型。選擇AA型個體留種可提高群體的產(chǎn)仔數(shù)，在今后選育中可適當(dāng)提高等位基因A的頻率。