李慶崗,田廣友,吳義景,蘇世廣,許 娟
(1.安徽省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所,安徽 合肥 230031;2.定遠縣安康農牧有限公司,滁州 233200)
CATSPER離子通道蛋白是由Ren等(2001)首次發(fā)現(xiàn)的[1],后來發(fā)現(xiàn)這個離子通道是一種復雜的蛋白質復合物,由至少6個亞單位,其中4個α亞單位(CATSPER 1-4)形成鈣選擇孔[2],2個附加輔助子單元CATSPERB和CatSperG是跨膜蛋白,具有較大的細胞外結構域[3]。人和小鼠的研究表明,CATSPER家族主要表達于睪丸組織[4],而豬CATSPER1基因的表達不僅僅限于睪丸組織,在豬附睪、下丘腦、子宮頸和子宮角都有表達[5-6],因此CATSPER1除了對雄性個體精子運動和活力有關外[7],可能對雌性的繁殖功能及生長性能有關。豬的CATSPER1基因位于2號染色體上,包含12個外顯子,共編碼722個氨基酸,本課題組在豬的重測序過程中發(fā)現(xiàn)該CATSPER1基因第一外顯子存在1個錯義突變,c.A779G(NM_001244257),該位點在 SNP 數據庫中的編號為rs324850126,可導致第227位氨基酸H突變?yōu)镽。因此,本研究以CATSPER1基因作為母豬繁殖性能的候選基因,研究定遠豬母豬c.A779G位點多態(tài)性,并分析該位點多態(tài)性與初產母豬的產仔數相關性,以期尋找影響產仔數的主效位點。
定遠豬豬群飼養(yǎng)在定遠縣安康農牧有限公司,統(tǒng)計2018年5—12月期間264頭初產母豬的產仔數,并采集基礎群264頭母豬耳組織樣品,迅速放入裝有75%酒精的離心管中,送回實驗室,并冷凍保存,用于提取基因組DNA?;蛐头治鲇?019年2—3月完成。
1.2.1 DNA提取 采用苯酚-氯仿抽提法,TE溶解,-20℃冷凍保存。
1.2.2 引物設計合成 根據CATSPER1基因DNA序列,應用Primer premier 5.0軟件在多態(tài)位點(rs324850126)兩側,設計一對引物,突變位點可用限制性內切酶HhaI識別,由于該突變位點下游15 bp處仍有2個酶切位點,因此將下游引物進行了兩處編輯(引物CATSPER1-R第15堿基由G改為T,第30位G堿基改為A),使HhaI只有突變位點一個識別位點,并在5'端增加了7個A,引物序列見表1。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
表1 CATSPER1基因引物序列
1.2.3 PCR擴增 PCR反應體系均為(20 μL):2×PCR Mix 10 μL,上游引物和下游引物各 0.5 μL,DNA模板 1 μL,加dd H2O至20 μL。PCR反應條件為:變性和延伸溫度分別為95℃和72℃;退火溫度為59℃,變性、退火、延伸時間均為30 s,35個循環(huán);最后72℃延伸5 min。
1.2.4 限制性內切酶酶切(RFLP) CATSPER1基因可用限制性內切酶HhaI進行酶切。酶切反應體系均為 10 μL,其中內切酶 0.3 μL(3 U),10×Buffer 1 μL,PCR產物5 μL,加dd H2O至10 μL。反應溫度均為37℃,酶切過夜。
1.2.5 統(tǒng)計分析
(1)基因效應估計如下[8]。
顯性效應:d=AG-(AA+GG)/2;加性效應:a=(AA-GG)/2;顯性度:D=d/a。
A 等位基因的平均效應:α1=q[a+d(q-p)];G 等位基因的平均效應:α2=-p[a+d(q-p)]。
A等位基因替代G等位基因的平均效應值α=α1-α2=a+d(q-p)。
以上各式中,p為A等位基因頻率,q為G等位基因頻率,AA、AG、GG為各基因型對應性狀的最小二乘均值。
(2)模型構建。
用于基因型效應分析的母豬初產繁殖性狀包括總產仔數、產活仔數,采用PASW Statistics 18軟件中的一般線性模型(GLM)對CATSPER1基因多態(tài)性與部分繁殖性狀的相關性進行最小二乘分析,所用模型如下:
其中Y為性狀觀察值(總產仔數或產活仔數);μ為群體均值;C為CATSPER1基因型效應;E為隨機殘差效應。
CATSPER1基因PCR擴增見圖1,PCR擴增后為226 bp單一條帶,無雜帶,可用于RFLP酶切。
圖1 CATSPER1基因PCR擴增電泳
CATSPER1基因PCR擴增產物經HhaI限制性內切酶酶切后1.5%瓊脂糖凝膠電泳,見圖2,第1道為DL 2 000 Marker,酶切后會出現(xiàn)3條帶,分別為226 bp、181 bp和45 bp,由于45 bp條帶太短,無法通過瓊脂糖凝膠進行檢測,因此利用226 bp和181 bp兩條帶即可判斷基因型。含有226 bp條帶的個體為AA型,如圖2中第13泳道;含有181 bp和45 bp(圖中未顯示)的個體為 GG型,如圖2中2、3、5、6、10、11、12 泳道;同時出現(xiàn) 226 bp、181 bp 和 45 bp條帶的個體為AG型,如圖2中第4、7、8、9泳道。
圖2 CATSPER1基因HhaI酶切電泳
CATSPER1基因在定遠豬中的等位基因和基因型頻率分布情況見表2。由表2可知,CATSPER1基因A 和 G 的等位基因頻率分別為 0.166 7、0.833 3,3 種基因型AA、AG和GG的檢測頻率分別為0.030 3、0.272 7 和 0.697 0,而它們的期望頻率分別為 0.027 8、0.277 8和0.694 4,基因型頻率檢測值和期望值經χ2適合性檢驗,差異不顯著(P>0.05),表明 CATSPER1基因在該群體中分布處于哈德-溫伯格平衡狀態(tài)。
表2 定遠豬CATSPER1基因頻率及基因型頻率分布
CATSPER1基因的AA型比AG、GG型個體的初產總產仔數分別高1.74、2.08頭,均差異極顯著(P<0.01),AG 型個體總產仔數高于 GG 型個體,但差異不顯著(P>0.05);AA 型個體初產活仔數比 AG、GG型個體分別高 1.61、1.66頭,均達到顯著水平(P<0.05),而 AG 和 GG 型個體間差異不顯著(P>0.05),詳見表3。CATSPER1基因對總產仔數、產活仔數表現(xiàn)出負的顯性效應和正的加性效應;等位基因A對總產仔數、產活仔數具有正效應,分別為0.478和0.258;等位基因G對總產仔數和產活仔數具有負效應,分別為-0.096 和-0.052;該基因座上基因型對總產仔數和產活仔數的加性效應值分別為0.573和0.310,因此選擇AA基因型個體的留種可提高群體的總產仔數和產活仔數,等位基因A為該群體的優(yōu)良等位基因。
表3 CATSPER1基因多態(tài)性與產仔數相關及基因效應分析
定遠豬是中國江淮流域優(yōu)良的豬種之一,由于其生長速度慢、瘦肉率低、飼料報酬低,導致社會飼養(yǎng)量銳減。近幾年,定遠豬不斷進行產業(yè)創(chuàng)新模式的探索,形成了規(guī)模化養(yǎng)殖和產業(yè)開發(fā)相結合,形成了從原種、祖代和父母代的繁育體系。繁殖性能好一直以來都是我國地方品種的優(yōu)良特性,定遠豬初產總產仔數 10.9~11.3 頭,初產活仔數為 10.4~10.7頭[8-9],而本研究中統(tǒng)計分析了264窩未經選育的初產定遠豬產仔情況,發(fā)現(xiàn)初產總產仔數為10.45頭,產活仔數僅為9.65頭。產仔數性狀是微效多基因控制的復雜數量性狀,遺傳力低,通過表型選育,進展緩慢,因此開發(fā)更多的分子標記,根據標記進行選擇顯得尤為重要。CATSPER1基因是一種鈣離子通道蛋白,不僅表達于公豬睪丸組織中,在下丘腦和母豬子宮頸、子宮角中也有表達,因此推廣與母豬的繁殖性能可能存在一定的關系。本研究發(fā)現(xiàn)c.A779G位點在定遠豬群體中存在多態(tài)性,并處于哈德-溫伯格平衡狀態(tài),說明該群體對該位點未進行選擇。多態(tài)性與產仔數間的相關分析表示,AA型個體總產仔數和產活仔數最高,AG型次之,GG型個體最少。AA型總產仔數均極顯著高于AG和GG型(P<0.01),AG和GG型個體間差異不顯著(P>0.05);AA型產活仔數均顯著高于 AG 和 GG 型(P<0.05),AG 和GG型間差異不顯著(P>0.05)。等位基因A對定遠豬總產仔數、產活仔數具有正效應,等位基因A替代G的效應值分別為0.573和0.310,因此等位基因A是定遠豬的優(yōu)良等位基因,AA型是定遠豬的優(yōu)良基因型。選擇AA型個體留種可提高群體的產仔數,在今后選育中可適當提高等位基因A的頻率。