李柯楠 劉會勤 叢 寧 周 梁 張 明△

(1復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科, 2 耳鼻喉科研究院 上海 200031)

PI3K/Akt/mTOR信號通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。其在多種惡性腫瘤細胞中過度活化后可抑制細胞凋亡,促進細胞周期進展,從而促進細胞的生存和增殖,同時參與血管形成,在腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[1-2]。因此,以該信號途徑為靶點的藥物開發(fā)已成為腫瘤治療的研究熱點之一。一方面抑制PI3K通路可以使細胞周期阻滯,抑制細胞生長,另一方面抑制mTOR可誘導自噬而使腫瘤細胞失活,所以單靶點的PI3K/mTOR抑制劑在促進細胞凋亡的同時,可以誘導細胞自噬,從而干擾腫瘤細胞活性,腫瘤細胞得以繼續(xù)存活,抗腫瘤作用有限[3]。PI-103作為一種新型的PI3K /mTOR雙靶點抑制劑,能特異性抑制PI3K及mTOR的活性,從而抑制腫瘤細胞的增殖,在某些類型的腫瘤體內(nèi)外研究中均表現(xiàn)出強效的抗瘤能力及低細胞毒性[4]。

目前,PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制劑作用于喉鱗癌細胞的研究甚少。我們擬通過研究PI3K/mTOR雙靶點抑制劑PI-103對喉鱗癌細胞周期、凋亡、遷移及侵襲能力的影響,探討PI3K/mTOR雙靶點抑制劑用于喉鱗癌臨床治療的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

試劑 喉鱗癌細胞株Hep-2由復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院細胞庫提供,細胞株AMC-HN-8由韓國Ulsan大學醫(yī)學院饋贈。LY294002、Rapamycin、PI-103(美國 Selleck公司);兔抗人Caspase-8、9、3,Cyclin D1,Cyclin E1,p-AKT、AKT、p-4EBP1、4EBP1單克隆抗體(美國Neomarkers公司);兔抗人active Caspase3 (美國Abcam公司);鼠抗人GAPDH 抗體、HRP標記羊抗兔 IgG、HRP標記羊抗鼠IgG(美國Santa Cruze公司);Annexin V-FITC試劑盒(美國Invitrogen公司);ECL試劑盒(美國 Millipore公司);Transwell小室(美國Corning公司);Matrigel(美國BD公司)。

流式細胞術檢測Hep-2及AMC-HN-8細胞周期 收集對數(shù)生長期的Hep-2細胞和AMC-HN-8細胞,調(diào)整細胞濃度為5×105/mL,設空白對照組和給藥組:15 μmol/L LY294002、50 nmol/L Rapamycin、4 μmol/L PI-103。細胞培養(yǎng)48 h后取1×106個細胞,300×g離心5 min后PBS清洗,加入75%冰乙醇5 mL混勻固定,-20 ℃靜置24 h,再300×g離心10 min棄去乙醇,用PBS清洗,取1 mL PBS重懸細胞加入RNase 5 μL (10 mg/mL),37 ℃溫浴1 h,加入PI (10 mg/mL)染液5 μL,室溫避光染色30 min后用流式細胞儀檢測。

流式細胞術檢測Hep-2及AMC-HN-8細胞凋亡 按Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒步驟操作,細胞處理方式同上。取1×106個細胞移入離心管,300×g離心5 min后,棄上清,加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞。加入5 μL Annexin V-FITC,輕輕混勻,室溫避光孵育10 min。300×g離心5 min,棄上清,加入190 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液再重懸細胞,加入10 μL PI 染色液混勻,冰浴避光靜置,流式細胞儀檢測。

CCK-8檢測細胞增殖-毒性試驗 收集對數(shù)生長期的Hep-2和AMC-HN-8細胞,調(diào)整細胞濃度為5×105/mL,100 μL/孔在96孔板中接種細胞懸液,設陰性對照組(無細胞僅培養(yǎng)液)、空白對照組和給藥組各3個復孔:15 μmol/L LY294002、50 nmol/L Rapamycin、4 μmol/L PI-103,培養(yǎng)箱內(nèi)孵育,分別在8 h、12 h、24 h、36 h和48 h加入10 μL CCK-8溶液,培養(yǎng)箱孵育2 h,酶標儀測定450 nm處的吸光度。

Transwell檢測腫瘤細胞遷移能力 根據(jù)CCK-8細胞增殖-毒性試驗,在36 h以上藥物對細胞數(shù)量影響較大,而24 h內(nèi)藥物組與對照組無明顯差異,故定于20 h內(nèi)行遷移試驗。收集對數(shù)生長期細胞,調(diào)整細胞懸液濃度為5×105/mL。Transwell chamber置于37 ℃溫育。在下室(即24孔板底部)加入600 μL含20%血清的培養(yǎng)基,上室加入150 μL細胞懸液,設陰性對照組(無細胞僅培養(yǎng)液)、空白對照組和給藥組各3個復孔:15 μmol/L LY294002、50 nmol/L Rapamycin、4 μmol/L PI-103,加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出chamber,吸干上室液體,甲醇室溫固定30 min,結(jié)晶紫染液室溫染色15～30 min,PBS沖洗,擦去上室底部膜表面上的細胞。倒置顯微鏡下取10個隨機視野計數(shù),統(tǒng)計結(jié)果。

Transwell檢測腫瘤細胞侵襲能力 在Transwell chamber上室底部中央垂直加入100 μL稀釋后的Matrigel,37 ℃溫育。收集對數(shù)生長期細胞,處理方法同遷移實驗,調(diào)整濃度為5×105/mL。在下室加入600 μL含20%血清的培養(yǎng)基,上室加入150 μL細胞懸液,為避免Matrigel膠對細胞遷移的限制,加藥后繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。取出chamber,吸干上室液體,甲醇室溫固定30 min,結(jié)晶紫室溫染色15～30 min,擦去Matrigel凝膠和聚碳酯膜上表面的細胞,小心揭下膜表面上的細胞,底面朝上晾干,移至載玻片上用中性樹脂封片。倒置顯微鏡下取10個隨機視野計數(shù),統(tǒng)計結(jié)果。

Western blot 檢測相關蛋白表達 取對數(shù)生長期Hep-2及AMC-HN-8細胞,處理方法同流式細胞術測細胞周期。細胞裂解,抽提蛋白質(zhì),定量,準備樣品液,進行SDS-PAGE;蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜,封閉后與一抗結(jié)合(兔抗人Caspase-8、Caspase-9、actived Caspase-3、Cyclin D1、Cyclin E1、p-AKT、AKT、p-4EBP1、4EBP1單克隆抗體、鼠抗人GAPDH抗體均按1∶1 000的比例稀釋),洗膜后加入二抗抗體(HRP標記羊抗兔及羊抗鼠IgG二抗均按1∶5 000的比例稀釋),ECL發(fā)光試劑顯色定影,自動凝膠成像分析系統(tǒng)對蛋白質(zhì)條帶掃描定量。

結(jié) 果

PI3K/mTOR信號通路抑制劑阻滯喉鱗癌細胞細胞周期 與對照組相比,分別經(jīng)PI3K/mTOR通路抑制劑LY294002、Rapamycin、PI-103處理的喉鱗癌細胞(Hep-2、AMC-HN-8),其細胞周期阻滯于S期,S期細胞百分含量明顯增多(Hep-2:34.82%±1.09%vs.59.15%±0.52%,54.63%±0.81%,66.56%±1.19%;AMC-HN-8:32.51%±0.66%vs.44.95%±1.24%,54.44%±1.55%,55.53%±0.93%),而G2期細胞百分含量明顯下降(Hep-2:11.44%±0.54%vs.3.92%±0.20%,4.58%±0.23%,1.12%±0.08%;AMC-HN-8:24.62%±1.15%vs.4.92%±0.19%,8.45%±0.83%,0.42%±0.06%),細胞分裂出現(xiàn)抑制,且雙靶點抑制劑PI-103的作用顯著高于單靶點抑制劑(LY294002、Rapamycin) (P<0.000 01,圖1 A、C)。

PI3K/mTOR信號通路抑制劑促進喉鱗癌細胞凋亡 與對照組相比,分別經(jīng)PI3K/mTOR通路抑制劑LY294002、Rapamycin、PI-103處理的喉鱗癌細胞(Hep-2、AMC-HN-8),其細胞凋亡率顯著上升(Hep-2:2.36%±0.96%vs.20.73%±2.54%,19.98%±1.33%,33.57%±1.49%;AMC-HN-8:1.53±0.83%vs. 16.62%±1.38%,18.38%±1.27%,32.56%±2.81%),且雙靶點抑制劑PI-103作用顯著高于單靶點抑制劑(LY294002、Rapamycin) (P<0.01,圖1B、D)。

阻斷PI3K/mTOR信號通路抑制喉鱗癌細胞的遷移能力 與對照組相比,分別經(jīng)PI3K/mTOR通路抑制劑LY294002、Rapamycin、PI-103處理的喉鱗癌細胞,其細胞遷移數(shù)顯著下降(Hep-2:199.6±6.45vs.125.2±26.65,111±3.062,29.07±8.637;AMC-HN-8:277.5±62.9vs. 92.73±1.157,110.7±4.1,75.4±7),且雙靶點抑制劑PI-103作用顯著高于單靶點抑制劑LY294002和Rapamycin (Hep-2:P<0.05;AMC-HN-8:P<0.001) (圖2)。

A:Increased Hep-2 and AMC-HN-8 cell apoptosis by inhibitors of PI3K/mTOR signal pathway.B:Arrested Hep-2 and AMC-HN-8 cell cycle by inhibitors of PI3K/mTOR signal pathway.C:The percentage of cell apoptosis.D:The G0/G1,S and G2/M percentage in cell cycle.(1)P<0.01;(2)P<0.001;(3)P<0.000 1;(4)P<0.000 01.

圖1 阻斷PI3K/mTOR信號通路能阻滯喉鱗癌細胞周期及促進凋亡
Fig 1 Laryngeal squamous carcinoma cell cycle was arrested and apoptosis was enhanced by inhibiting the PI3K/mTOR signal pathway

阻斷PI3K/mTOR信號通路抑制喉鱗癌細胞的侵襲能力 與對照組相比,分別經(jīng)PI3K/mTOR通路抑制劑LY294002、Rapamycin、PI-103處理的喉鱗癌AMC-HN8細胞,其細胞侵襲數(shù)顯著下降(Hep-2:915.5±148.1vs.558.2±23.5,387.6±16.75,146.6±39.7;AMC-HN-8:576.1±4.95vs.366.5±45.9,410.8±15.4,334.2±20.2554),且雙靶點抑制劑PI-103作用在Hep-2細胞顯著高于單靶點抑制劑LY294002和Rapamycin (P<0.001),在AMC-HN-8細胞侵襲數(shù)低于單靶點抑制劑,但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.8216,0.3049,圖2)。

(1)P<0.01;(2)P<0.001;(3)P<0.000 1.Crystal purple staining×100.

圖2 阻斷PI3K/mTOR信號通路能抑制喉鱗癌細胞遷移和侵襲
Fig 2 Inhibition of migration and invasion of laryngeal squamous carcinoma cell by inhibiting the PI3K/mTOR signal pathway

PI3K/mTOR信號通路抑制劑對喉鱗癌細胞細胞周期、凋亡及該通路相關蛋白質(zhì)水平的影響 雙靶點抑制劑PI-103能夠顯著抑制PI3K/mTOR信號通路蛋白質(zhì)的磷酸化,p-AKT和p-4E-BP1表達量顯著降低,從而抑制該通路的活性;能使凋亡相關蛋白Caspase9、Caspase3、Caspase8的水平顯著升高,而細胞周期相關蛋白Cyclin E1和 Cyclin D1水平顯著降低,且相較于單靶點抑制劑(LY294002、Rapamycin),PI-103作用更顯著(P<0.05,圖3A-C)。

討 論

喉癌是耳鼻咽喉頭頸外科第二高發(fā)的鱗狀細胞癌,喉癌的病理95%以上為鱗癌,且近20年來發(fā)病率有增高趨勢。呼吸、發(fā)音和吞咽保護是喉的主要生理功能,因此晚期喉癌患者的致殘率和致死率較高,盡管過去幾十年來治療方式有不斷改進,卻并未改善晚期喉癌患者的生存率[5]。如何提高喉癌患者的生存率和生存質(zhì)量,成為亟待解決的難題。

PI3K/Akt/mTOR通路是細胞蛋白質(zhì)合成調(diào)節(jié)的主要信號通路,參與細胞增殖、分化、遷移等調(diào)節(jié),研究發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤,包括在喉鱗癌中過度活化[6]。該信號通路活化可以抑制多種刺激誘發(fā)的細胞凋亡,促進細胞周期進展,參與腫瘤血管的形成、侵襲和轉(zhuǎn)移,已經(jīng)成為腫瘤干預治療的新靶點,靶向PI3K/Akt/mTOR信號通路的小分子藥物為腫瘤治療提供了新的方向。以往研究較多的是單靶點治療,如針對PI3K的抑制劑LY294002和mTOR的抑制分子Rapamycin,可抑制某些腫瘤細胞的生長、阻滯細胞周期以及降低腫瘤細胞的侵襲能力,但是信號通路中單靶點抑制導致的反饋激活限制了其總體抗瘤效果,難以實際應用于臨床[7]。PI-103是PI3K/mTOR雙靶點抑制劑,能特異性抑制PI3K及mTOR活性,并且不會通過信號反饋而激活Akt,抗瘤活性顯著優(yōu)于PI3K抑制劑LY294002及mTOR抑制劑Rapamycin,并且能夠增強腫瘤細胞的放療敏感性[8]。

(1)P<0.01;(2)P<0.001;(3)P<0.000 1;(4)P<0.000 01.

圖3 阻斷PI3K/mTOR信號通路和喉鱗癌細胞周期、凋亡及該通路相關蛋白質(zhì)水平
Fig 3 The protein levels of cell cycle,cell apoptosis and signal pathway by inhibiting the PI3K/mTOR signal pathway

本文通過對喉鱗癌細胞的研究發(fā)現(xiàn),PI-103能夠顯著降低p-AKT 和p-4EBP1的蛋白表達量,表明了其對PI3K/Akt/mTOR通路的有效抑制,并且作用顯著優(yōu)于單靶點抑制劑LY294002和Rapamycin。PI-103能將喉鱗癌細胞周期阻滯于S期,G2期百分含量較對照組顯著下降,顯著下調(diào)細胞周期蛋白Cyclin D1和Cyclin E1的表達,細胞分裂出現(xiàn)抑制,顯著促進喉鱗癌細胞的凋亡,凋亡相關蛋白質(zhì)Caspase 9、8、3水平升高,細胞凋亡率增加。通過細胞遷移和侵襲實驗發(fā)現(xiàn),PI-103能夠顯著抑制喉鱗癌細胞遷移和侵襲,并且以上作用均強于單靶點抑制劑。

綜上所述,雙靶點抑制劑PI-103能夠通過有效抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的活性,在體外阻滯喉鱗癌細胞周期阻滯,抑制細胞分裂,促進細胞凋亡,抑制細胞遷移和侵襲能力,且作用效果顯著優(yōu)于單靶點抑制劑LY294002和Rapamycin,為喉鱗癌進一步的體內(nèi)實驗以及未來的臨床應用提供了理論基礎。