藺 林 陳 崢 戴 飛 魏瑾瑾 湯欣玥

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院北院耳鼻咽喉頭頸外科 上海 201907)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是由變應(yīng)原誘導(dǎo)、免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)-E介導(dǎo)、Th2細(xì)胞促發(fā)的發(fā)生于鼻腔黏膜的變態(tài)反應(yīng)性炎癥。在AR發(fā)病的各種信號通路中,Th2細(xì)胞(適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵細(xì)胞)合成和釋放的Ⅱ型細(xì)胞因子白介素(interleukin,IL)-4、IL-5、IL-9和IL-13等起著樞紐的作用[1]。大量研究證實(shí),無論是適應(yīng)性免疫還是固有免疫,都在AR的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[2]。

固有淋巴樣細(xì)胞(innate lymphoid cells,ILCs)是固有免疫的關(guān)鍵細(xì)胞,nuocyte細(xì)胞屬于Ⅱ型(IL2Cs)中的一種。該細(xì)胞是在對小鼠寄生蟲免疫的研究中發(fā)現(xiàn)的。nuocyte細(xì)胞在IL-25和/或IL-33的作用下,可在小鼠寄生蟲模型的腸系膜淋巴結(jié)和脾臟中大量增殖,產(chǎn)生和釋放Ⅱ型細(xì)胞因子如IL-5、IL-13等,尤其是IL-13,也能產(chǎn)生少量IL-10[3]。隨后的研究發(fā)現(xiàn),nuocyte細(xì)胞在小鼠哮喘模型的肺組織中也出現(xiàn)增殖,并可以直接導(dǎo)致支氣管的高反應(yīng)性,其誘發(fā)機(jī)制主要是通過釋放大量IL-13而增加了支氣管黏膜的炎癥反應(yīng)所致[4]。IL-5可以趨化和激活嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil,Eos)[5],IL-13可以促進(jìn)杯狀細(xì)胞的增生和黏膜下腺體的分泌,還能誘發(fā)氣道的高反應(yīng)性[6]。

我們前期的研究顯示,nuocyte細(xì)胞在卵清蛋白(ovalbumin,OVA)誘導(dǎo)建立的AR小鼠模型的鼻相關(guān)淋巴組織(nasal-associated lymphoid tissue,NALT)中出現(xiàn)增殖,并發(fā)現(xiàn)將體外培養(yǎng)的OVA誘導(dǎo)NALT來源的nuocyte細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移給小鼠后,可以加劇AR小鼠鼻腔黏膜的變應(yīng)性炎癥[7],這種作用也是通過nuocyte細(xì)胞產(chǎn)生和釋放IL-5和IL-13而誘發(fā)的。目前大多數(shù)關(guān)于nuocyte細(xì)胞的研究重心都放在這兩種細(xì)胞因子上,而對于該細(xì)胞分泌的IL-10及其可能的作用研究甚少。本研究旨在探討體外小鼠nuocyte細(xì)胞中IL-13的干預(yù)對CD4+IL10+細(xì)胞分化的影響。

材 料 和 方 法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性BALB/c小鼠(SPF級)12只,6～8周齡,購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部代養(yǎng)。本研究獲得復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部動(dòng)物福利和倫理小組的批準(zhǔn)(倫理號:201808001Z)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為2組,每組6只。

動(dòng)物模型的建立 按照已經(jīng)出版的建模方法[8],以濃度為0.5 mg/mL的OVA(美國Sigma公司)和20 mg/mL的Al(OH)3生理鹽水溶液共0.2 mL對小鼠進(jìn)行腹腔注射致敏,致敏3次,每周1次(第1、8和15天),然后用濃度為40 mg/mL的OVA生理鹽水溶液0.02 mL滴入小鼠鼻孔進(jìn)行激惹,每天1次(第22天至29天),共8次,即為AR小鼠;對照組只用生理鹽水(正常組)(圖1)。打噴嚏和撓鼻次數(shù)在最后一次激惹結(jié)束后10 min進(jìn)行計(jì)數(shù)。

圖1 AR小鼠模型的建模步驟
Fig 1 Protocols of AR mice models

小鼠NALT和外周血單個(gè)核細(xì)胞的獲取 處死小鼠,去掉其前牙和面頰部肌肉,由硬腭后半部邊緣以細(xì)針頭小心獲取NALT組織,并將該組織放入添加了10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)基中,然后將其通過70 μm Falcon細(xì)胞篩網(wǎng)濾過,并用三羥甲基氨基甲烷-氯化銨緩沖液(0.83% NH4Cl和20 mmol/L Tris/Cl)裂解紅細(xì)胞;AR小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)的獲取采用常規(guī)摘除小鼠眼球法。

nuocyte細(xì)胞的獲取 NALT細(xì)胞懸液在4 ℃溫度和200×g離心10 min后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。根據(jù)多項(xiàng)相關(guān)研究所證實(shí)的nuocyte細(xì)胞膜表面分子表達(dá)的特點(diǎn)即CD3CD4CD8CD19CD11bCD11cFcεR1 (lineage)-ICOS+進(jìn)行設(shè)門,細(xì)胞用200 μL流式細(xì)胞液(1%牛血清白蛋白溶液和0.1% PBS溶液)洗滌,并與兔血清在室溫下共培養(yǎng)5 min以封閉Fcγ,然后再用流式細(xì)胞液洗滌3次,將細(xì)胞調(diào)成濃度為1×108/mL,分別用50 μL結(jié)合了熒光素異硫氰酸酯-葡聚糖的一抗(抗CD3、CD4、CD8、CD19、CD11b、CD11c、FcεR1的抗體,美國MyBioSource公司或美國BioLegend公司)在4 ℃溫度下染色30 min,隨后用結(jié)合了藻紅蛋白的單克隆抗體(抗ICOS的抗體,美國MyBioSource公司)再染。再次洗滌,并與結(jié)合了生物素的50 μL兔抗小鼠的二抗IgG共培養(yǎng),隨后加入50 μL結(jié)合了鏈霉親和素的藻紅蛋白(丹麥Dako公司),對照組只用與上述抗體同型的一抗染色。樣品用裝備了ACSDIVA 軟件系統(tǒng)(美國BD Biosciences公司)的LSR II型流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析,并用FlowJo version 10進(jìn)行數(shù)據(jù)輸出。

nuocyte細(xì)胞體外培養(yǎng)和rmIL-33干預(yù) nuocyte細(xì)胞分離、提純后調(diào)成6 × 107/mL濃度,并在含有10% FBS、1%青霉素/鏈霉素、0.1% β-巰基乙醇、10 ng/mL小鼠重組(recombinant,rm)IL-7(美國MyBioSource公司)和10 ng/mL小鼠rmIL-33(美國MyBioSource公司)的RPMI培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)6天。然后收集nuocyte細(xì)胞,重新加入100 ng/mL小鼠rmIL-33(美國MyBioSource公司)培養(yǎng)3天,ELISA法檢測細(xì)胞上清液中IL-13和IL-10的濃度。

IL-13 shRNA慢病毒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 IL-13 shRNA序列的選擇和含有該序列慢病毒的構(gòu)建均由生工生物工程(上海)股份有限公司提供,用293T細(xì)胞包裝慢病毒,以PANC細(xì)胞檢測慢病毒轉(zhuǎn)染效率,4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)作為核染色的空白對照,構(gòu)建完成后,將其以1× 109TU/mL的滴度加入nuocyte細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染,3天后,用ELISA法檢測培養(yǎng)基上清液中IL-13和IL-10的濃度。

具體方法分別按照小鼠IL-13和IL-10 ELISA試劑盒(美國MyBioSource公司)所規(guī)定的步驟進(jìn)行。

CD4+T細(xì)胞的獲取 小鼠CD4+T細(xì)胞的分離、提純按照相關(guān)試劑盒EasySepTMMouse CD4+T Cell Isolation Kit (加拿大STEMCELL公司)所規(guī)定的步驟進(jìn)行,該方法獲得的CD4+T細(xì)胞得率高、純度高,方便下一步實(shí)驗(yàn);將分選出的CD4+T細(xì)胞調(diào)成濃度5 × 105/mL并移入T細(xì)胞培養(yǎng)基(1640,10% FBS,1%青霉素-鏈霉素,50 μmol/L β-巰基乙醇,100 U/mL IL-2)中體外培養(yǎng)6天,然后把nuocyte細(xì)胞加入CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)基中,共培養(yǎng)3天,檢測CD4+IL10+細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比。

CD4+IL10+細(xì)胞的檢測 流式細(xì)胞儀檢測CD4+IL10+細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比,方法和步驟同上述“nuocyte細(xì)胞的獲取”,一抗分別用結(jié)合了FITC的抗CD4抗體和結(jié)合了PE的抗IL-10抗體,所得數(shù)據(jù)用FlowJo 10進(jìn)行分析。

結(jié) 果

AR小鼠模型的建立 小鼠采用經(jīng)典方式建模,OVA腹腔內(nèi)致敏,OVA及其佐劑鼻內(nèi)激惹(圖1)。末次激惹后10 min,分別計(jì)數(shù)小鼠打噴嚏和撓鼻次數(shù),發(fā)現(xiàn)AR組與正常組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,AR模型明顯超過正常小鼠(t=54.44,P<0.000 1;t=33.75,P<0.000 1)。提示AR小鼠模型建立成功。

nuocyte細(xì)胞的鑒定 建模后,用流式細(xì)胞儀設(shè)門技術(shù),分選、提純NALT中nuocyte細(xì)胞。nuocyte細(xì)胞被鑒定為CD3CD4CD8CD19CD11bCD11cFcεR1 (lineage)-ICOS+(圖2A和B),而且AR小鼠的nuocyte細(xì)胞數(shù)較正常小鼠顯著增多(圖2C)。

A:NALT nuocytes from normal mice;B:NALT nuocytes from AR mice;C:Comparison of nuocytes numbers in normal and AR mice.AR:Allergic rhinitis.

圖2 小鼠AR模型的NALT中nuocyte細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析
Fig 2 Flow cytometry analysis of NALT nuocytes from AR mice models

nuocyte細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率 IL-13 shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染nuocyte細(xì)胞的效率以分析綠色熒光蛋白在轉(zhuǎn)染的PANC細(xì)胞中的表達(dá)量來評估,感染復(fù)數(shù)設(shè)置為10,IL-13 shRNA的轉(zhuǎn)染率為98.28%;IL-13的轉(zhuǎn)錄抑制率以分析其mRNA在PANC細(xì)胞中的含量來評估,當(dāng)感染復(fù)數(shù)設(shè)置為10時(shí),IL-13 shRNA的抑制率為90.5%。nuocyte細(xì)胞的轉(zhuǎn)染定性評估見圖3A和3B。

A:Blank control,blue fluorescence indicated DAPI staining (× 400);B:Positive staining of nuocytes,green fluorescence indicated transfection of nuocytes by lentivirus with IL-13 shRNA (× 400).

圖3 IL-13 shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染nuocyte細(xì)胞
Fig 3 Transfection of nuocytes by lentivirus with IL-13 shRNA

nuocyte細(xì)胞對rmIL-33的反應(yīng) nuocyte細(xì)胞的特點(diǎn)是合成和釋放Ⅱ型細(xì)胞因子如IL-13,也可以釋放少量的抑制性細(xì)胞因子IL-10。為了檢測OVA誘導(dǎo)NALT來源的nuocyte細(xì)胞是否具有其相應(yīng)的功能,我們用ELISA法檢測體外培養(yǎng)的此種細(xì)胞是否分泌IL-13和IL-10,以及是否受IL-13 shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染前rmIL-33干預(yù)后體外培養(yǎng)的細(xì)胞大量釋放IL-13和IL-10,IL-13與IL-10濃度均顯著高于干預(yù)前,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=22.62、11.93,P均<0.000 1,圖4A、B)。這證明OVA誘導(dǎo)產(chǎn)生的nuocyte細(xì)胞具有其正常的功能。而轉(zhuǎn)染后,rmIL-33干預(yù)后體外培養(yǎng)的nuocyte細(xì)胞釋放IL-13沒有明顯升高,與干預(yù)前相比較,其濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4C)(t=1.67,P=0.14),而IL-10的濃度干預(yù)后顯著高于干預(yù)前(圖4D)(t=30.45,P<0.000 1)。轉(zhuǎn)染前IL-13的濃度明顯高于轉(zhuǎn)染后(圖4E)(t=22.54,P<0.000 1),IL-10的濃度明顯低于轉(zhuǎn)染后(圖4F)(t=9.29,P<0.000 1),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A:Concentration of IL-13 in the cultures before transfection;B:Concentration of IL-10 in the cultures before transfection;C:Concentration of IL-13 in the cultures after transfection;D:Concentration of IL-10 in the cultures after transfection;E:Comparison of concentration of IL-13 in the cultures before and after transfection;F:Comparison of concentration of IL-10 in the cultures before and after transfection.

圖4 轉(zhuǎn)染前后AR小鼠NALT來源的nuocyte細(xì)胞對rmIL-33干預(yù)后的反應(yīng)
Fig 4 Response of NALT-derived nuocytes to rmIL-33 before and after transfection

nuocyte細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞的誘導(dǎo) 為了證實(shí)nuocyte細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞的誘導(dǎo)作用及是否受IL-13 shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染的影響,我們將轉(zhuǎn)染前后NALT來源的該細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行體外共培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD4+IL10+細(xì)胞所占CD4+T細(xì)胞百分比發(fā)生變化(圖5A和5B),轉(zhuǎn)染后的nuocyte細(xì)胞共培養(yǎng)后,CD4+IL10+細(xì)胞百分比明顯升高(t=10.00,P< 0.0001)(圖5C)。這表明,nuocyte細(xì)胞受IL-13 shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染的影響,促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向CD4+IL10+細(xì)胞的分化。

A:Flow cytometry analysis of CD4+IL10+cells in the cocultures before transfection,Q2 area indicated CD4+IL10+cells;B:Flow cytometry analysis of CD4+IL10+cells in the cocultures after transfection;C:Comparison of percentage of CD4+IL10+cells in total CD4+T cells before and after transfection.

圖5 nuocyte細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞的誘導(dǎo)
Fig 5 Induction of CD4+IL10+cells from CD4+T cells by nuocytes

討 論

變態(tài)反應(yīng)性炎癥中適應(yīng)性免疫系統(tǒng)Th2細(xì)胞是Ⅱ型細(xì)胞因子如IL-4、IL-5、IL-9和IL-13的主要來源,但越來越多的研究證實(shí),固有免疫系統(tǒng)ILC2s也可以產(chǎn)生這類細(xì)胞因子,并誘發(fā)Eos局部的浸潤、肥大細(xì)胞的增殖、杯狀細(xì)胞的增生和分泌的病理改變[9]。還有研究表明,IL-13可直接導(dǎo)致呼吸道高反應(yīng),Th2細(xì)胞并非是該細(xì)胞因子的主要來源,ILC2s才是[10]。有學(xué)者按照ILC的特點(diǎn)和功能將其分為3型:ILC1s、ILC2s和ILC3s,每型都有相應(yīng)的細(xì)胞種類。nuocyte細(xì)胞屬于Ⅱ型;ILC2s還包括自然輔助細(xì)胞和固有輔助細(xì)胞Ⅱ型,雖然這些細(xì)胞種類不同,但它們共同的特點(diǎn)都是表達(dá)IL-25受體(IL-17BR)和IL-33受體(T1/ST2),均可在IL-25和IL-33的作用下產(chǎn)生炎癥介質(zhì)IL-5和IL-13[11]。變態(tài)反應(yīng)性炎癥狀態(tài)下,IL-25和IL-33主要由呼吸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生[12],雖然它們屬于不同的細(xì)胞因子家族,但卻具有上述類似的細(xì)胞反應(yīng)[13]。大量研究證實(shí),這兩種細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)Ⅱ型免疫反應(yīng),用IL-25和/或IL-33干預(yù)后,會(huì)產(chǎn)生大量Ⅱ型細(xì)胞因子如IL-5和IL-13,并導(dǎo)致局部相應(yīng)的病理改變[14-15]。

nuocyte細(xì)胞除了分泌Ⅱ型細(xì)胞因子促進(jìn)炎癥反應(yīng)外,也可以產(chǎn)生和釋放少量IL-10。目前關(guān)于nuocyte細(xì)胞的研究重心大都放在IL-5和IL-13兩種細(xì)胞因子上,而對于該細(xì)胞分泌的IL-10及其可能的作用研究甚少。但該細(xì)胞既然釋放IL-10,可能就會(huì)有相應(yīng)的功能,而IL-10又有誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向CD4+IL10+細(xì)胞分化的作用,因此我們課題組假設(shè)nuocyte細(xì)胞來源的IL-10可能會(huì)影響T輔助細(xì)胞向CD4+IL10+細(xì)胞的分化。本研究即是初步探討體外小鼠nuocyte細(xì)胞中IL-13的干預(yù)是否會(huì)影響IL-10的產(chǎn)生和釋放,并進(jìn)一步探討后者對CD4+T細(xì)胞向CD4+IL10+細(xì)胞分化可能造成的影響。

本研究中,用OVA建模后,小鼠打噴嚏和撓鼻次數(shù)明顯增加,說明AR小鼠模型建立成功。我們選擇AR小鼠NALT中的nuocyte細(xì)胞,是因?yàn)檠装Y狀態(tài)下的該細(xì)胞數(shù)目不僅增多(本研究中也顯示AR小鼠的nuocyte細(xì)胞數(shù)較正常小鼠顯著增多),而且處于激活狀態(tài),方便對其功能進(jìn)行研究。獲得了AR小鼠的nuocyte細(xì)胞后,在體外對其功能進(jìn)行了檢測,發(fā)現(xiàn)其在轉(zhuǎn)染前受到小鼠rmIL-33的干預(yù)后大量釋放IL-13,并釋放少量的IL-10,說明該細(xì)胞功能正常。隨后,我們構(gòu)建了IL-13 shRNA,并以慢病毒為載體體外轉(zhuǎn)染到nuocyte細(xì)胞中,以抑制IL-13基因在該細(xì)胞中的表達(dá)。我們沒有直接用IL-13基因敲除小鼠,因?yàn)镮L-13-/-小鼠建模不成功會(huì)對研究造成較大影響(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表),而攜帶有IL-13 shRNA的慢病毒轉(zhuǎn)染穩(wěn)定,且只影響nuocyte細(xì)胞產(chǎn)生和釋放IL-13的功能,結(jié)果更客觀與可靠。結(jié)果發(fā)現(xiàn),nuocyte細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后,rmIL-33的干預(yù)沒有使nuocyte細(xì)胞釋放IL-13的濃度升高,與干預(yù)前相比較,IL-13的濃度差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但分泌IL-10的濃度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,干預(yù)后顯著高于干預(yù)前。IL-13的濃度變化轉(zhuǎn)染前明顯高于轉(zhuǎn)染后,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,IL-10的濃度變化轉(zhuǎn)染前明顯低于轉(zhuǎn)染后,差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明,nuocyte細(xì)胞中IL-13基因轉(zhuǎn)錄的阻滯可以使抑制性細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生和釋放增加,可能在兩種細(xì)胞因子的基因序列之間有某種聯(lián)系,目前其機(jī)制尚不清楚。我們又將轉(zhuǎn)染前后的nuocyte細(xì)胞加入體外培養(yǎng)的CD4+T細(xì)胞中,以評估該細(xì)胞對CD4+IL10+細(xì)胞的分化是否有誘導(dǎo)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD4+IL10+細(xì)胞所占CD4+T細(xì)胞百分比發(fā)生變化,轉(zhuǎn)染后的nuocyte細(xì)胞共培養(yǎng)后CD4+IL10+細(xì)胞百分比明顯升高。這表明該細(xì)胞受IL-13 shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染的影響,IL-13釋放量減少,而IL-10釋放量增加,后者可通過其位于CD4+T細(xì)胞上的相應(yīng)受體,調(diào)節(jié)該細(xì)胞向CD4+IL10+細(xì)胞的分化[16]。

nuocyte細(xì)胞也可以產(chǎn)生和釋放IL-5,但其量甚微,該細(xì)胞的主要特點(diǎn)是產(chǎn)生IL-13,并在局部組織(如腸道和肺組織)中實(shí)施相應(yīng)功能[3-4],所以本研究中未檢測IL-5,而IL-13 shRNA的作用是否也會(huì)影響IL-5的產(chǎn)生,后者濃度的改變是否也會(huì)誘導(dǎo)CD4+IL10+細(xì)胞比例增加,尚待進(jìn)一步研究。

CD4+IL10+細(xì)胞可通過產(chǎn)生和分泌IL-10抑制局部的炎癥反應(yīng),就AR或哮喘等呼吸道的變態(tài)反應(yīng)性炎癥而言,該細(xì)胞通過釋放IL-10,后者通過其受體激活抑制氣道炎癥的通路,從而減輕鼻黏膜或支氣管黏膜的變應(yīng)性炎癥[17]。因此,可以考慮設(shè)計(jì)某種藥物或其他相關(guān)治療方法,通過抑制nuocyte細(xì)胞中IL-13基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),從而增加IL-10的產(chǎn)生和釋放,在直接抑制炎癥反應(yīng)的同時(shí),誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向CD4+IL10+細(xì)胞轉(zhuǎn)化,后者再釋放IL-10,繼續(xù)抑制局部的炎癥。

本研究發(fā)現(xiàn)體外小鼠nuocyte細(xì)胞中IL-13基因的干預(yù)可以促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向CD4+IL10+細(xì)胞的分化,但I(xiàn)L-13濃度的降低與IL-10的釋放增多之間是否存在某種調(diào)控機(jī)制,以及IL-13 shRNA是否會(huì)直接影響IL-10的表達(dá),尚待進(jìn)一步研究。