張加穩(wěn)

（昆明市食品藥品檢驗研究院，云南昆明 650000）

敵百蟲（C4H8O4Cl3P）是一種廣譜性磷酸酯類殺蟲劑，在弱堿性環(huán)境或進(jìn)入生物體內(nèi)易轉(zhuǎn)化成毒性更大的敵敵畏。先前在牛干巴腌制過程中，常噴灑敵百蟲驅(qū)趕蚊蟲和蠅以防腐，人體食用過程其殘留量易造成食物中毒，中華人民共和國衛(wèi)生部于2011 年在《食品中可能添加的非食用性物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單》中禁止在腌制品中添加敵百蟲。

早期敵百蟲殘留量的檢測主要采用高效液相色譜法（HPLC）和氣相色譜法（GC），目前氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS）和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS）已成為主要檢測方法。候逸眾等建立分散固相萃取法（DSPE）凈化處理火腿樣品，氣相色譜-質(zhì)譜法測定29 種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量，方法回收率為62.9%～115.8%。陳達(dá)煒等采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS），對腌制食品中敵百蟲提取前處理方法進(jìn)行研究，SPE 和GPC兩種凈化方法提取敵百蟲的平均回收率分別為81.7%～104.2%和72.4%～89.8%。目前未見研究牛干巴中油脂去除溶劑和順序?qū)嘲傧x殘留量檢測影響的報道，因此，本文對此做了優(yōu)化研究，建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測牛干巴中敵百蟲殘留量的分析方法，具有定性和定量準(zhǔn)確可靠、高靈敏度、基質(zhì)干擾小等優(yōu)點，適用范圍更廣，可為腌制食品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的檢測分析提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試劑：乙腈、甲醇，均為色譜純，默克股份兩合公司；正己烷、環(huán)己烷、丙酮、石油醚，分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；甲酸、甲酸銨、乙酸銨、無水硫酸鈉，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：敵百蟲，GSB05-2297-2016，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所。

材料：C18色譜柱（1.8 μm，2.1×50 mm，Agilent）；50 mL 塑料離心管；孔徑0.22 μm 有機(jī)濾膜；牛干巴樣品，市場抽檢。

1.2 儀器與設(shè)備

EXION-QTRAP4500 高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國AB 公司；電子天平、超聲波清洗儀、氮吹儀、高速離心機(jī)、精密移液槍、組織搗碎機(jī)、容量瓶。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確量取100 μg/mL 的敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)液，用40%乙腈稀釋成質(zhì)量濃度為1 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4℃冰箱保存。準(zhǔn)確量取1 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用40%乙腈依次稀釋成5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、80 ng/mL、100 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5 g 均勻試樣（精確到0.01 g）于5 0 mL 具塞離心管中，加入5 g 無水硫酸鈉混勻，加入20 mL 正己烷于40 ℃超聲20 min，棄去正己烷，加入10 mL 乙腈超聲波清洗儀超聲提取10 min，高速離心機(jī)5 000 r/min 離心5 min，將有機(jī)相轉(zhuǎn)移至50 mL 塑料離心管中，殘渣用10 mL 乙腈重復(fù)提取2次，合并有機(jī)相，于40 ℃氮吹儀上蒸發(fā)至近干，準(zhǔn)確加入1 mL 40%乙腈水溶液定容，過孔徑0.22 μm微孔濾膜后，供高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

ESI-MS/MS 條件：正離子掃描；MRM 多反應(yīng)監(jiān)測；氣簾氣，離子源霧化氣，離子源輔助加熱氣，分別設(shè)定為38、55、55，噴霧電壓5.5 kV，加熱器溫度為550 ℃；優(yōu)化后的監(jiān)測離子對（m/z）、去簇電壓（DP）、碰撞電壓(CE)、駐留時間等結(jié)果參數(shù)見表1。

表1 敵百蟲保留時間及質(zhì)譜參數(shù)

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

選擇Agilent C18色譜柱（2.1×50 mm，1.8 um），分別考察了0.1%甲酸水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水-10 mmol 乙酸銨-乙腈、0.1%甲酸水-10 mmol 甲酸銨-乙腈4 種流動相對檢測結(jié)果的影響，根據(jù)離子對峰型和強(qiáng)度確定的液相色譜條件為：流速：0.25 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；洗脫梯度：流動相A 為含0.1%甲酸的10 mmol/L 甲酸銨水溶液，流動相B 為乙腈，0 min～3 min，B 相40%～98%；3 min～4 min，B 相98%～98%；4 min～4.1 min，98%～40%；4.1 min～6 min，B相40%～40%。采用優(yōu)化后的液相色譜和質(zhì)譜參數(shù)方法對敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)液采集的離子色譜峰分別如圖1所示。

圖1 敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)品的UPLC-MS/MS 色譜圖

2.3 油脂的去除

2.3.1 去除油脂有機(jī)溶劑的優(yōu)化

對去除牛干巴油脂的有機(jī)溶劑進(jìn)行選擇，分別考察了用環(huán)己烷、丙酮、正己烷、石油醚等4 種溶劑去除油脂后提取回收率的高低，其提取回收率依次為90.3%、67.9%、93.6%、86.7%，結(jié)果表明，正己烷去除油脂效果最好，丙酮最差，原因可能是丙酮去除油脂率低或敵百蟲部分溶于丙酮所致，因此選擇正己烷作為去除油脂的有機(jī)溶劑。

2.3.2 去除油脂順序的優(yōu)化

由于牛干巴中含有較多油脂，會造成較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，不利于目標(biāo)物的提取和檢測，故在前處理過程中選定正己烷為去除油脂有機(jī)溶劑，對先去除油脂再萃取濃縮和先萃取濃縮再去除油脂2 種模式對比研究。結(jié)果表明，兩者的提取回收率分別為92.6%和82.1%，前者更高，且先去除油脂再萃取濃縮過程的提取溶劑蒸干時間大大縮短，原因可能是油脂既能降低目標(biāo)物的提取效率，也能提高萃取混合物溶液的沸點，因此選擇先去除油脂再萃取濃縮的提取模式。

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 線性關(guān)系及檢出限

敵百蟲質(zhì)量濃度范圍在5 ng/mL～100 ng/mL，采用外標(biāo)法定量，以目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)物定量離子對峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品經(jīng)除油脂萃取濃縮后進(jìn)行儀器檢測，敵百蟲的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表2。

2.4.2 加標(biāo)回收率和精密度

在空白樣品中分別添加1 μg/kg、2 μg/kg、10 μg/kg 3 個濃度水平的敵百蟲標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平進(jìn)行6 次平行試驗，按照優(yōu)化后的試驗方法測定，計算其加標(biāo)回收率及精密度，結(jié)果見表3。

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜法測定牛干巴中敵百蟲殘留量的分析方法，分別對油脂去除溶劑、去除順序、液相色譜和質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。該方法采用外標(biāo)法定量，樣品中添加敵百蟲1 μg/kg、2 μg/kg、10 μg/kg3 個濃度的加標(biāo)回收率均在91.22%～100.34%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。該方法操作簡便、快速、回收率高、重復(fù)性好，能滿足國內(nèi)外相關(guān)法規(guī)的要求，適合大批量牛干巴中敵百蟲殘留量的檢測分析。

表2 方法的線性方程及靈敏度

表3 樣品加標(biāo)回收率試驗結(jié)果（n=6）