苗亞洲，謝微嫣，李儲(chǔ)忠，張亞卓

(首都醫(yī)科大學(xué) 北京市神經(jīng)外科研究所，北京100070)

泌乳素腺瘤是最常見的功能性垂體腺瘤，占垂體腺瘤的32%～66%[1]。臨床上多數(shù)泌乳素腺瘤被認(rèn)為是良性腫瘤，經(jīng)多巴胺受體激動(dòng)劑和手術(shù)治療均能取得較好的效果。但是，有一部分泌乳素腺瘤具有耐藥性和侵襲性生長的特點(diǎn)，目前尚無有效的治療方法[2,3]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，探究泌乳素腺瘤發(fā)生發(fā)展過程中基因水平上的變化成為可能，為我們發(fā)現(xiàn)新的分子治療靶點(diǎn)提供了新方法。在前期研究中，我們通過對(duì)泌乳素腺瘤組織的高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了Pou class6同源框2(Pou6f2)的雙等位基因突變，提示Pou6f2可能在泌乳素腺瘤的發(fā)生發(fā)展中起十分重要的作用。以往研究表明，Pou6f2在腎母細(xì)胞癌中扮演腫瘤抑制因子的角色[4]。目前，尚未有Pou6f2在泌乳素腺瘤中的研究報(bào)道。2018年6～11月，我們主要通過向泌乳素腺瘤MMQ細(xì)胞中轉(zhuǎn)染特異性小干擾RNA(siRNA)干擾Pou6f2表達(dá)，或轉(zhuǎn)染高表達(dá)質(zhì)粒過表達(dá)Pou6f2，從而探究Pou6f2對(duì)MMQ細(xì)胞增殖和分泌泌乳素(PRL)能力的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠MMQ細(xì)胞和F12K培養(yǎng)基購自ATCC公司(美國)，馬血清和胎牛血清購自Gibco公司(美國)；鼠源Pou6f2-siRNA、含無義序列的陰性對(duì)照control-siRNA購自GenePharma公司(中國)，Pou6f2過表達(dá)質(zhì)粒、空載質(zhì)粒購自GenScript公司(美國)；Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司(美國)，非變性蛋白裂解液購自普利萊基因技術(shù)有限公司(中國)；Pou6f2抗體購自O(shè)rigene公司(美國)，β-actin抗體購自冠星宇科技公司(中國)；MTS購自Promega公司(美國)，ELISA試劑盒購自BioVision公司(美國)。

1.2 MMQ細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng) 將凍存的MMQ細(xì)胞從液氮中取出后，37 ℃水浴鍋中迅速解凍；在離心機(jī)中以1 500 r/min離心5 min，超凈工作臺(tái)中棄去凍存管中上清；用含雙抗、2.5%胎牛血清、15%馬血清的F12K培養(yǎng)基重懸后種入培養(yǎng)瓶中,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。24 h后對(duì)新復(fù)蘇的細(xì)胞傳代，臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞活力>99%，改為不含雙抗的完全培養(yǎng)基，48 h后鋪板轉(zhuǎn)染。

1.3 MMQ細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染

1.3.1 敲低Pou6f2實(shí)驗(yàn) 將MMQ細(xì)胞鋪6孔板，8×105/孔，鋪3個(gè)孔，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)1、2組。鋪板24 h后，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期，根據(jù)Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)1、2組分別轉(zhuǎn)染control-siRNA、Pou6f2-siRNA-1、Pou6f2-siRNA-2。72 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)染所用各siRNA見表1。

表1 轉(zhuǎn)染所用各siRNA序列

1.3.2 過表達(dá)Pou6f2實(shí)驗(yàn) 將MMQ細(xì)胞鋪6孔板，8×105/孔，鋪2個(gè)孔，分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染野生型Pou6f2質(zhì)粒。鋪板24 h后，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期，此時(shí)根據(jù)Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。72 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白質(zhì)。

1.4 MMQ細(xì)胞中Pou6f2蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。收集各組轉(zhuǎn)染72 h后的MMQ細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管中，PBS洗1遍，再次離心后吸干上層的PBS；向各個(gè)EP管中加入含蛋白酶抑制劑的非變性蛋白裂解液50 μL，渦旋后冰上裂解30 min；以12 000 r/min離心15 min，吸取上層蛋白液40 μL，BCA法測(cè)定蛋白濃度；然后向蛋白液中加入10 μL 5×上樣緩沖液，渦旋后沸水煮5 min,冰上放置5 min。根據(jù)BCA法所測(cè)得的各蛋白濃度，統(tǒng)一上樣蛋白量；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后5%TBS-T牛奶封閉1 h；孵育Pou6f2抗體，1∶2 000稀釋比例，4 ℃過夜；TBS-T洗膜10 min×3次后，再孵育相應(yīng)的兔抗1 h；再次洗膜后，用化學(xué)發(fā)光法發(fā)光，得到相應(yīng)的條帶圖像。β-actin為一步發(fā)光法，1∶4 000稀釋比例室溫孵育1 h，TBS-T洗膜10 min×3次后直接化學(xué)發(fā)光法發(fā)光，得到相應(yīng)條帶。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度比值表示Pou6f2的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 MMQ細(xì)胞增殖活性測(cè)定 采用MTS法。將生長狀態(tài)良好的MMQ計(jì)數(shù)后，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至5×104/mL。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔板中，每孔100 μL；24 h后細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期，按照Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分組與轉(zhuǎn)染方法同1.3，每組設(shè)置5個(gè)平行復(fù)孔。細(xì)胞置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h后，每孔加入20 μL的MTS，然后繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀測(cè)量96孔板各孔在波長490 nm處的吸光度值(A490)，以此表示細(xì)胞的增殖活性。

1.6 細(xì)胞分泌PRL水平測(cè)定 采用ELISA法。取各組轉(zhuǎn)染72 h的MMQ細(xì)胞，離心后保留細(xì)胞上清，并同時(shí)對(duì)各組的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀讀取各組在450 nm波長處的OD值；按照說明書要求以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線和各組細(xì)胞上清測(cè)得的OD值求出各組細(xì)胞上清中PRL水平。為排除細(xì)胞數(shù)量不同對(duì)各組細(xì)胞上清PRL水平的影響，我們用細(xì)胞數(shù)對(duì)所得PRL進(jìn)行校準(zhǔn)。我們定義一個(gè)指標(biāo)A，A=細(xì)胞上清的PRL值/細(xì)胞數(shù)，作為衡量MMQ細(xì)胞分泌PRL能力的指標(biāo)[5]。最后將對(duì)照組的值歸一化為1，算出各實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)PRL水平。

2 結(jié)果

2.1 敲低Pou6f2表達(dá)對(duì)MMQ細(xì)胞增殖活性、分泌功能的影響

2.1.1 各組MMQ細(xì)胞Pou6f2表達(dá)比較 實(shí)驗(yàn)1、2組MMQ細(xì)胞Pou6f2相對(duì)表達(dá)量分別為0.812±0.016、0.766±0.055，均低于對(duì)照組的1.067±0.076(P均<0.01)，實(shí)驗(yàn)1、2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

圖1 敲低Pou6f2實(shí)驗(yàn)中各組MMQ細(xì)胞Pou6f2表達(dá)情況(Western blotting法)

2.1.2 各組MMQ細(xì)胞增殖活性比較 實(shí)驗(yàn)1、2組MMQ細(xì)胞的相對(duì)增殖活性分別為1.020±0.085、0.912±0.020，均高于對(duì)照組的0.605±0.055(P均<0.01)，實(shí)驗(yàn)1、2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.1.3 各組MMQ細(xì)胞分泌PRL水平比較 實(shí)驗(yàn)1、2組MMQ細(xì)胞分泌PRL的相對(duì)水平分別為1.280±0.105、1.273±0.035，均高于對(duì)照組的1.000±0.043(P均<0.01)，實(shí)驗(yàn)1、2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 過表達(dá)Pou6f2對(duì)MMQ細(xì)胞增殖活性、分泌功能的影響

2.2.1 兩組MMQ細(xì)胞Pou6f2表達(dá)比較 實(shí)驗(yàn)組MMQ細(xì)胞Pou6f2相對(duì)表達(dá)量為1.990±0.057，高于對(duì)照組的1.177±0.096(P<0.01)。見圖2。

圖2 過表達(dá)Pou6f2實(shí)驗(yàn)中各組MMQ細(xì)胞Pou6f2表達(dá)情況(Western blotting法)

2.2.2 兩組MMQ細(xì)胞增殖活性比較 實(shí)驗(yàn)組MMQ細(xì)胞的相對(duì)增殖活性為0.815±0.048，低于對(duì)照組的1.083±0.052(P<0.01)。

2.2.3 兩組MMQ細(xì)胞分泌PRL水平比較 實(shí)驗(yàn)組MMQ細(xì)胞分泌PRL的相對(duì)水平為0.911±0.025，低于對(duì)照組的1.00±0.028(P<0.01)。

3 討論

泌乳素腺瘤是一種單克隆起源的腫瘤，這就意味著自發(fā)性的體細(xì)胞突變?cè)诿谌樗叵倭霭l(fā)生發(fā)展中起著重要作用[6]。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，Valimaki等[7]在散發(fā)性促生長激素腺瘤中發(fā)現(xiàn)了鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白α亞基突變，Reincke、Ma等[8,9]在促腎上腺皮質(zhì)激素腺瘤中發(fā)現(xiàn)了特異性泛素化蛋白酶8的突變。雖然，Bi和Song等[10,11]也對(duì)泌乳素腺瘤進(jìn)行高通量測(cè)序，但尚未有特異性的基因突變被發(fā)現(xiàn)。在前期研究中，我們通過對(duì)泌乳素腺瘤組織及其配對(duì)血液的高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)有1例患者的腫瘤組織中具有Pou6f2的雙等位基因突變，提示Pou6f2可能在泌乳素腺瘤中起重要作用。

Pou6f2是Pou家族的成員之一，Pou蛋白家族是一組可以通過結(jié)合特定的DNA序列以指導(dǎo)特定基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，其主要調(diào)控胚胎發(fā)育、參與細(xì)胞類型的特異性分化過程。Pou結(jié)構(gòu)域由N端的Pou特異性結(jié)構(gòu)域和C端的Pou同源結(jié)構(gòu)域組成，這些結(jié)構(gòu)域由可變長度的不太保守的接頭區(qū)域連接在一起。在哺乳動(dòng)物中，基于Pou結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列以及接頭區(qū)域保守的程度將Pou分成了6類(Pou1f～Pou6f)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，Pou蛋白家族涉及各種組織的發(fā)育和分化過程，且與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。例如：Pou1f1主要在垂體中表達(dá)，在垂體的發(fā)育過程中，Pou1f1主要通過激活生長激素和泌乳素基因來引導(dǎo)原始垂體細(xì)胞分化為生長激素細(xì)胞和泌乳素細(xì)胞，該基因的突變將導(dǎo)致垂體激素的合成缺乏[13]；Pou3f2的過表達(dá)可導(dǎo)致黑素瘤細(xì)胞過度增殖[12]；Pou3f4在內(nèi)耳發(fā)育中發(fā)揮作用，被認(rèn)為參與誘導(dǎo)紋狀體神經(jīng)元的分化，該基因的突變與X染色體相關(guān)的非綜合征性混合性耳聾有關(guān)[14,15]；Pou5f1編碼的蛋白OCT4以劑量敏感的方式賦予小鼠胚胎干細(xì)胞致瘤性，使高表達(dá)OCT4的腫瘤表現(xiàn)出更高的惡性程度[16,17]。目前，Pou6f2的研究主要集中在眼角膜和腎臟的發(fā)育方面。King等[18]研究表明，Pou6f2在人類角膜內(nèi)皮細(xì)胞的分化過程中起著非常重要的作用，是潛在的青光眼危險(xiǎn)因子。Di Renzo等[19]發(fā)現(xiàn)，Pou6f2在未分化的后腎間質(zhì)和小鼠胚胎腎的原始腎源性結(jié)構(gòu)中含量較高，推測(cè)Pou6f2可能在腎臟發(fā)育過程中具有特定的作用。值得注意是，Perotti等[4]在腎母細(xì)胞腫瘤患者中發(fā)現(xiàn)了Pou6f2兩個(gè)種系的雜合突變，提示Pou6f2可能作為一種腫瘤抑制因子參與了腎母細(xì)胞瘤的遺傳易感性。此外，Kang等[20]發(fā)現(xiàn)，Pou6f2是低級(jí)別唾液腺黏液表皮樣癌第二常見的突變基因。

在本研究中，我們通過降低和增加MMQ細(xì)胞中Pou6f2的表達(dá)量，觀察Pou6f2對(duì)MMQ細(xì)胞增殖和分泌PRL能力的影響。其中，MMQ細(xì)胞是大鼠泌乳素腺瘤細(xì)胞系，而Pou6f2是鼠源Pou6f2的名稱。我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)過表達(dá)Pou6f2時(shí)，MMQ細(xì)胞增殖能力降低，分泌PRL能力減弱；而當(dāng)干擾Pou6f2的表達(dá)時(shí)，MMQ細(xì)胞增殖能力提高，分泌PRL能力增強(qiáng)。與在腎母細(xì)胞瘤中相似，本研究結(jié)果表明Pou6f2在泌乳素腺瘤中也是作為腫瘤抑制因子存在，提示Pou6f2突變?cè)诿谌樗叵倭龅陌l(fā)生發(fā)展中可能起著非常重要的作用。但是，Pou6f2在泌乳素腺瘤中發(fā)揮作用的具體機(jī)制還不清楚。還有一些研究發(fā)現(xiàn)，Pou6f2在大鼠的垂體干細(xì)胞中表達(dá)，并且Pou6f2在胚胎早期含量較為豐富，隨著垂體的發(fā)育其含量逐漸下降[21]，提示Pou6f2可能參與垂體的發(fā)育過程。我們認(rèn)為，Pou6f2的突變可能引起了垂體發(fā)育過程中的一些變化，從而導(dǎo)致泌乳素腺瘤的發(fā)生，這將有待我們后續(xù)的研究去證明?？傊?，Pou6f2可以抑制MMQ細(xì)胞增殖，降低其分泌PRL的能力，有望成為泌乳素腺瘤治療的新分子靶點(diǎn)。