俞立萍，鄧周峰，萬(wàn)劍慧，林宏堅(jiān)

(上海市同仁醫(yī)院，上海200336)

流行病學(xué)研究顯示，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)發(fā)病率可達(dá)273～483/10萬(wàn)，特別是近3年其發(fā)病率上升趨勢(shì)明顯[1，2]。不同腫瘤相關(guān)蛋白的表達(dá)，均能影響肺泡上皮細(xì)胞的生物學(xué)特征，促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生和病情進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，波形蛋白(Vimentin)主要表達(dá)于上皮組織和基底膜組織中，能促進(jìn)上皮細(xì)胞間的縫隙連接和緊密連接的分解，可影響上皮細(xì)胞的極性和形態(tài)[3]；鋅指蛋白(Slug蛋白)表達(dá)能通過(guò)促進(jìn)上皮細(xì)胞間質(zhì)成分的分解，提高腫瘤細(xì)胞的黏附和侵襲能力[4，5]。為深入探討Vimentin、Slug蛋白表達(dá)與NSCLC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，本研究檢測(cè)了Vimentin、Slug蛋白在NSCLC組織中的表達(dá)變化，并分析二者的相互關(guān)系。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2015年1月～2017年8月上海市同仁醫(yī)院手術(shù)治療的NSCLC患者，本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2014年NCCN指南中NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)；②術(shù)后經(jīng)病理學(xué)或纖維支氣管鏡取活組織證實(shí)；③術(shù)前未行放化療或免疫治療；④術(shù)中留取腫瘤組織或者癌旁組織；⑤患者或家屬知情并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①轉(zhuǎn)移性肺癌；②長(zhǎng)期使用免疫抑制劑等藥物；③HIV感染。共選取90例患者的NSCLC病理標(biāo)本組織(NSCLC組)及其中45例患者的癌旁組織(對(duì)照組)。NSCLC組患者中男53例、女37例，年齡(56.2±9.6)歲，鱗癌10例、腺癌80例，腫瘤分化程度為高分化26例、中分化30例、低分化34例，TNM分期Ⅰ期27例、Ⅱ期38例、Ⅲ期22例、Ⅳ期3例，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例。對(duì)照組患者中男28例、女17例，年齡(58.0±10.3)歲，鱗癌5例、腺癌40例，腫瘤分化程度為高分化10例、中分化18例、低分化17例，TNM分期Ⅰ期15例、Ⅱ期20例、Ⅲ期8例、Ⅳ期2例，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例。兩組性別、年齡等臨床資料具有可比性。

1.2 Vimentin、Slug蛋白檢測(cè)方法 采用免疫組化法。取石蠟標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)性切片，脫蠟至水；采用H2O2室溫下孵育10 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5 min；加8%的蛋白粉封閉液(BSA，南京博奧生物科技公司)，封閉2 h；倒去封閉液后加入一抗(兔源，濃度1∶1 000～1∶1 500)，4 ℃冰箱過(guò)夜；磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5 min。加入二抗(鼠源，1∶400～1∶500)，室溫孵育20～30 min；磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5 min。加入辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記物，室溫孵育10 min；磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5 min；滴加顯色劑(DAB，南京博奧生物科技公司)，復(fù)染，脫水，封片。染色分析的結(jié)果判定：Vimentin蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)中、Slug蛋白主要分布于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，兩種蛋白陽(yáng)性染色在顯微鏡下均表現(xiàn)為黃色、棕黃色甚至褐色。依據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)染色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、褐色甚至更深為3分；依據(jù)陽(yáng)性染色細(xì)胞比例評(píng)分：≤10%為1分、11%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分。染色強(qiáng)度與染色陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分相乘，≥3判為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)，相關(guān)關(guān)系行Spearman秩相關(guān)分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組Vimentin、Slug蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況比較 NSCLC組Vimentin、Slug蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為57.78%(52/90)、68.89%(62/90)，對(duì)照組分別為8.89%(4/45)、13.33%(6/45)，NSCLC組Vimentin、Slug蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于對(duì)照組(χ2=29.539、37.039，P均<0.05)。

2.2 NSCLC組不同病理特征NSCLC組織中Vimentin、Slug蛋白表達(dá)比較 TNM分期Ⅲ期和Ⅳ期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC組織中Vimentin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC組織(P均<0.05)，TNM分期Ⅲ期和Ⅳ期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化NSCLC組織中Slug蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高分化及中分化的NSCLC組織(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 NSCLC組不同病理特征NSCLC組織中Vimentin、Slug蛋白表達(dá)比較

2.3 NSCLC組Vimentin蛋白、Slug蛋白表達(dá)的關(guān)系 相關(guān)分析顯示，NSCLC組中Vimentin蛋白與Slug蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.640，P<0.05)。

3 討論

環(huán)境、遺傳等因素均能誘導(dǎo)NSCLC的發(fā)生，促進(jìn)NSCLC臨床病理特征的進(jìn)展。作為呼吸系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，NSCLC無(wú)瘤生存時(shí)間不足38個(gè)月，包括手術(shù)在內(nèi)的相關(guān)綜合性治療后的3年病死率仍>35%[6,7]。另外，現(xiàn)階段臨床上缺乏對(duì)于NSCLC早期診斷的有效生物學(xué)血清分子，也是導(dǎo)致患者生存期較短的主要原因。本研究觀察了Vimentin、Slug蛋白在NSCLC組織中的表達(dá)變化，旨在探討NSCLC的發(fā)生機(jī)制，為NSCLC的免疫靶向治療提供基礎(chǔ)，為NSCLC早期高危人群的血清學(xué)篩查提供依據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)，某些生物學(xué)因子的濃度波動(dòng)，能夠在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的早期核異型性發(fā)生，或中晚期臨床病理特征進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。其能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，干預(yù)腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移速率等，進(jìn)而影響到患者的整體生存預(yù)后。Vimentin表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞間連接蛋白的分解，降低了上皮細(xì)胞間的黏附能力[8,9]。Vimentin對(duì)于腫瘤細(xì)胞微絲和微管蛋白的激活作用，能夠提高上皮細(xì)胞的變形和浸潤(rùn)能力。近年來(lái)基礎(chǔ)方面的相關(guān)研究還認(rèn)為，Vimentin是重要的信號(hào)通路激活因子，其對(duì)于HIPPO信號(hào)通路的激活作用，能夠提高NSCLC上皮細(xì)胞核DNA的轉(zhuǎn)錄風(fēng)險(xiǎn)，增加腫瘤細(xì)胞的調(diào)控異常風(fēng)險(xiǎn)[10]。Slug蛋白能夠參與到上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，其對(duì)于腫瘤細(xì)胞間質(zhì)成分的分解作用，能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞浸潤(rùn)基底膜組織提供前提；Slug蛋白表達(dá)還能提高腫瘤細(xì)胞對(duì)于基底膜內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮下血管的浸潤(rùn)能力[11]。

本研究結(jié)果顯示，Vimentin、Slug蛋白在NSCLC患者病灶組織中陽(yáng)性表達(dá)率均較癌旁組織上升，提示Vimentin、Slug蛋白高表達(dá)均能影響NSCLC的發(fā)生過(guò)程。通過(guò)分析相關(guān)文獻(xiàn)，我們認(rèn)為這與Vimentin、Slug蛋白以下的病理生理作用機(jī)制有關(guān)[12～14]：①Vimentin蛋白表達(dá)上升能夠提高腫瘤細(xì)胞肌動(dòng)蛋白的活性，提高腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力；②Slug蛋白表達(dá)上升能夠提高惡性腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的速度，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)于基底膜的浸潤(rùn)過(guò)程。岳銀艷等[15]也發(fā)現(xiàn)，在NSCLC患者腫瘤組織中，Slug蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯上升，平均升幅超過(guò)25%，在發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或臨床分期進(jìn)展的患者中Slug蛋白表達(dá)上升更明顯。相關(guān)分析可見(jiàn)，Vimentin、Slug蛋白表達(dá)具有內(nèi)在的正相關(guān)關(guān)系，提示二者在促進(jìn)NSCLC病情進(jìn)展過(guò)程中可能發(fā)揮一定的協(xié)同作用。這主要與Vimentin、Slug蛋白表達(dá)均能夠影響到腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)能力，促進(jìn)了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程有關(guān)。對(duì)NSCLC患者臨床病理特征的分析研究可見(jiàn)，在臨床分期較晚或發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，Vimentin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明上升，提示Vimentin蛋白表達(dá)對(duì)NSCLC患者臨床病程有影響。這主要與Vimentin蛋白表達(dá)上升能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)臨近正常肺部組織的浸潤(rùn)，增加了腫瘤細(xì)胞對(duì)于淋巴結(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附過(guò)程有關(guān)。而在臨床分期較晚、發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或者腫瘤細(xì)胞分化程度較差的患者中，Slug蛋白表達(dá)也上升，表明Slug蛋白表達(dá)與NSCLC的臨床病理特征有關(guān)系。這主要與Slug蛋白表達(dá)不僅能影響到腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)基底膜組織的能力，同時(shí)還能夠影響到肺泡上皮細(xì)胞的分化成熟能力。由此可見(jiàn)，在NSCLC患者中，Vimentin、Slug蛋白表達(dá)均上升，二者與肺癌患者的臨床病理特征的進(jìn)展密切相關(guān)，在促進(jìn)肺癌的發(fā)生發(fā)展中起到一定的協(xié)同作用。因此，Vimentin、Slug蛋白可用于NSCLC的診斷、病情判斷，作為治療靶點(diǎn)亦有一定臨床價(jià)值。