楊 俊，佟 靚，周立國*

(1.大理州第二人民醫(yī)院，云南 大理 671000；2.云南省精神病醫(yī)院，云南 昆明 650101

兒童精神分裂癥具有起病年齡小、易反復(fù)發(fā)作、治療難度大、預(yù)后差的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響患者身心健康[1]。精神分裂癥的病因?qū)W研究指出，神經(jīng)發(fā)育障礙是精神分裂癥發(fā)病的重要影響因素。精神分裂癥患者存在腦室擴(kuò)大、腦溝變寬、海馬體積縮小、腦體積減小等顱腦異常[2]。Sporn等[3]研究顯示，兒童精神分裂癥患者的腦灰質(zhì)和腦體積較健康兒童小，且其腦灰質(zhì)密度降低早于精神分裂癥的癥狀出現(xiàn)，精神分裂癥患者的腦發(fā)育異常在胎兒期就已出現(xiàn)，主要表現(xiàn)為腦室擴(kuò)大，這種病理改變貫穿于童年期[4]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是神經(jīng)發(fā)生蛋白，是神經(jīng)可塑性的重要調(diào)節(jié)因子[5-6]，BDNF表達(dá)減少可引起內(nèi)嗅皮質(zhì)、額葉皮質(zhì)、海馬和扣帶回細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，破壞神經(jīng)元的交互對話，導(dǎo)致顱腦發(fā)育異常[7]，BDNF對神經(jīng)元的生物學(xué)作用提示其可能是精神分裂癥發(fā)病的影響因素。β Ⅲ型微管蛋白(β-Ⅲ-tubulin，Tuj-1)是一種參與神經(jīng)元細(xì)胞類型特異性分化的微管蛋白，在神經(jīng)元突觸分化時(shí)表達(dá)增加，參與神經(jīng)元的交互對話[8]。當(dāng)神經(jīng)元受損、突觸分化障礙時(shí)，Tuj-1表達(dá)水平降低，Tuj-1可作為神經(jīng)元突觸分化的特異性標(biāo)志物[9]。在細(xì)胞凋亡進(jìn)程中，胱天蛋白酶3(Caspase-3)被激活提示細(xì)胞凋亡已進(jìn)入不可逆階段，有研究指出，Caspase-3作為神經(jīng)元凋亡相關(guān)指標(biāo)在神經(jīng)元輕微損傷時(shí)表達(dá)就會(huì)增加[10]?；诰穹至寻Y的顱腦病變特點(diǎn)及BDNF對神經(jīng)元的調(diào)節(jié)作用，本研究探索BDNF、神經(jīng)元標(biāo)志物Tuj-1和凋亡標(biāo)志物Caspase-3在兒童精神分裂癥中的變化，為揭示兒童精神分裂癥的病因和發(fā)病機(jī)制提供參考。

1 對象與方法

1.1 對象

以2015年8月-2018年3月在大理州第二人民醫(yī)院就診的兒童精神分裂癥患者為研究組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(第4版)》(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，fourth edition，DSM-IV)精神分裂癥診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡3～12歲；③既往未經(jīng)任何治療的首發(fā)患兒，無系統(tǒng)精神類藥物應(yīng)用史；④漢族；⑤無心、肝、腎等器質(zhì)性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并腦炎、癲癇、多發(fā)性硬化、精神發(fā)育遲滯等神經(jīng)系統(tǒng)器質(zhì)性疾病者；②有顱腦外傷病史者。符合納入標(biāo)準(zhǔn)且不符合排除標(biāo)準(zhǔn)共35例。同期采用計(jì)算機(jī)隨機(jī)法從在大理州第二人民醫(yī)院體檢的兒童中選取30例年齡、性別、受教育程度與研究組匹配的健康兒童為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡3～12歲；②漢族；③無心、肝、腎等器質(zhì)性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并腦炎、癲癇、多發(fā)性硬化、精神發(fā)育遲滯等神經(jīng)系統(tǒng)器質(zhì)性疾病者；②有顱腦外傷病史者；③二系三代有精神病家族史或自殺史者。本研究經(jīng)大理州第二人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。研究對象均由其監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

1.2 BDNF、Caspase-3和Tuj-1的mRNA檢測

所有兒童于入組當(dāng)日08∶00-10∶00由護(hù)士抽取空腹靜脈血5 mL置于抗凝管中作為標(biāo)本。用Trizol裂解液提取總RNA后于-80℃保存，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)一步進(jìn)行cDNA擴(kuò)增。

使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄體系50 uL：5×PrimeScript Buffer 10 μL，Oligo(dT) primer (50 μM) 2.5 μL，Prime Script RT Enzyme MixI 2.5 μL，Random 6 mers(100 uM)2.5 μL，Total RNA 2.5 μL，RNase Free ddH2O 30 μL。RNA逆轉(zhuǎn)錄條件：① 37℃，15 min，然后進(jìn)行；②85℃，5 s，最后進(jìn)行；③4℃，forever。在cDNA中加入引物后進(jìn)行擴(kuò)增，RT-PCR反應(yīng)體系20 μL：cDNA 1 μL，Primer1 0.5 μL，Primer2 0.5 μL，Mix 10 μL，RNase Free ddH2O 8 μL。RT-PCR順序反應(yīng)條件：①50℃，2 min，②95℃，2 min，③95℃ 15s，60℃ 1min 該步驟進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，④95℃，15 s，⑤60℃，30 s，⑥ 95℃，15 s。每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)。BDNF、Caspase-3、Tuj-1基因引物由美國英杰(Invitrogen)生物公司合成。BDNF：上游引物：5′-CAGAGGAGCCAGCCCGGTGCG-3′，下游引物：5′-CTCCTGCACCAAGCCCCATTC-3′。Caspase-3：上游引物：5'-ACCGATGTCGATGCAGCTAA-3'；下游引物：5'-GGTGCGGTAGAGTAAGCATA-3'。GAPDH：上游引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'；下游引物：5'-TTGGCTCCACCCTTCAAGTG-3'。Tuj-1：上游引物：5'-CCATCTAGCTACTGACACTG-3'；下游引物：5'-AAGTGGACTCACATGGAGTG-3'。本研究所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3 設(shè)備與試劑

Trizol裂解液購買于美國西格瑪(Sigma)生物公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購買于日本他卡若生物公司。PCR擴(kuò)增儀購于美國伯樂公司，型號(hào)Tetrad2。RT-PCR系統(tǒng)購于美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，型號(hào)7300。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料比較

研究組年齡(8.31±2.16)歲；男生18例，女生17例；小學(xué)19例，學(xué)齡前16例。對照組年齡(9.02±1.76)歲；男生15例，女生15例；小學(xué)16例，學(xué)齡前14例。

2.2 兩組BDNF mRNA、Caspase-3 mRNA和Tuj-1 mRNA表達(dá)水平比較

研究組BDNF mRNA和Tuj-1 mRNA表達(dá)水平均低于對照組，Caspase-3 mRNA表達(dá)水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)。見表1、圖1。

表1 兩組BDNF mRNA、Caspase-3 mRNA和Tuj-1 mRNA表達(dá)比較

圖1 兩組BDNF mRNA、Caspase-3 mRNA和Tuj-1 mRNA表達(dá)比較

3 討 論

兒童精神分裂癥是較常見的兒童精神疾病，與神經(jīng)發(fā)育異常關(guān)系密切。精神分裂癥與神經(jīng)元的變性、凋亡密切相關(guān)，其特異性癥狀、認(rèn)知缺陷的持續(xù)進(jìn)展及治療效果較差可能與神經(jīng)細(xì)胞的功能下降有關(guān)。兒童及青少年階段是神經(jīng)細(xì)胞快速增殖、生長時(shí)期，這一時(shí)期神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生大量凋亡必將影響兒童的腦組織生長和發(fā)育，從而導(dǎo)致一系列神經(jīng)及精神問題。

本研究顯示，兒童精神分裂癥患者Tuj-1表達(dá)較健康兒童低。Tuj-1是一種微管蛋白，是神經(jīng)元的特異性抗原之一。研究顯示[11-12]，在大腦發(fā)育過程中，神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元是一個(gè)循序漸進(jìn)的過程，分別經(jīng)歷了神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)祖細(xì)胞、神經(jīng)母細(xì)胞、不成熟神經(jīng)元和成熟神經(jīng)元階段。在此過程中，Tuj-1的表達(dá)增加提示神經(jīng)元正處于發(fā)展和成熟的過程，Tuj-1表達(dá)減低提示神經(jīng)元減少[13]。本研究中患兒Tuj-1表達(dá)降低，提示精神分裂癥患兒腦內(nèi)神經(jīng)元減少、受損或死亡。

Caspase-3是細(xì)胞凋亡下游的關(guān)鍵執(zhí)行者之一，其表達(dá)上調(diào)提示凋亡蛋白表達(dá)增加，即凋亡的細(xì)胞數(shù)量增加。本研究顯示，精神分裂癥患兒Caspase-3表達(dá)較健康兒童高，提示精神分裂癥患兒腦內(nèi)凋亡的神經(jīng)元數(shù)量較正常兒童多。

本研究中，研究組BDNF mRNA表達(dá)低于對照組，推測BDNF表達(dá)減少后神經(jīng)元失去相應(yīng)滋養(yǎng)，從而導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，產(chǎn)生功能缺損，表現(xiàn)出精神分裂癥的一系列癥狀。神經(jīng)營養(yǎng)因子在神經(jīng)元的發(fā)生、發(fā)育、成熟及凋亡過程中均發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，對中樞和外周神經(jīng)元的存活起到支撐作用[14-15]。BDNF表達(dá)于大腦皮層、海馬、紋狀體等與精神分裂癥發(fā)病相關(guān)的腦區(qū)，對新神經(jīng)元的發(fā)生、發(fā)育和存活具有調(diào)控作用，對發(fā)育成熟神經(jīng)元的功能維持具有保護(hù)作用[16-17]，BDNF表達(dá)降低會(huì)產(chǎn)生一系列顱腦發(fā)育異常及神經(jīng)精神障礙[18]。本研究結(jié)果顯示，精神分裂癥患兒BDNF表達(dá)減少，與既往研究結(jié)果一致。

綜上所述，兒童精神分裂癥患者BDNF mRNA和Tuj-1mRNA表達(dá)減少，Caspase-3 mRNA表達(dá)增加，推測BDNF、Tuj-1和Caspase-3可能與兒童精神分裂癥的發(fā)病相關(guān)。本研究的局限性在于：僅觀察35例首發(fā)精神分裂癥患兒的BDNF、Tuj-1及Caspase-3的mRNA表達(dá)變化，且未對mRNA轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，在今后的研究中應(yīng)擴(kuò)大樣本量，同時(shí)對相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及轉(zhuǎn)錄后蛋白進(jìn)行研究，并進(jìn)一步探討B(tài)DNF表達(dá)減少、神經(jīng)元凋亡后神經(jīng)元的功能及交互對話，以揭示兒童精神分裂癥的病因和發(fā)病機(jī)制。