莫燕芳，王洋洋，梁潔玲，李海珠，陳立強

(肇慶市第一人民醫(yī)院檢驗科，廣東 肇慶 526000)

動脈粥樣硬化主要是由于體內(nèi)膽固醇水平上升并造成在巨噬細(xì)胞內(nèi)堆積，產(chǎn)生慢性持續(xù)性炎癥反應(yīng)并且在血管內(nèi)壁沉積而導(dǎo)致血管硬化的疾病[1]。 研究表明ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運體 （ATP－bidnding cassette tiansporters，ABC transporters，ABC 轉(zhuǎn) 運體）參與了巨噬細(xì)胞的膽固醇逆向轉(zhuǎn)運機制，將巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞內(nèi)的膽固醇轉(zhuǎn)移至血液或高密度脂蛋白中，經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運至肝臟進(jìn)行分解代謝而抑制巨噬細(xì)胞泡沫化。膽固醇在單核細(xì)胞內(nèi)聚集并使單核細(xì)胞泡沫化[2，3]。因此，ABCA1可能在AS的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮著很關(guān)鍵的作用。為探討ABCA1在巨噬細(xì)胞膽固醇流出到血液或轉(zhuǎn)移到HDL機制中的作用，本實驗采用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測ABCA1基因在AS患者中的表達(dá)與變化，進(jìn)一步了解其在AS發(fā)病機制中所發(fā)揮的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取肇慶市第一人民醫(yī)院2016年01月至2017年6月確診為AS患者50例，作為AS組，該組患者均滿足中國心臟病委員會對AS的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中男27例，女23例；年齡（55.4±7.2）歲；同期選取45例健康體檢者作為對照組，對照組患者均冠脈造影正常，無冠心病和AS的相關(guān)臨床癥狀，血清肌鈣蛋白 （cTnI）無升高（＜0.1ng/ml）。 其中男 28 例，女 17 例；年齡（53.9±6.5）歲。

1.2 儀器與試劑 RNA提取試劑盒（invitrogen）、人單個核細(xì)胞分離液 （深圳市達(dá)科為生物工程有限公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因公司）、PCR分析儀（ABI 7500）、PCR引物（上海生物工程股份有限公司）等。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集及單個核細(xì)胞分離 無菌操作采靜脈血 2ml，用 EDTA·K2（或者枸櫞酸鈉）抗凝，使用密度梯度沉降法分離單個核細(xì)胞，用等體積的0.9%的生理鹽水稀釋全血，在離心管中加入一定體積的分離液，將稀釋后的血樣平鋪到分離液上方，保持兩界面清晰。分離液、全血、生理鹽水的體積為 1：1：1；626×g，離心 20min（水平離心），吸取白細(xì)胞層（從上而下的第二層），-80℃冰凍保存。

1.3.2 制備單個核細(xì)胞總的RNA 取制備好的勻漿單個核細(xì)胞室溫解凍，加入0.25ml氯仿，劇烈震動 20s， 室溫靜置 3min；4℃、12000×g 離心 15min，移上層液體至新EP管，加0.5ml異丙醇，充分震蕩混勻后室溫靜置 15min；4℃、12000×g離心 10min棄上清液，保留底部沉淀；加入無水乙醇0.5ml洗滌沉淀，4℃、7500×g離心 5min，棄上清液，再重復(fù)洗滌沉淀一次，56℃干燥5min；加入20μl去離子水溶解RNA，60℃、孵育10min。紫外分光光度儀檢測提取的RNA濃度，-80℃下冰凍保存。

1.3.3 引物的來源 根據(jù)在Pubmed中查到ABCA1基因的GenBank序列，同時遵循引物設(shè)計原則設(shè)計反應(yīng)的引物，由上海生物工程公司合成，見表1。

表1 引物的設(shè)計

1.3.4 RT-PCR檢測ABCA1 mRNA表達(dá) 以RNA為模板，使用中山大學(xué)達(dá)安基因公司RT-PCR反應(yīng)試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。擴(kuò)增條件為50℃30min，94℃ 2min， 然 后 94℃ 30s，56℃ 30s，72℃2min，30個循環(huán)。RT-PCR擴(kuò)增完成后取3μl RTPCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，恒壓80V電泳30min，紫外透射儀下觀看結(jié)果并拍照，圖片經(jīng)圖像分析軟件Band Scan進(jìn)行光密度值掃描與分析，根據(jù)分析結(jié)果計算出各泳道ABCA1與內(nèi)參照β-actin光密度之比作為ABCA1相對含量值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血單個核細(xì)胞ABCA1 mRNA的表達(dá) AS患者PBMC中mRNA表達(dá)顯著高于對照組 （P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2、圖1。

表2 PBMC ABCA1 mRNA表達(dá)檢測結(jié)果（±s）

表2 PBMC ABCA1 mRNA表達(dá)檢測結(jié)果（±s）

檢測項目 AS 健康對照組ABCA1/β-actin（mRNA） 0.425±0.086 0.253±0.024

圖1外周血單個核細(xì)胞ABCA1基因表達(dá)

3 討論

血液中膽固醇水平增高，進(jìn)而在單核細(xì)胞內(nèi)積累并泡沫化是導(dǎo)致動脈粥樣硬化和血管炎癥的重要原因[4]。細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出是控制泡沫細(xì)胞形成的重要機制，而ABC轉(zhuǎn)運體在該機制的正常運行中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5，6]。膽固醇從細(xì)胞中流出，可轉(zhuǎn)運至HDL和ApoA1進(jìn)入血循環(huán)至肝臟進(jìn)行代謝，預(yù)防動脈粥樣硬化的發(fā)生。對實驗小鼠ABCA1基因進(jìn)行敲除和實施高脂喂養(yǎng)，基因敲除小鼠均發(fā)生動脈粥樣硬化，而且硬化斑塊面積更大且浸潤損傷更嚴(yán)重[7，8]。本研究采用RT-PCR比較AS患者和健康者單個核細(xì)胞中ABCA1 mRNA水平的差異，發(fā)現(xiàn)AS患者ABCA1 mRNA基因表達(dá)明顯升高，表明ABCA1可能參與了AS發(fā)病機制，是AS潛在的預(yù)防或治療靶點[9，10]，綜上所述，深入研究膽固醇轉(zhuǎn)運體ABCA1基因表達(dá)會對As的早期診斷與治療提供依據(jù)，對As的疾病監(jiān)測提供依據(jù)。