李宏 ，王新娟 ，武寶峰 ，梁仁杰 ，郭福君

(1.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院開元院區(qū)口腔頜面外科，河南 洛陽471000；2.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院開元院區(qū)生物實驗室，河南 洛陽471000)

近年來，隨著人們生活方式和飲食習(xí)慣的改變，口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）的發(fā)病率具有上升的趨勢，臨床上OSCC的發(fā)生能夠?qū)е禄颊呱骖A(yù)后的惡化[1]。流行病學(xué)研究認(rèn)為，OSCC的發(fā)病率可超過262～637/10萬人左右[2]。

生物學(xué)蛋白分子的改變，能夠影響腫瘤細(xì)胞早期的浸潤能力，增加癌細(xì)胞的增殖調(diào)控平衡的改變。PIN2碼/TRF1相互作用蛋白（Pinx1）的表達，能夠抑制端粒酶的活，降低癌細(xì)胞的增殖風(fēng)險，抑制癌細(xì)胞 DNA的擴增[3]；CD44拼接變異體 6（CD44v6）蛋白的表達濃度的上升，能夠促進癌細(xì)胞浸潤能力的改變，導(dǎo)致癌細(xì)胞的粘附能力及血管內(nèi)皮細(xì)胞的浸潤風(fēng)險的增加[4]。部分研究揭示了CD44v6在OSCC及胃癌等腫瘤中的高表達情況，認(rèn)為CD44v6的表達與惡性腫瘤患者的臨床轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，但對于Pinx1的分析研究不足。為了揭示OSCC患者的發(fā)病機制，從而為臨床上OSCC患者的早期診斷及免疫靶向治療提供參考，本次研究選取我院2014年6月-2016年12月收集的68例OSSC組織 （OSCC組），探討了CD44v6蛋白、Pinx1蛋白的表達情況，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院2014年6月-2016年12月收集的68例OSCC組織（OSCC組）、正常口腔黏膜組織34例（對照組）。

OSCC 組，年齡 42～76 歲，平均 58.9±9.5歲，男性41例、女27例，TNM分期：Ⅰ期患者14例、Ⅱ期患者24例、Ⅲ期患者23例、Ⅳ期患者7例；分化程度：其中高分化患者23例、中分化患者20例、低分化患者25例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例。對照組，年齡 37～77歲，平均 57.6±14.2歲，男性 22例、女12例。OSCC組與對照組年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴符合口腔鱗狀細(xì)胞癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；⑵患者年齡范圍19～79歲；⑶在我院接受口腔鱗癌根治性手術(shù)，收集患者的術(shù)后標(biāo)本；⑷患者手術(shù)前為接受放化療、免疫治療。

排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴未經(jīng)病理學(xué)證實；⑵伴有其他部位惡性腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤；⑶資料缺失導(dǎo)致無法進行統(tǒng)計分析。

1.2 免疫組化染色方法 采用石蠟切片脫蠟至水，采用離子水進行反復(fù)洗滌，加入牛奶液體封閉抗體，封閉時間為5min，加入CD44v6蛋白、Pinx1蛋白抗體（鼠來源，ABCUM 公司），37℃孵育2h，采用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，滴加熒光染色標(biāo)記的二抗抗體（購自abcum公司），37℃孵育30min，加入磷酸鹽緩沖液進行洗滌，采用南京凱基生物制劑公司生產(chǎn)的顯色劑進行顯色，封片，鏡下觀察。

1.3 免疫組化染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 免疫組化結(jié)果判定：CD44v6蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜，Pinx1蛋白定位在細(xì)胞核，陽性染色均為黃色、棕黃色、褐色，⑴根據(jù)著色強度：無色（評為0分）、淡黃色（評為1分）、棕黃色（評為2分）、褐色及黑色（評為3分）；⑵依據(jù)陽性染色的細(xì)胞數(shù)目：陽性染色細(xì)胞數(shù)目占比≤10%（評為1分）、陽性染色細(xì)胞數(shù)目占比范圍11%～50%（評為2分）、陽性染色細(xì)胞數(shù)目占比51%～75%（評為3分）、陽性染色細(xì)胞數(shù)目占比＞75%（評為4分），染色強度積分與染色細(xì)胞數(shù)目積分的乘積＜3 分（-）、≥3 分（+）。

2 結(jié)果

2.1 兩組標(biāo)本中的CD44v6蛋白、Pinx1蛋白陽性表達率比較 OSCC組標(biāo)本中的CD44v6蛋白、Pinx1蛋白陽性表達率分別為66.18%、61.76與對照組的8.82%、94.12%比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；見表 1、圖 1。

表1 兩組標(biāo)本中的CD44v6蛋白、Pinx1蛋白陽性表達率比較[n（%）]

圖1 Pinx1蛋白免疫組化染色（×400）

圖2 CD44v6蛋白免疫組化染色（×400）

2.2 兩組標(biāo)本中的CD44v6蛋白表達與分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 CD44v6蛋白陽性表達中低分化患者占比、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者占比均高于CD44v6蛋白陰性表達的OSCC患者（P＜0.05）；見表 2。

2.3 兩組標(biāo)本中的Pinx1蛋白表達與分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 Pinx1蛋白陽性表達的低分化患者占比、Ⅲ期+Ⅳ期患者占比、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者占比均低于Pinx1蛋白陰性表達的 OSCC 患者（P＜0.05）；見表 3。

3 討論

環(huán)境因素、遺傳因素、飲食習(xí)慣等，均能夠影響OSCC的發(fā)生，促進OSCC臨床病理特征的進展[5]。作為口腔耳鼻咽喉常見的惡性腫瘤，OSCC的無瘤生存時間不足38個月，保守手術(shù)在內(nèi)的相關(guān)綜合性治療措施治療后的3年內(nèi)病死率仍然超過35%[6，7]。另外一方面，現(xiàn)階段臨床上缺乏對于OS-CC早期診斷的有效生物學(xué)血清分子，而本次研究對于腫瘤相關(guān)蛋白的表達陽性率的研究，可以為揭示OSCC的發(fā)生機制提供參考，并能夠為OSCC的免疫靶向治療提供基礎(chǔ)，為OSCC的早期高危人群的血清學(xué)篩查提供依據(jù)。

表2 兩組標(biāo)本中的CD44v6蛋白表達與分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[n（%）]

表3 兩組標(biāo)本中的Pinx1蛋白表達與分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[n（%）]

生物學(xué)因子的濃度波動，能夠在促進腫瘤細(xì)胞的早期核異型性的發(fā)生，或者中晚期臨床病理特征進展過程中發(fā)揮重要的作用。其能夠調(diào)控癌細(xì)胞的生物學(xué)特性，干預(yù)癌細(xì)胞的擴散和轉(zhuǎn)移速率等，進而影響患者的整體生存預(yù)后。Pinx1蛋白的表達，作為保護性的腫瘤相關(guān)蛋白，其能夠抑制染色體末端端粒結(jié)構(gòu)，抑制端粒酶的活性，降低端粒酶激活導(dǎo)致的染色體及DNA的過度復(fù)制[8]?；A(chǔ)領(lǐng)域的相關(guān)研究也認(rèn)為，Pinx1的表達濃度的下降能夠誘導(dǎo)腫瘤的早期發(fā)生及中晚期臨床病理特征的進展[9]；CD44v6蛋白是CD44的突變體，其能夠與上皮細(xì)胞膜表面配體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的腫瘤相關(guān)信號通路，增強癌細(xì)胞的過度增殖效應(yīng)。同時CD44v6蛋白能夠促進癌細(xì)胞的偽足的形成，提高癌細(xì)胞的變形和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。

本次研究發(fā)現(xiàn)在OSCC病灶組織中CD44v6蛋白的表達陽性率顯著的上升，而Pinx1蛋白的表達陽性率顯著的下降，提示了CD44v6蛋白、Pinx1蛋白均能夠參與到OSCC腫瘤的發(fā)生過程中，通過薈萃國內(nèi)外相關(guān)文獻，筆者認(rèn)為CD44v6蛋白、Pinx1蛋白主要通過下列幾個方面的因素影響OSCC 的發(fā)生發(fā)展[10，11]：⑴CD44v6 蛋白的高表達，能夠促進癌細(xì)胞的偽足的形成，提高癌細(xì)胞對于淋巴結(jié)的粘附，增強癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險；⑵Pinx1蛋白的表達的缺失，導(dǎo)致癌細(xì)胞的端粒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的下降，影響到癌細(xì)胞的增殖平衡保護過程，導(dǎo)致癌細(xì)胞DNA擴增、染色體分離等過程顯著的增強。徐清等[12]研究者也認(rèn)為，OSCC病灶組織中的CD44V6的表達陽性率可平均上升27%以上，在OSCC患者短期內(nèi)病灶進展速度較快、病死率較高的患者中，CD44v6蛋白的表達強度上升更為明顯。在探討相關(guān)臨床病理特征的過程中，在發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及低分化的OSCC組織中，CD44v6蛋白的表達陽性率可顯著的上升，提示CD44v6蛋白與OSCC患者的臨床病理特征密切相關(guān)，這主要由于CD44v6蛋白能夠影響到癌細(xì)胞的分化成熟能力，導(dǎo)致分化誘導(dǎo)成熟因子的表達濃度下降，同時CD44v6蛋白還能夠促進癌細(xì)胞經(jīng)過淋巴結(jié)跳躍式浸潤的風(fēng)險[13]。同樣Pinx1蛋白的表達與OSCC的臨床病理特征密切相關(guān)，Pinx1蛋白的表達與OSCC患者的癌細(xì)胞分化程度、腫瘤TNM分期、癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理過程密切相關(guān)，這主要由于Pinx1蛋白能夠影響到癌細(xì)胞對于臨近正常上皮組織的浸潤能力，導(dǎo)致腫瘤的臨床TNM分期等病理特征的進展。但部分研究者并未發(fā)現(xiàn)Pinx1蛋白的表達與OSCC患者的癌細(xì)胞分化程度的關(guān)系，這主要考慮與免疫組化指標(biāo)的檢查靈敏度的差別或者OSCC的細(xì)胞來源類型的差別有關(guān)[14，15]。

綜上所述，CD44v6蛋白在OSCC組織中的表達陽性率明顯的上升，而Pinx1蛋白的表達陽性率明顯的下降，并且與腫瘤的病理學(xué)特征具有一定的相關(guān)性。