劉艷華 綜述，鐘橋石，胡龍華 審校

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西省醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330006)

多黏菌素(polymyxin/colistin)是屬于窄譜類抗生素的聚陽離子抗菌肽，對大多數(shù)革蘭陰性菌有較強(qiáng)較快的殺菌作用，特別是對大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌等細(xì)菌有良好的抗菌活性。多黏菌素抗菌機(jī)理是其能與革蘭陰性菌細(xì)胞膜的磷脂中帶負(fù)電荷的類脂A結(jié)合，造成細(xì)胞外膜通透性改變，導(dǎo)致細(xì)菌核酸、氨基酸等重要物質(zhì)外漏，從而抑制細(xì)菌生長或?qū)е录?xì)菌死亡[1]。近年來，隨著抗菌藥物的廣泛使用，臨床經(jīng)常能分離到多重耐藥甚至泛耐藥的菌株。2014年，WHO發(fā)布的首份全球細(xì)菌耐藥監(jiān)測報(bào)告顯示，2013年全球直接死于耐藥菌感染的人數(shù)超過100萬，并預(yù)計(jì)照此趨勢到2020年全球每年將有1000萬人死于多重耐藥菌感染，死亡人數(shù)將超過癌癥，全球?qū)W者強(qiáng)調(diào)了目前細(xì)菌耐藥性的嚴(yán)重威脅，警告如不采取進(jìn)一步措施，無藥可用的“抗生素后時(shí)代”即將來臨[2]。近十年中國CHINET監(jiān)測數(shù)據(jù)研究表明，革蘭陰性桿菌臨床分離株多重耐藥性嚴(yán)重，對臨床常用抗菌藥物耐藥率上升明顯，尤其值得注意的是，近幾年耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌 （Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE）上升趨勢明顯，2015年CRE檢出率高達(dá)8%[3]。Nordmann等研究也表明CRE檢出率顯著升高，且其能在臨床上快速傳播[4，5]。更糟糕的是，攜帶耐碳青霉烯類耐藥基因如KPC-2和NDM-1腸桿菌科細(xì)菌的快速增加使臨床治療此類菌感染面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[6，7]。對于CRE的嚴(yán)重感染，臨床可選用的抗菌藥物非常有限，面對如此嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥性，新抗菌藥物的研發(fā)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了臨床的需求，老藥新用受到重視，多黏菌素是目前國際上推薦用于治療多重耐藥革蘭陰性桿菌感染的“最后一道防線”[8-11]。

多黏菌素是20世紀(jì)六七十年代用于治療革蘭陰性桿菌所致的全身感染，但因其具有較大的腎毒性和神經(jīng)毒性而棄用。面對多重耐藥革蘭陰性桿菌感染的廣泛流行，多黏菌素作為最后選擇而被重新用于臨床。過往雖然人類抗感染較少使用多黏菌素，但一些國家在養(yǎng)殖業(yè)一直廣泛使用多黏菌素以用于動(dòng)物疫病的預(yù)防和治療。隨著多黏菌素廣泛使用，其耐藥性的報(bào)道越來越多。革蘭陰性菌對多黏菌素耐藥機(jī)制復(fù)雜多樣，分為先天性耐藥和獲得性耐藥，大量研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒介導(dǎo)是其耐藥率快速上升的重要原因。

1 質(zhì)粒介導(dǎo)黏菌素耐藥基因mcr及其各亞型的特點(diǎn)

2015年底我國學(xué)者[12]首次報(bào)道了從人和動(dòng)物分離的大腸埃希菌中分離到質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素耐藥基因 mcr-1（mobile colistin resistance，mcr-1），隨后在越來越多的CRE菌株中檢出mcr基因，其極大地增加了感染患者的治療難度，使臨床治療面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。更為值得關(guān)注的是，短時(shí)間內(nèi)，不斷有新的mcr基因型別被發(fā)現(xiàn)，且其分布菌種較廣，目前多種mcr基因型別被報(bào)道（包括mcr-2[13]、mcr-3[14]、mcr-4[15]、mcr-5[16]、mcr-6[17]、mcr-7[18]、mcr-8[19]）。這些耐藥基因的突變率很高，每種類型又可細(xì)分為若干亞型，迄今為止，mcr-1和mcr-3被報(bào)道的亞型最多，且均達(dá)十余種亞型。這種多樣性是細(xì)菌適應(yīng)外界抗生素壓力的結(jié)果，可能會導(dǎo)致多黏菌素耐藥水平的增高和傳播能力的增強(qiáng)。

1.1 mcr-1 mcr-1位于IncI2型質(zhì)粒上，它是存在于質(zhì)粒上的一段基因，全長1626bp，GC含量49%，該基因上游有一個(gè)編碼轉(zhuǎn)移酶的基因ISApl1，下游有一個(gè)hp假設(shè)蛋白。mcr-1基因產(chǎn)物是mcr-1蛋白，它屬于磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶家族，mcr-1蛋白降低了多黏菌素與細(xì)胞外膜脂多糖上類脂A的親和力，從而導(dǎo)致細(xì)菌對多黏菌素不敏感。mcr-1含有5個(gè)跨膜的a螺旋并具有2個(gè)催化結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域可以將催化結(jié)構(gòu)域錨定到細(xì)胞質(zhì)膜的表面，完成對類脂A的共價(jià)修飾。到目前為止，已在多個(gè)國家的人類和食源動(dòng)物的多種腸桿菌科細(xì)菌中檢測到mcr-1基因，攜帶mcr-1基因的細(xì)菌可以很好地適應(yīng)各種宿主，并在動(dòng)物和（或）人類之間傳播。mcr-1基因已在腸桿菌科的多個(gè)種屬中發(fā)現(xiàn)，包括大腸埃希菌、產(chǎn)氣腸桿菌、陰溝腸桿菌、阪崎腸桿菌、宋內(nèi)志賀菌、布氏檸檬酸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、克雷伯菌屬和沙門菌屬等細(xì)菌，攜帶mcr-1基因的菌株、質(zhì)粒及其側(cè)翼序列都具有很高的多樣性[20]。更為令人擔(dān)擾的是，近年來，相繼在世界各地發(fā)現(xiàn) mcr-1.1[21]、mcr-1.2[22]、mcr-1.3[23]、mcr-1.4[24]、mcr-1.5[25]、mcr-1.6[26]、mcr-1.7[24]、mcr-1.8、mcr-1.9[27]、mcr-1.10[17]、mcr-1.11、mcr-1.12 等亞型，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了mcr-1各亞型已達(dá)10余種 （表)。Perry等[29]研究證實(shí)質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移已成為mcr基因的主要傳播途徑。從表中可知，Inc X4、Inc 12、Inc H11、IncH12、Inc F、Inc P 等質(zhì)粒都可攜帶 mcr-1及各亞型，其中 Inc X4和Inc 12質(zhì)粒是最主要的傳播質(zhì)粒，攜帶mcr-1及各亞型的菌株最多的是大腸埃希菌，且大多數(shù)菌株為多重耐藥細(xì)菌。

1.2 mcr-2 Xavier等[13]從豬和牛中分離獲得的的耐多黏菌素大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)了一種新的質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素耐藥基因mcr-2，該基因位于IncX4質(zhì)粒上，與mcr-1的核苷酸和氨基酸序列分別有76.7%和81.0%的同源性。此研究發(fā)現(xiàn)mcr-2表達(dá)的蛋白具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中結(jié)構(gòu)域1（殘基1～229）是一種二級膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有將溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上的功能，結(jié)構(gòu)域2（殘基230～538）是脂寡糖磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域；該研究系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)mcr-2可能起源于莫拉菌屬，因mcr-2與脂質(zhì)磷酸酶基因位于質(zhì)粒同一遺傳元件IS1595中，該脂質(zhì)磷酸酶基因與莫拉菌屬的磷酸酶具有高度的同源性。該研究還發(fā)現(xiàn)，在比利時(shí)，從豬身上分離獲得的多粘菌素耐藥大腸桿菌中mcr-2的流行率遠(yuǎn)高于mcr-1，因此，當(dāng)?shù)匦l(wèi)生行政部門應(yīng)加強(qiáng)耐多黏菌素革蘭陰性桿菌中mcr-2篩查的分子流行病學(xué)監(jiān)測。Abuoun等[17]在莫拉菌屬還發(fā)現(xiàn)了mcr-2.1和mcr-2.2突變亞型，mcr-2.1與來自大腸埃希菌中的mcr-2具有98.5%氨基酸的同源性，僅有8個(gè)氨基酸變異；然而mcr-2.2卻有65個(gè)氨基酸發(fā)生了突變，突變率較高，隨后經(jīng)Abuoun等研究證實(shí)，mcr-2.2(1617 bp)即為 mcr-6。

1.3 mcr-3 mcr-3最早是在我國山東省發(fā)現(xiàn)的，Yin等[14]在健康豬糞便分離的大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)了可移動(dòng)質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因mcr-3，該基因與18個(gè)額外的耐藥決定簇共存于大小為261119bp IncHI2型質(zhì)粒中。mcr-3基因全長為1626bp，其與mcr-1和mcr-2的差異較大，其中核苷酸序列與mcr-1和mcr-2只有45.0%和47.0%的同源性，氨基酸序列與mcr-1和mcr-2也只有32.5%和31.7%的相似性。然而，mcr-3氨基酸序列與其他腸桿菌科細(xì)菌和10種氣單胞菌屬細(xì)菌的磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶的同源性分別為99.8%～100%和75.6%～94.8%。mcr-3蛋白具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域1（殘基1-172）含有5個(gè)跨膜β-螺旋，而結(jié)構(gòu)域2（殘基173-541）是包含催化中心的周質(zhì)結(jié)構(gòu)域。該研究發(fā)現(xiàn)的mcr-3與在GenBank數(shù)據(jù)庫中主要在東南亞和北美發(fā)現(xiàn)的腸桿菌科和氣單胞菌中的其他磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶相似，表明移動(dòng)的耐多粘菌素耐藥基因mcr-3可能已經(jīng)廣泛傳播。有研究[30]也報(bào)道發(fā)現(xiàn)4株來自泰國的大腸埃希菌分離株攜帶mcr-3基因，其中3株含為mcr-3.1基因，1株具有編碼單個(gè)氨基酸變異的mcr-3.2基因。到目前為止，mcr-3是突變類型復(fù)雜（其突變亞型僅次于mcr-1，也已達(dá)十余種），涉及菌種較多，傳播范圍較廣的黏菌素耐藥基因。

1.4 mcr-4 Alessandra等[15]首次在意大利豬的盲腸內(nèi)容物中分離的一種耐多黏菌素鼠傷寒沙門菌R3445中發(fā)現(xiàn)了mcr-4基因，該基因位于8749bp的ColE10質(zhì)粒 （命名為pMCR）上，pMCR編碼RepB復(fù)制酶、MobA/L動(dòng)員蛋白和毒素RelE，并與泛菌屬細(xì)菌pPSP_ee2質(zhì)粒顯示99%的核苷酸同源性。在pMCR中，IS5元件側(cè)翼區(qū)域（即mcr-4蛋白）與希瓦菌屬中包含的磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶有82.0%～99.0%的氨基酸序列同源性，并且分別與mcr-1，mcr-2和mcr-3具有34.0%，35.0%和49.0%氨基酸序列同源性。此研究中的11個(gè)mcr-4陽性菌株ColE10復(fù)制酶呈陽性，對多黏菌素顯示MIC≥4mg/L。質(zhì)粒ColE是具有廣泛宿主范圍的質(zhì)粒，可在不同菌種之間播散。因此，在歐洲，對來自人類和食用動(dòng)物的沙門菌和大腸埃希菌，需要立即實(shí)施包括新基因mcr-4在內(nèi)的mcr基因篩選。之后，mcr-4亞型mcr-4.2、mcr-4.3、mcr-4.4等相繼在不同菌株中被發(fā)現(xiàn)。

1.5 mcr-5 2017年，有學(xué)者[16]在 2011-2016年間分離獲得的414株乙型副傷寒沙門菌的14株mcr-1-、mcr-2-和mcr-3陰性的耐黏菌素d-酒石酸發(fā)酵乙型副傷寒沙門菌亞種（Salmonella Paratyphi B dTa+)中，通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)一種新的與轉(zhuǎn)座子相關(guān)的磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶基因mcr-5，其基因全長1644bp，它是Tn3家族7337bp轉(zhuǎn)座子的一部分，該基因通常位于多拷貝ColE型質(zhì)粒上。此外，來自哥倫比亞的大腸埃希菌菌株也顯示攜帶mcr-5基因[15]，mcr-5含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，即1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，1個(gè)硫酸酯酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)未知功能的結(jié)構(gòu)域 (DUFl705)。 mcr-5 與 mcr-1、mcr-2、mcr-3、mcr-4氨基酸序列差異較大，分別只有36.11%、35.29%、34.72%和33.71%的同源性，mcr-5是由小型多拷貝ColE型質(zhì)粒攜帶的，與之前發(fā)現(xiàn)的型別不同，其不攜帶任何參與質(zhì)粒接合相關(guān)的轉(zhuǎn)移基因。然而，在mcr-5硫酸酯酶結(jié)構(gòu)域C末端中包含5 個(gè)保守殘基 (E248、T286、H389、D458 和 H459)，其與 mcr-1、mcr-2、mcr-3 和 mcr-4 中的殘基相同。迄今為止，mcr-5也已發(fā)現(xiàn)有幾種突變亞型。

1.6 mcr-6mcr-6的GenBank登記號為NG-055781，研究發(fā)現(xiàn)[17]，它與來自大腸埃希菌的mcr-2顯示87.9%的氨基酸同源性，具有65個(gè)氨基酸變異，與來自莫拉菌的mcr-2.1顯示87.8%氨基酸同源性，具有66個(gè)氨基酸變異；攜帶mcr-6的莫拉菌屬質(zhì)粒與攜帶mcr-2的大腸埃希菌質(zhì)粒具有85.6%同源性，僅有一小部分（86bp）的PAP2基因在大腸埃希菌中被保留；有趣的是，在含有mcr-6的質(zhì)粒中并沒有找到屬于IS1595系列的插入元件ISEc69。

1.7 mcr-7 Yang等[18]首次從中國小雞分離的3株肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)一種新的質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素耐藥基因mcr-7.1，該基因位于大小為65631bp且包含87個(gè)開放閱讀框 （ORFs）的IncI2質(zhì)粒(pSC20141012)上，與mcr-3基因具有70%的氨基酸同源性。推導(dǎo)出的mcr-7.1基因產(chǎn)物的氨基酸序列具有539個(gè)氨基酸，為磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶。mcr-7.1 蛋白質(zhì)序列與 mcr-1，mcr-2，mcr-3，mcr-4，mcr-5和mcr-6的氨基酸同源性分別為35%，34%，70%，45%，36%和33%。mcr-7.1的結(jié)構(gòu)可分為兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶（硫酸酯酶）（氨基酸231～516）的結(jié)構(gòu)域和跨膜模塊的結(jié)構(gòu)域，其與mcr-3表現(xiàn)出類似的結(jié)構(gòu)。該研究系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示mcr-7.1與mcr-3樣序列具有緊密的遺傳關(guān)系。值得注意的是，幾乎所有mcr-7.1的mcr-3樣序列都來源于氣單胞菌屬。此外，發(fā)現(xiàn)pSC20141012中mcr-7.1上游的ORFs與維氏氣單胞菌中的磷酸二酯酶基因相似。這些發(fā)現(xiàn)表明，就像mcr-3一樣，mcr-7.1起源于氣單胞菌屬。

1.8 mcr-8最新研究[19]來自于豬糞的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌分離株中發(fā)現(xiàn)了一種新的移動(dòng)多黏菌素抗性基因mcr-8，其位于大小為95983bp的Inc-FII型質(zhì)粒上。此mcr-8氨基酸序列與mcr-1，mcr-2，mcr-3，mcr-4，mcr-5，mcr-6 和 mcr-7 的同源性分別 為 31.08% ，30.26% ，39.96% ，37.85% ，33.51% ，30.43%和37.46%，功能性克隆研究表明，攜帶有mcr-8基因的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌均對多黏菌素耐藥。mcr-8含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域1（殘基1～234）含有5個(gè)跨膜α-螺旋，而結(jié)構(gòu)域2（殘基235～565）位于催化中心。該研究顯示，新型mcr-8基因在肺炎克雷伯菌中傳播，更糟糕的是，肺炎克雷伯菌中mcr-8和blaNDM耐藥基因的共存和流行可能通過食物鏈或環(huán)境途徑進(jìn)一步威脅公眾健康。

2 防控策略

抗生素耐藥性被認(rèn)為是21世紀(jì)對人類健康最嚴(yán)重的全球性威脅之一，尤以CRE最為顯著[31，32]。在多黏菌素耐藥機(jī)制中，除染色體和質(zhì)粒介導(dǎo)其耐藥外，外排泵系統(tǒng)、莢膜多糖和細(xì)胞外膜蛋白OprH過度表達(dá)及細(xì)菌形成生物膜等均可能造成細(xì)菌對多黏菌素耐藥[33]。由于質(zhì)粒作為可移動(dòng)DNA相較于染色體DNA更易復(fù)制，且能在不同細(xì)菌之間水平傳播，故革蘭陰性細(xì)菌中編碼磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶的質(zhì)粒攜帶的mcr基因及其亞型是導(dǎo)致多黏菌素耐藥性的重要機(jī)制。迄今為止，八種不同移動(dòng)的質(zhì)粒介導(dǎo)的多黏菌素耐藥基因mcr型別分 別 為 mcr-1(1626bp)、mcr-2(1617bp)、mcr-3(1626bp)、mcr-4(1626bp)、mcr-5(1644bp)、mcr-6(1617bp)、mcr-7(1620bp)和 mcr-8(1698bp)及 其 亞型已在GenBank數(shù)據(jù)庫中登記并注釋。盡管目前大多數(shù)菌株對多黏菌素處于低水平耐藥 (2～16ug/ml)，但大量研究結(jié)果仍提示mcr基因類型復(fù)雜，突變速度較快，且其與其他耐藥基因如blaNDM和blaKPC等共存形成的高度多重耐藥細(xì)菌，將極大地威脅全球公共衛(wèi)生安全，很可能使臨床治療陷入“無藥可用”的境地[34]。因此，迫切需要采取以下策略進(jìn)行防控[35，36]：①應(yīng)大規(guī)模對人類和食源性動(dòng)物進(jìn)行多黏菌素耐藥基因mcr的篩查，以便了解其流行情況和傳播規(guī)律，并評價(jià)其對人類健康產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。②監(jiān)管部門應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)督管理畜牧養(yǎng)殖業(yè)抗生素的使用，定期監(jiān)測，警惕黏菌素耐藥基因的廣泛傳播。③臨床應(yīng)合理使用抗生素，積極采用多種新型組合療法來治療多重耐藥菌引起的感染，以減少臨床對多黏菌素的使用。

表1 多黏菌素耐藥基因mcr-1各亞型的特征