蘇棋 王獻(xiàn)哲 梁聰 李媛媛 何萍

肝癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，我國肝癌的新發(fā)病例和死亡病例約占全球的50%，死亡率僅次于胃癌，而廣西肝癌的發(fā)病率和死亡率遠(yuǎn)高于全國平均水平［1]。目前，肝癌治療主要有手術(shù)、化療和放療等，但均未能獲得滿意的療效，因此新型抗肝癌藥物的篩選仍是目前的研究熱點［2]。從天然產(chǎn)物中尋找有效的抗腫瘤藥物是醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域的主要方向之一。積雪草（Centella asiatica（L）Urban）別名雷公根、崩大碗，野生資源極為豐富，廣泛分布于廣西各個縣市。積雪草酸（asiatic acid，AA）是積雪草中含量較高的烏蘇烷型五環(huán)三萜酸，具有抗炎、抗氧化、保肝、抗腫瘤等多種藥理作用［3]。AA抗瘤譜較廣，可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、非小細(xì)胞肺癌及人高分化肝癌HepG2細(xì)胞等多種組織來源腫瘤細(xì)胞增殖［4-7]。自噬和凋亡作為細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡的2種途徑，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中均發(fā)揮重要作用。自噬是腫瘤細(xì)胞凋亡缺陷下的另一個細(xì)胞死亡開關(guān)，近年一些靶向自噬的研究為抗腫瘤藥物研發(fā)提供了新方向［8]。本研究采用不同濃度AA作用于人低分化肝癌SMMC-7721細(xì)胞株，進(jìn)一步探討AA的抗肝癌效應(yīng)及其可能的自噬機(jī)制，以期為抗癌藥物研發(fā)提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 主要藥品和試劑

AA標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98.6%）購自成都普瑞法科技有限公司，采用0.1%二甲基亞砜（DMSO）溶解AA。DMSO、自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）和細(xì)胞增殖檢測試劑MTT均購自美國Sigma公司。自噬囊泡染色試劑單丹（磺）酰戊二胺（MDC）購自北京索萊寶公司，蛋白RIPA裂解液和BCA法蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物有限公司。LC3、p62、mTOR、p-mTOR、p53、GAPDH 等一抗購自美國Cell Signaling Technology公司，IRDye 680RD熒光二抗購自美國Li-Cor公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人低分化肝癌SMMC-7721細(xì)胞株由廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中心實驗室提供。在含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3 MTT法檢測人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖活性

將SMMC-7721細(xì)胞按5×103/孔接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，設(shè)置0.1%DMSO為對照組。分別采用20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L、50 μmol/L、60 μmol/L的AA處理24 h后，加入5 mg/mL MTT再培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔添加100 μL DMSO以溶解甲贊晶體，用酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度（OD）值，計算各組細(xì)胞增殖抑制率后繪制細(xì)胞生長曲線及計算IC50，并根據(jù)IC50計算結(jié)果選取后續(xù)實驗的AA濃度。細(xì)胞增殖抑制率（%）=［（對照組OD值-實驗組OD值）/對照組OD值] ×100%。為觀察自噬抑制劑3-MA對AA抑制肝癌細(xì)胞增殖作用的影響，采用40 μmol/L AA聯(lián)合10 mmol/L自噬抑制劑3-MA共處理SMMC-7721細(xì)胞，24 h后采用MTT法測定細(xì)胞增殖抑制率，同時設(shè)AA單獨(dú)給藥組和10 mmol/L 3-MA給藥組作為對照。實驗重復(fù)3次。

1.4 MDC染色法檢測人肝癌SMMC-7721細(xì)胞自噬泡的形成

將SMMC-7721細(xì)胞按8×105/孔接種于6孔板中，設(shè)置0.1%DMSO為對照，用40 μmol/L AA處理24 h后，PBS洗滌2次，加入50 μmol/L MDC室溫下避光培養(yǎng)20 min，洗滌2次，在4%多聚甲醛中固定20 min，熒光顯微鏡下觀察紫外光激發(fā)下的MDC熒光變化。實驗重復(fù)3次。

1.5 Western blot檢測人肝癌SMMC-7721細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

將SMMC-7721細(xì)胞按8×105/孔接種于6孔板中，設(shè)置0.1%DMSO為對照，采用40 μmol/L AA處理24 h后，PBS洗滌2次，用RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。7.5%～12.5%SDS-PAGE電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜，蛋白封閉液封閉1 h。加 LC3-I、LC3-II、p62、mTOR、p-mTOR、p53 及 GAPDH 等一抗并以推薦濃度于4℃孵育過夜；次日用TBST洗膜液洗膜3次后加入IRDye 680RD熒光二抗（1∶10 000），室溫孵育60 min。采用ODYSSEY系統(tǒng)和掃膜儀觀察條帶并測量條帶灰度值，以樣本和內(nèi)參GAPDH的比值作為蛋白相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實驗中的計量數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多樣本組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），若整體差異有統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步的兩兩比較采用LSD檢驗；兩樣本均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗進(jìn)行分析；采用一般線性回歸模型分析AA對細(xì)胞抑制率的濃度依賴性。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AA對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響

MTT實驗結(jié)果表明，不同濃度AA孵育24 h后均可抑制SMMC-7721細(xì)胞的增殖，對抑制率和AA濃度進(jìn)行線性回歸分析后，表明AA的抑制作用具有濃度依賴性（F=46.790，P=0.006），見圖 1。IC50=37.313μmol/L，根據(jù)IC50計算結(jié)果，采用40 μmol/L AA進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖1 不同濃度AA處理24 h對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of different concentrations of AA for 24 h on cell proliferation of human hepatoma SMMC-7721 cells

2.2 自噬抑制劑3-MA對AA抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖作用的影響

如圖2所示，10 mmol/L 3-MA作用后細(xì)胞抑制率為（19.000±4.637）%，40 μmol/L AA 作用后細(xì)胞抑制率為（46.400±9.099）%，10 mmol/L 3-MA 與 40 μmol/L AA聯(lián)用組作用后細(xì)胞抑制率為（22.000±3.391）%，組間抑制率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=29.256，P＜0.001）。進(jìn)一步多重比較發(fā)現(xiàn)，與40 μmol/LAA單獨(dú)作用相比，聯(lián)用組的細(xì)胞增殖抑制率明顯降低（P＜0.001）；聯(lián)用組與10 mmol/L 3-MA單獨(dú)作用相比，細(xì)胞增殖抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.460）。

圖2 自噬抑制劑3-MA對AA抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖作用的影響Fig.2 Influence of autophagy inhibitor 3-MA on antiproliferation effect of AA in human hepatoma SMMC-7721 cells

2.3 AA對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞自噬泡形成的影響

MDC染色結(jié)果在熒光顯微鏡下可見，DMSO對照組細(xì)胞內(nèi)存在散在綠色熒光點；40 μmol/L AA處理24 h后，SMMC7721細(xì)胞MDC染色標(biāo)記的熒光顆粒明顯增多并聚集成團(tuán)塊狀，且熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明AA能增加自噬泡的形成。見圖3。

圖3 MDC染色觀察AA對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞自噬泡形成的影響（×400）Fig.3 Effect of AA on the formation of autophagic vacuoles of human hepatoma SMMC-7721 cells by MDC staining（×400）

2.4 AA對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，40 μmol/L AA處理24 h能明顯降低LC3-I的蛋白表達(dá)和提高LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)，p62蛋白和p-mTOR蛋白表達(dá)降低，但對mTOR和p53蛋白表達(dá)無明顯影響。見圖4、表1。

表1 AA對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響［（±s），n=3] Tab.1 Effects of AA on the relative expression levels of autophagy-related proteins of human hepatoma SMMC-7721 cells［（±s），n=3]

表1 AA對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響［（±s），n=3] Tab.1 Effects of AA on the relative expression levels of autophagy-related proteins of human hepatoma SMMC-7721 cells［（±s），n=3]

Relative expression of proteins LC3-I LC3-II p62 mTOR Group p-mTOR p53 Control 1.744±0.108 0.113±0.031 0.522±0.024 1.713±0.111 40 μmol/L AA 1.529±0.065 0.380±0.036 0.123±0.019 1.556±0.076 t 2.928 -9.754 22.565 1.555 P 0.043 ＜0.001 ＜0.001 0.190 1.252±0.039 0.671±0.040 0.353±0.028 0.726±0.055 30.775 -1.555＜0.001 0.210

圖4 Western blot檢測AA對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 EffectsofAA on theexpression ofautophagy-related proteins of human hepatoma SMMC-7721 cells by Western blot

3 討論

目前腫瘤化療藥物大多通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，但因腫瘤發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞凋亡功能缺陷有關(guān)，導(dǎo)致腫瘤對化療藥物的敏感性存在很大差異，因此尋求凋亡以外的替代或聯(lián)合治療方案迫在眉睫［8]。積雪草酸是傳統(tǒng)壯藥積雪草的主要活性成分之一，研究發(fā)現(xiàn)AA具有巨大的抗癌潛力，但目前對AA作用于肝癌的作用方式及機(jī)制報道較少。本研究采用不同濃度AA作用人低分化肝癌SMMC-7721細(xì)胞株，MTT檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度AA作用24 h后均可抑制細(xì)胞增殖，且呈濃度依賴性，說明AA發(fā)揮了抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞的作用，但具體作用機(jī)制不明。

自噬常被饑餓、蛋白質(zhì)聚集和其他形式應(yīng)激（如氧化應(yīng)激）誘導(dǎo)，而肝癌細(xì)胞的高繁殖能力可導(dǎo)致持續(xù)性的炎癥和高氧化應(yīng)激，從而誘導(dǎo)自噬。研究發(fā)現(xiàn)自噬在肝癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，且具有抑制或促進(jìn)肝癌的雙重性。自噬誘導(dǎo)劑和自噬抑制劑在肝癌治療中凸顯巨大潛力，自噬誘導(dǎo)劑索拉非尼是目前臨床的一線抗肝癌藥物，而自噬抑制劑3-MA和氯喹則可抑制肝癌腫瘤生長［9]。耿驥等［10]研究發(fā)現(xiàn)AA可誘導(dǎo)人HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)自噬。WU等［6]報道AA可在人A549非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株誘導(dǎo)保護(hù)性自噬。本研究基于AA作用的IC50為37.31 μmon/L，故選取40 μmon/L AA聯(lián)合自噬抑制劑3-MA作用肝癌SMMC-7721細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)40 μmon/L作用比較，聯(lián)合作用后細(xì)胞增殖抑制率顯著降低，但與10 mmol/L 3-MA單獨(dú)作用相比，聯(lián)用組細(xì)胞增殖抑制率無明顯變化，說明3-MA可部分逆轉(zhuǎn)AA對SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用，認(rèn)為AA可能通過誘發(fā)自噬而抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖。

MDC是自噬囊泡示蹤劑，能與自噬囊泡膜上的泛素樣結(jié)合系統(tǒng)（Atg8）特異性結(jié)合，尤其對處于物質(zhì)降解階段的晚期自噬有特異性［11]。LC3是公認(rèn)的自噬標(biāo)志物，自噬形成時，胞漿型LC3（即LC3-I）可酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば妥允审wLC3（即LC3-Ⅰ），LC3-Ⅱ的含量與自噬程度成正比，而LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可估計自噬水平的高低［8]。自噬底物蛋白p62是泛素結(jié)合蛋白，在多種細(xì)胞和組織均表達(dá)，與自噬活性成反比，可間接反映自噬活性。為進(jìn)一步觀察AA如何影響自噬，本研究進(jìn)行細(xì)胞MDC染色實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)40 μmol/L AA處理24 h可明顯增加自噬泡的形成；Western blot檢測自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅰ、LC3-Ⅱ及p62蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，40 μmon/L AA處理24 h后可明顯降低SMMC-7721細(xì)胞LC3-Ⅰ表達(dá)和提高LC3-Ⅱ表達(dá)，降低p62的表達(dá)，表明AA作用后提高了LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，可誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生自噬。

mTOR信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和自噬最重要的信號通路之一，受PI3K/Akt、AMPK等多個上游信號通路調(diào)控［12]?；罨膍TOR可磷酸化ULK1和ATG13，使自噬啟動因子ULK1-ATG13-FIP2000復(fù)合體失去活性而發(fā)揮抑制自噬的作用［8]。本研究中，40 μmol/L AA處理24 h后可明顯降低SMMC-7721細(xì)胞和p-mTOR蛋白的表達(dá)，表明AA可能通過負(fù)調(diào)控mTOR通路誘發(fā)SMMC-7721細(xì)胞產(chǎn)生自噬，但尚需聯(lián)合該通路的激活劑和抑制劑進(jìn)一步驗證。

抑癌基因p53基因是凋亡激活因子，研究發(fā)現(xiàn)p53也參與自噬的調(diào)節(jié)［13]。p53蛋白因其細(xì)胞內(nèi)定位不同而功能各異，在細(xì)胞核內(nèi)可促進(jìn)自噬，而在細(xì)胞質(zhì)中主要發(fā)揮抑制作用，且多與mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)［14]。本研究并未發(fā)現(xiàn)AA對p53蛋白的表達(dá)有顯著影響，推測AA可能通過非p53依賴方式誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞產(chǎn)生自噬。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)AA能抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖，可能與其通過非p53依賴的方式負(fù)調(diào)控mTOR通路誘發(fā)自噬有關(guān)，AA有望作為抗肝癌的新靶點，后續(xù)將聯(lián)合應(yīng)用多種自噬抑制劑及信號通路抑制劑、激動劑，并從細(xì)胞和動物多方面進(jìn)一步深入探討AA誘發(fā)自噬與其抗肝癌作用的關(guān)系及其作用機(jī)制。