李芳穎 鄂穎 井明晰 徐君南 孫濤

肺癌是我國(guó)發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤［1]。得益于精準(zhǔn)診治和個(gè)體化治療，肺癌患者總體生存近幾年得到顯著改善。肺癌靶向治療實(shí)際遵循的原理是在肺癌人群中篩選有表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變的患者，使用 EGFR酪氨酸激活抑制劑（TKI）靶向藥物治療，但EGFR單基因檢測(cè)并不適用于指導(dǎo)所有的靶向藥物，可能導(dǎo)致患者因檢測(cè)不充分而喪失靶向治療的機(jī)會(huì)。基因檢測(cè)和二代測(cè)序的推廣和普及，可預(yù)測(cè)接受靶向治療或者免疫治療患者的敏感性，從而調(diào)整治療方案［2]。腫瘤組織活檢是腫瘤基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)，但在實(shí)際臨床診療中，組織活檢往往難以獲得具有代表性的標(biāo)本?；诃h(huán)化單分子擴(kuò)增和重測(cè)序技術(shù)（cSMART）技術(shù)的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）基因突變檢測(cè)，僅需抽取10 mL靜脈血即可檢測(cè)，安全、簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)傷，且可避免腫瘤異質(zhì)性導(dǎo)致的檢測(cè)結(jié)果偏差［3]。但目前有關(guān)該技術(shù)在臨床實(shí)際中應(yīng)用于指導(dǎo)靶向治療的報(bào)道尚較少見。本研究基于NSCLC患者cSMART技術(shù)檢測(cè)ctDNA基因突變，探討其驅(qū)動(dòng)基因突變分布及其對(duì)靶向治療敏感性的影響，以期為今后的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2016年7月至2018年12月遼寧省腫瘤醫(yī)院腫瘤收治的NSCLC患者107例。所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)確診，年齡≥18歲，自愿行cSMART技術(shù)檢測(cè)，簽署知情同意書。107例患者中因血液樣本量采集不足而測(cè)序失敗1例，結(jié)果共檢測(cè)106例，其中男性79例，女性27例，中位年齡54歲，Ⅱ期2例，Ⅳ期104例，其中Ⅳ期患者中位治療線數(shù)為三線（一線～六線）。中位隨訪時(shí)間為14.0個(gè)月（范圍3～29個(gè)月）。

1.2 方法

1.2.1 血液樣本收集及處理 于治療基線晨起空腹采集外周血液10 mL，靜脈穿刺取匹配的10 mL血液樣本，采集于 Streck 管中（Streck Inc，San Francisco，CA）。采用QIAamp循環(huán)核酸試劑盒（Qiagen，Hilden，Germany）從2 mL純化血漿中制備cSMART檢測(cè)用DNA。QubitdsDNA HS檢測(cè)試劑盒（Life Technologies，Eugene，OR）檢測(cè)純化DNA的濃度。106例患者血漿樣本中，2 mL血漿中DNA的回收量為11.2～1 006.0 ng，中位值為40.6 ng。

1.2.2cSMART技術(shù)檢測(cè)血清中ctDNA基因突變 經(jīng)cSMART技術(shù)檢測(cè)患者血清中EGFR、ALK、KRAS、BRAF、PIK3CA、TP53、ROS1、RET、MET 共 9 種驅(qū)動(dòng)基因的突變情況。上述DNA采用新型cSMART同步檢測(cè)和定量分析設(shè)計(jì)的熱點(diǎn)驅(qū)動(dòng)突變。熱點(diǎn)驅(qū)動(dòng)的突變變異體包括但不局限于以下常見位點(diǎn)：EGFR G719X（3個(gè)變異體，G719A/C/S）、外顯子 19缺失（16變異種）、外顯子20插入（3個(gè)變異體）、S768I、T790M、C797S、L858R 和 L861Q；KRAS中 G12A/C/D/R/S/V（6個(gè)變異體，G12X）、G13D、Q61E/H/K/L/P/R（6個(gè)變異體，Q61X）、A146T/P/V（3 個(gè)變異體，A146X）；ERBB2外顯子20插入（5個(gè)變異體）；BRAF和ALK融合體中V600D/E/K/R（4個(gè)變異體，V600X）。在 EGFR、KRAS、ERBB2、BRAF、ALK基因外顯子序列中定位靶向引物的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)cSMART檢測(cè)新突變。cSMART檢測(cè)是為檢測(cè)驅(qū)動(dòng)血漿突變?cè)O(shè)計(jì)，即DNA文庫(kù)使用從2 mL血漿中提取的總片段DNA模板構(gòu)建。DNA分子末端修飾30個(gè)核苷酸，然后連接50個(gè)T'PCR引物。使用熱穩(wěn)定性校正Pfu DNA聚合酶，通過(guò)15個(gè)PCR周期生成文庫(kù)，測(cè)序錯(cuò)誤率約為1/105核苷酸。DNA分子變性成單鏈后，用與PCR適配器互補(bǔ)的端序列合成的橋接寡核苷酸，以及Taq連接酶促進(jìn)連接介導(dǎo)的循環(huán)。采用四堿基神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)編碼設(shè)計(jì)橋接寡核苷酸，隨機(jī)而獨(dú)特地對(duì)文庫(kù)中的每個(gè)等離子體分子進(jìn)行編碼。然后利用位于突變位點(diǎn)20～48 bp的引物對(duì)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse PCR）擴(kuò)增環(huán)化單鏈分子內(nèi)的熱點(diǎn)突變，以確保突變檢測(cè)的最大靈敏度和特異性。采用40對(duì)多重逆轉(zhuǎn)錄引物對(duì)9種驅(qū)動(dòng)基因的熱點(diǎn)突變位點(diǎn)進(jìn)行定位。逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)生的等位基因在MiSeq平臺(tái)（Illumina，San Diego，CA）上進(jìn)行配對(duì)末端測(cè)序。相同起始和停止位置的重復(fù)或高階讀序列，通過(guò)其獨(dú)特的條形碼區(qū)分，并且僅計(jì)數(shù)一次以糾正PCR偏差。所有符合這些質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的突變分子均被計(jì)數(shù)。

1.3 療效評(píng)價(jià)

治療方案包括吉非替尼、厄洛替尼、奧希替尼等針對(duì)EGFR TKI靶向治療34例，克唑替尼等針對(duì)ALK TKI靶向治療2例，化療23例，納武單抗針對(duì)PD-1的免疫治療1例，貝伐單抗抗血管生成靶向治療聯(lián)合化療14例，無(wú)后續(xù)治療4例。采用RECIST 1.1標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估化療療效，分為完全緩解（CR）：治療后腫瘤病灶完全消失；部分緩解（PR）：腫瘤病灶大小縮小≥30%，且無(wú)新病灶出現(xiàn)；疾病穩(wěn)定（SD）：腫瘤病灶大小無(wú)明顯變化，包括腫瘤病灶大小縮小不到30%或增大不到20%；疾病進(jìn)展（PD）：腫瘤病灶大小增大≥20%或出現(xiàn)新病灶。無(wú)疾病進(jìn)展生存期（PFS）定義為自用藥至疾病進(jìn)展或死亡的時(shí)間，總生存期（OS）定義為從用藥或基因檢測(cè)時(shí)至死亡的時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)表示。Kaplan-Meier法分析生存率并繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基于cSMART技術(shù)檢測(cè)NSCLC患者ctDNA 9種基因的突變分布

106例NSCLC患者中基因突變78例（73.58%），無(wú)突變28例（26.42%）?；蛲蛔兊?8例患者中，單基因突變 27例（34.62%），雙基因突變 24例（30.77%），3基因突變11例（14.10%），4基因突變5例（6.41%），5基因突變5例（6.41%）?；颊咧形恢委熅€數(shù)為三線（范圍為Ⅱ期手術(shù)術(shù)后無(wú)治療2例，Ⅳ期晚期治療線數(shù)范圍為一線～六線）。

2.2 基于cSMART技術(shù)檢測(cè)NSCLC患者ctDNA 9種基因突變頻數(shù)分布

106例NSCLC患者9種基無(wú)突變26人次，累計(jì)突變160人次，其中EGFR突變共計(jì)61人次，ALK突變共計(jì)11人次（包括ALK融合和點(diǎn)突變），TP53和KRAS突變分別為54人次和26人次，PIK3CA基因突變5人次，BRAF、MET和ERBB2發(fā)生基因突變各1人次。

2.3 基于cSMART技術(shù)檢測(cè)NSCLC EGFR和ALK基因的突變分布

EGFR突變共計(jì)61人次，進(jìn)一步分析EGFR基因突變分布，發(fā)現(xiàn)其常見突變?yōu)?9外顯子缺失和L858R突變，分別占31%和25%。部分患者經(jīng)EGFR TKI治療后，T790M突變占17%，C797S突變占3%，T790M與C797S突變共存1人次。罕見突變G719X、S768I和L861Q突變占13%，所有突變均與其他罕見突變或常見突變（如19外顯子缺失或L858R突變等）合并存在。EGFR 20外顯子插入突變占8%，但無(wú)前端氨基酸 763_764插入（可能TKI敏感突變），存在V769_D770in-sASV、D770＞DH 和 N771＞NH 突變。R831H和L707W突變2人次。

ALK基因突變共計(jì)11人次，其中ALK融合6人次，ALK點(diǎn)突變5人次；無(wú)ALK融合與ALK點(diǎn)突變共存，存在EGFR或TP53等基因突變與ALK融合或ALK點(diǎn)突變共存,其中ALK融合包括EML4-ALK 3人次、VIT-ALK、CLIP1-ALK和KIF5B-ALK各1人次，ALK點(diǎn)突變包括S1206Y 3人次、G1269A和F1174L各1人次。

2.4 不同基因突變NSCLC患者的生存情況

106例NSCLC患者經(jīng)cSMART技術(shù)檢測(cè)ctDNA 9種基因突變后，生存信息完整共71例，中位隨訪時(shí)間為14.0個(gè)月（3.0～29.0個(gè)月）。無(wú)基因突變患者的中位PFS為6.0個(gè)月（1.5～15.0個(gè)月），單基因突變患者中位PFS為4.5個(gè)月（1.0～25.5個(gè)月），雙基因突變患者中位PFS為5.0個(gè)月（1.0～18.0個(gè)月），3基因突變患者中位PFS為9.5個(gè)月（2.0～29.5個(gè)月），4基因突變患者中位PFS為10.5個(gè)月（8.0～16.0個(gè)月），5基因突變患者的中位PFS為4.0個(gè)月（2.0～9.0個(gè)月），見圖1。

圖1 不同基因突變NSCLC患者的生存情況Fig.1 Survival prognosis of patients with different driven gene mutations of NSCLC

2.5 基于NCCN指南和9種基因檢測(cè)結(jié)果治療的療效

57例生存信息完整且完成后續(xù)治療的NSCLC患者，根據(jù)NSCLC NCCN指南和9種基因檢測(cè)結(jié)果選擇治療方案，其中按照指導(dǎo)方案治療的患者歸為規(guī)范治療組（n=39），未按照指導(dǎo)方案治療的患者歸為非規(guī)范治療組（n=18）。規(guī)范治療患者的中位PFS為10.0個(gè)月（95%CI：0.36～10.64個(gè)月），非規(guī)范治療組中位 PFS為 5.5個(gè)月（95%CI：7.46～12.54個(gè)月），規(guī)范治療組患者的PFS曲線與非規(guī)范治療組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.420，P=0.011）。見圖 2。

圖2 規(guī)范治療與非規(guī)范治療NSCLC患者的無(wú)疾病進(jìn)展生存曲線Fig.2 Progression-free survival curves of standard or nonstandard treatment patients with NSCLC

2.6 NSCLC EGFR/ALK突變患者的療效

57例生存信息完整且完成后續(xù)治療的患者，選擇其中具有代表性的5例進(jìn)一步解析。病例1初診為右肺上葉周圍性肺癌，伴縱膈淋巴結(jié)和鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，穿刺病理結(jié)果為腺上皮異型增生癌變，cSMART檢測(cè)結(jié)果為EGFR L858R突變合并L707W少見突變，應(yīng)用一代TKI吉非替尼治療，PFS為16個(gè)月，目前仍繼續(xù)吉非替尼靶向治療。

病例2初診肺部繼發(fā)性惡性腫瘤cT2N2M1 IV期，雙肺多發(fā)結(jié)節(jié)灶、左側(cè)胸腔積液，縱膈及左側(cè)腋窩淋巴結(jié)腫大，cSMART技術(shù)檢測(cè)9種基因結(jié)果顯示EGFR L861Q（豐度 0.02%，1/4 486）和 EML-ALK4融合（豐度0.09%，3/3 473），存在EGFR罕見突變L861Q和EML-ALK融合，且EML-ALK融合的突變豐度略高，可能作為驅(qū)動(dòng)基因。另外EGFR罕見突變L861Q，易與S861I突變和G719X突變合并存在，阿法替尼對(duì)治療療效較好，尤其是對(duì)2個(gè)罕見突變并存或者單個(gè)罕見突變合并常見突變（19外顯子缺失或L858R突變）患者的療效更佳，而該患者僅L861Q單個(gè)EGFR突變，且2016年阿法替尼未獲批用于EGFR罕見突變。因此，推薦應(yīng)用針對(duì)ALK融合的第一代TKI克唑替尼，但患者自行決定應(yīng)用吉非替尼，2個(gè)月后疾病快速進(jìn)展并死亡。

病例3為左肺腺癌（混合亞型，以乳頭狀腺癌為主，中低分化），左肺癌術(shù)后9年和骨轉(zhuǎn)移4年，五線治療時(shí)基線行基因檢測(cè)。病例4為肺癌合并骨轉(zhuǎn)移30個(gè)月，病理示腺癌局部伴黏液腺癌，于三線治療基線時(shí)行基因檢測(cè)。均是多線治療后基因檢測(cè)結(jié)果為EGFR敏感（19外顯子缺失和L858R突變）合并EGFR T790M耐藥突變，以及ALK點(diǎn)突變（S1206Y和G1269A）。病例3既往行化療（一線PFS為7個(gè)月、三線PFS為6個(gè)月，四線PFS為4個(gè)月）、放療和吉非替尼（二線PFS為4個(gè)月）治療，根據(jù)基因檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用奧希替尼治療，療效達(dá)PR，PFS高達(dá)31.5個(gè)月，目前仍繼續(xù)奧希替尼治療。病例4根據(jù)基因檢測(cè)結(jié)果給予三線GP方案化療，PFS達(dá)6個(gè)月，OS為11個(gè)月。病例5為右肺腺癌，術(shù)后1年余合并骨轉(zhuǎn)移后，一線培美曲塞聯(lián)合卡鉑治療3周期后進(jìn)展，EGFR單基因檢測(cè)顯示EGFR 19外顯子缺失，二線吉非替尼治療PFS為13個(gè)月。進(jìn)展后基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)T90M突變，應(yīng)用奧希替尼治療PFS為9個(gè)月；再次進(jìn)展后行cSMART動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示EGFR 19外顯子缺失、T790M突變合并C797S突變，建議奧希替尼聯(lián)合吉非替尼兩個(gè)靶向治療，但患者拒絕后行貝伐珠單抗聯(lián)合TC方案治療，PFS為16個(gè)月，OS為22個(gè)月。

3 討論

腫瘤組織活檢即通過(guò)手術(shù)或穿刺獲取腫瘤最有代表性部位的組織作為檢測(cè)標(biāo)本，是腫瘤基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)，但由于腫瘤異質(zhì)性，腫瘤組織活檢難以獲得具有代表性的標(biāo)本，對(duì)患者的治療指導(dǎo)價(jià)值有限［4]。目前，包括CEA在內(nèi)的腫瘤標(biāo)志物尚不能評(píng)估晚期肺癌的治療療效，而影像學(xué)監(jiān)測(cè)腫瘤疾病進(jìn)展至少需化療2～4個(gè)療程。因此，臨床上亟待探索NSCLC早期評(píng)估靶向或免疫治療療效的生物標(biāo)志物，以精準(zhǔn)指導(dǎo)后續(xù)治療方案。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）、ctDNA、外泌體和腫瘤血小板作為液體活檢重要的組成部分，在臨床應(yīng)用越來(lái)越廣泛，已成為組織活檢的有效補(bǔ)充，有助于NSCLC的精準(zhǔn)診斷和治療［5-6]。

ctDNA是由腫瘤細(xì)胞釋放到血漿中的單鏈或雙鏈DNA片段，大小為160～180 bp，攜帶與腫瘤組織一致的分子遺傳信息。腫瘤組織活檢為侵入性，且耗時(shí)費(fèi)力，因此基于ctDNA的液體活檢成為一種替代或互補(bǔ)的方法［7]?；赾SMART技術(shù)的昂科益非小細(xì)胞肺癌基因突變檢測(cè)，僅需抽取患者10 mL靜脈血液即可進(jìn)行基因檢測(cè)，安全、簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)傷，且可避免腫瘤異質(zhì)性導(dǎo)致的檢測(cè)結(jié)果偏差。采用和瑞自主研發(fā)的DNA富集檢測(cè)技術(shù)cSMART，檢測(cè)靈敏度達(dá)3/10 000，平均測(cè)序深度達(dá)40000x，可絕對(duì)定量檢測(cè)患者攜帶的多個(gè)藥物相關(guān)基因突變，指導(dǎo)靶向用藥，保證用藥的準(zhǔn)確性和有效性［4，8]。PéCUCHET 等［7]利用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行ctDNA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其可有效評(píng)估晚期NSCLC患者預(yù)后。本研究基于cSMART技術(shù)檢測(cè)106例NSCLC 患者血清中 EGFR、ALK、KRAS、BRAF、PIK3CA、TP53、ROS1、RET、MET共9種驅(qū)動(dòng)基因的突變情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因突變78例，無(wú)突變28例，值得注意的是，無(wú)突變28例中包括2例術(shù)后輔助治療患者，且隨著分期ctDNA量有所差異，靶向治療如奧希替尼有效治療后ctDNA含量亦下降，提示液體活檢ctDNA測(cè)定基因突變?cè)谛g(shù)后輔助和靶向治療有效后易發(fā)生基因突變陰性，因此應(yīng)在治療基線行液體活檢基因突變檢測(cè)。驅(qū)動(dòng)基因突變的78例患者中，單基因突變27例，雙基因突變24例，3基因突變11例，4基因突變5例，5基因突變5例。106例NSCLC患者累計(jì)突變186人次，其中EGFR突變最多，共計(jì)61人次，其分布較我國(guó)常見報(bào)道略低［9]，而ALK突變共計(jì)11人次，高于我國(guó)常見ALK突變發(fā)生率，造成這些差異可能與本研究統(tǒng)計(jì)EGFR、ALK人次而非例數(shù)有關(guān)。此外，TP53和KRAS突變各占28%和13%，罕見突變PIK3CA、BRAF、MET和 ERBB2發(fā)生基因突變各占3%、1%、1%和1%。后續(xù)隨訪中，57例患者生存信息完整且完成后續(xù)治療，根據(jù)NSCLC NCCN指南和ctDNA檢測(cè)結(jié)果指導(dǎo)患者治療方案，結(jié)果發(fā)現(xiàn)按照指導(dǎo)方案規(guī)范治療的患者中位PFS明顯較非規(guī)范治療患者長(zhǎng)，提示檢測(cè)ctDNA識(shí)別驅(qū)動(dòng)突變，對(duì)實(shí)現(xiàn)NSCLC精準(zhǔn)治療具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，與多項(xiàng)研究［9-10]結(jié)果一致。

本研究進(jìn)一步解析5例具有代表性患者的基因突變與治療的療效，其中病例1提示EGFR L858R突變合并L707W少見突變應(yīng)用一代EGFR TKI療效較好。病例2針對(duì)驅(qū)動(dòng)基因突變?yōu)镋GFR罕見突變L861Q和EML-ALK融合，且EML-ALK融合的突變豐度略高，選擇針對(duì)ALK融合的第二代TKI布加替尼（針對(duì)ALK和EGFR兩個(gè)靶點(diǎn)）療效更佳。此外，不同ALK TKI抑制劑除了ALK融合靶點(diǎn)外，附加的靶點(diǎn)有所不同（克唑替尼：ROS1；阿萊替尼：RET和LTK；布加替尼：EGFR突變和ROS1；色瑞替尼：IGFR1、IR 和 ROS1；Enterctinib：NTRKs和 ROS1；勞拉替尼：ROS1和ALK點(diǎn)突變G1202R），提示初診基因突變檢測(cè)結(jié)果為多個(gè)驅(qū)動(dòng)基因合并，需要考量突變豐度以及靶向治療的靶點(diǎn)。病例3和病例4均為多線治療后基因檢測(cè)結(jié)果為EGFR敏感（19外顯子缺失和L858R突變）合并EGFR T790M耐藥突變，以及ALK點(diǎn)突變（S1206Y和G1269A），值得思考的是，T790M突變?yōu)槌Ｒ姷哪退幫蛔儯瑧?yīng)用三代TKI奧希替尼療效較好。另外C797S作為T790M應(yīng)用奧希替尼的耐藥突變，可考慮奧希替尼聯(lián)合一代TKI或嘗試貝伐珠單抗聯(lián)合化療等。

綜上所述，基于cSMART技術(shù)測(cè)定ctDNA識(shí)別NSCLC的基因突變具有簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的優(yōu)勢(shì)，其中EGFR及ALK為NSCLC患者常見驅(qū)動(dòng)基因突變，針對(duì)其靶向治療療效較好，在臨床上具有促進(jìn)NSCLC精準(zhǔn)治療的價(jià)值。期待基于cSMART技術(shù)測(cè)定ctDNA的基因突變助力NSCLC的精準(zhǔn)治療，改善患者的生存和生活質(zhì)量。