張佳音，王啟宇，梁 紅，孫凱霞，張治國(guó)

(1.哈爾濱學(xué)院工學(xué)院，哈爾濱 150086；2.哈爾濱師范大學(xué)物理與電子工程學(xué)院，哈爾濱 150025；3.哈爾濱工業(yè)大學(xué)凝聚態(tài)科學(xué)與技術(shù)研究所，哈爾濱 150001)

1 引 言

光動(dòng)力療法作為腫瘤的一種微創(chuàng)性治療方法，受到了廣泛關(guān)注[1-2]。與臨床上常用的腫瘤治療方法(手術(shù)、化療、放療)相比，光動(dòng)力療法具有更高的選擇性，微創(chuàng)性，無(wú)并發(fā)癥等優(yōu)勢(shì)[3-5]。光動(dòng)力療法包含三個(gè)要素：光、光敏劑、及氧氣。當(dāng)特定波長(zhǎng)的光激發(fā)光敏劑會(huì)產(chǎn)生活性氧(ROS)，可以殺死腫瘤細(xì)胞[6-7]。其中，光敏劑是實(shí)施高效的光動(dòng)力治療過程的關(guān)鍵因素。傳統(tǒng)光敏劑卟啉類衍生物已經(jīng)進(jìn)入了光動(dòng)力療法的臨床應(yīng)用。然而傳統(tǒng)光敏劑的激發(fā)光在可見光譜范圍內(nèi)，組織對(duì)這部分光的吸收很強(qiáng)，激發(fā)光在組織中的穿透深度較差，導(dǎo)致光動(dòng)力療法只適用于表皮性腫瘤的治療[8-9]。

生物組織在近紅外區(qū)750～1000 nm范圍內(nèi)有“光學(xué)透過窗”[10,11]。組織對(duì)這部分光的吸收和散射很弱，在組織中的穿透深度很深。所以人們一直在開發(fā)近紅外光激發(fā)的光敏劑。雙光子過程可以實(shí)現(xiàn)近紅外光激發(fā)，可實(shí)現(xiàn)深組織激發(fā)[12]。然而，雙光子激發(fā)的熒光材料吸收截面小，需要較高能量的脈沖激光激發(fā)，超出了臨床應(yīng)用的安全范圍[13]。2007年，Zhang等[14]提出了利用上轉(zhuǎn)換納米粒子結(jié)合傳統(tǒng)光敏劑開展光動(dòng)力療法，實(shí)現(xiàn)了980 nm近紅外光激發(fā)的光動(dòng)力療法。具體地，980 nm近紅外光激發(fā)Yb3+離子，通過能量傳遞上轉(zhuǎn)換過程使Er3+的高能激發(fā)態(tài)布局，然后Er3+產(chǎn)生的540 nm上轉(zhuǎn)換熒光激發(fā)傳統(tǒng)光敏劑，傳統(tǒng)光敏劑再與O2發(fā)生作用，產(chǎn)生ROS的過程。雖然上轉(zhuǎn)換光動(dòng)力過程將激發(fā)光波長(zhǎng)轉(zhuǎn)移到了近紅外區(qū)，但是上轉(zhuǎn)換光動(dòng)力療法需要復(fù)雜的能量傳遞過程，引入了很大的無(wú)輻射弛豫損耗，效率較低[15-16]。同時(shí)，光敏劑載藥和釋放可控性差，阻礙臨床應(yīng)用[17]。

最近，NaYbF4納米晶作為一種新型的近紅外激發(fā)的無(wú)機(jī)光敏劑被提出。Yb3+激發(fā)態(tài)能量(1.27 eV)稍高于ROS的激發(fā)態(tài)能量(0.97 eV)，在980 nm光的激發(fā)下，處于激發(fā)態(tài)Yb3+可將能量傳遞給O2，形成ROS。NaYbF4納米晶作為光敏劑具有近紅外光激發(fā)，能量傳遞效率高、穩(wěn)定性好、無(wú)需載藥可控性好等優(yōu)點(diǎn)，有實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用的潛質(zhì)[18]。本文針對(duì)NaYbF4納米晶這一新型納米晶的光物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行優(yōu)化。NaYbF4納米晶的ROS的產(chǎn)生速率很可能和納米晶與氧之間的接觸面積有關(guān)，這里我們通過調(diào)節(jié)納米晶的尺寸，來改變納米晶的比表面積，探究NaYbF4納米晶的尺寸的調(diào)節(jié)來探究NaYbF4納米晶的尺寸對(duì)ROS產(chǎn)生速率的影響，得到優(yōu)化的NaYbF4納米晶，提高ROS產(chǎn)生效率。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 儀器與試劑

六水氯化鐿YbCl3·6H2O(99.9%，購(gòu)買于Sigma-Aldrich)，油酸 (純度≧99%，購(gòu)買于Sigma-Aldrich)，十八烯(純度90%，購(gòu)買于Sigma-Aldrich)，氮?dú)?購(gòu)買于哈爾濱黎明氣體有限公司，99.999%)，甲醇、環(huán)己烷和乙醇(購(gòu)買于天津富宇化學(xué)試劑公司，分析純)，氫氧化鈉NaOH(純度≧98%，購(gòu)買于Sigma-Aldrich)，氟化銨NH4F(純度≧98%，購(gòu)買于Sigma-Aldrich)。

2.2 樣品的制備方法

納米晶制備采用熱解法，這種合成方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)納米晶的形貌、尺寸及晶相的可控合成，具體的合成過程參考已報(bào)道過的方法[19]：首先，將1 mmol的YbCl3·6H2O，6 mL油酸和15 mL十八烯放入三口瓶中，通入氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣，將反應(yīng)液攪拌加熱到160 ℃，恒溫1 h，反應(yīng)液變澄清，此時(shí)認(rèn)為YbCl3·6H2O完全溶解。然后，將反應(yīng)液降溫至50 ℃，注入NaOH(0.1 g)和NH4F(0.148 g)的甲醇混合液 10 mL，在此溫度恒溫?cái)嚢?0 min，進(jìn)一步加熱到80 ℃，蒸發(fā)掉反應(yīng)液中的甲醇和水分。最后，將溫度升高至納米晶的形成溫度300 ℃，恒溫一段時(shí)間。關(guān)閉加熱裝置，自然冷卻到室溫，在反應(yīng)液中加入乙醇，使納米晶沉淀，然后5000 r/min離心，離心后的粒子進(jìn)一步用環(huán)己烷和乙醇的混合溶液清洗，將表面多余的離子和油酸清洗掉，反復(fù)清洗三遍，將離心出的裸核納米晶分散在環(huán)己烷中保存。

2.3 測(cè)量方法

利用FEI Tecnai TF20測(cè)量制備的NaYbF4納米晶TEM圖像。利用QE65000 (Ocean Optics, USA)光纖光譜儀對(duì)吸收光譜進(jìn)行測(cè)量。1,3-二苯基異苯并呋喃(1,3-diphenylisobenzofuran，DPBF)作為熒光探針。 利用氘燈作為光源，在不同的光照時(shí)間下，采集樣品溶液中DPBF在可見區(qū)的透過光譜。最后根據(jù)Beer-Lambert定律計(jì)算DPBF的吸收光譜。

2.4 吸收光譜檢測(cè)DPBF濃度理論

根據(jù)化學(xué)探針DPBF檢測(cè)ROS理論，在ROS產(chǎn)生過程中，DPBF濃度隨時(shí)間的變化可以被描述如下：

(1)

其中，[DPBF] 和 [ROSi] 分別是 DPBF 和 ROSi的濃度；ki為ROS與DPBF之間的能量傳遞速率；k是DPBF的消耗速率或者描述成DPBF隨時(shí)間衰減的衰減常數(shù)的倒數(shù)。

根據(jù)方程(1)，將式子兩邊積分，溶液中DPBF的濃度可以被描述成如下形式：

[DPBF]=[DPBF0]e-kt

(2)

通過觀察DPBF濃度的變化，就可以說明是否產(chǎn)生了ROS。

將方程(2)，將兩邊取對(duì)數(shù)，可以得到k，即可以獲得ROS產(chǎn)生速率，可以用來評(píng)價(jià)樣品產(chǎn)生ROS的快慢。

k=ln([DPBF]/[DPBF0])/t

(3)

其中，[DPBF]利用溶液中DPBF的吸收系數(shù)A來評(píng)價(jià)，根據(jù)Beer-Lambert定律，透射光譜強(qiáng)度可以描述如下：

It=I0exp(σ[DPBF]L)

(4)

其中，σ為樣品的吸收截面；L為光源在樣品中的路徑。

A=σ[DPBF]L∝ [DPBF]

(5)

根據(jù)方程(4)與(5)，A用來評(píng)價(jià)溶液中DPBF濃度的變化，可以描述成如下形式:

A=ln(I0/It)

(6)

3 結(jié)果與討論

3.1 NaYbF4納米晶形貌表征

利用熱分解法制備，通過調(diào)節(jié)納米晶生長(zhǎng)的時(shí)間來控制納米晶粒徑的大小，將生長(zhǎng)時(shí)間分別控制在10 min、30 min、50 min、70 min、90 min，制備NaYbF4納米晶，其TEM照片如圖1所示，10 min時(shí)，晶核剛剛形成，形態(tài)并不很明顯，平均粒徑在1 nm。當(dāng)生長(zhǎng)時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)，晶核的形態(tài)逐漸形成，平均尺寸大約在4 nm左右。生長(zhǎng)時(shí)間達(dá)到50 min時(shí)，納米晶的形貌較規(guī)則，尺寸也變得較均一，平均粒徑為8 nm。增長(zhǎng)恒溫時(shí)間到70 min，平均粒徑尺寸達(dá)到20 nm。當(dāng)恒溫時(shí)間到90 min，發(fā)現(xiàn)晶粒生長(zhǎng)的很飽滿，其平均尺寸在28 nm。

圖1 不同反應(yīng)時(shí)間的NaYbF4納米晶的TEM圖像Fig.1 TEM images of NaYbF4 nanocrystals at different reaction time

3.2 NaYbF4納米晶分散液中DPBF吸收光譜的測(cè)量

測(cè)量NaYbF4納米晶的ROS產(chǎn)生速率，需調(diào)節(jié)不同尺寸NaYbF4納米晶濃度相一致，在相同濃度下，比較尺寸這一變量對(duì)NaYbF4納米晶ROS產(chǎn)生速率的影響。測(cè)量不同粒徑NaYbF4納米晶(不同反應(yīng)時(shí)間的納米晶)分散液中不同光照時(shí)間下DPBF吸收光譜。將DPBF溶解在環(huán)己烷溶液中，然后不同粒徑NaYbF4納米晶分散液加入DPBF溶液，采用的NaYbF4納米晶的濃度約為5 mg/mL，DPBF的濃度為20 μmol/L，利用980 nm激發(fā)光進(jìn)行光照，光功率為1.3 W，每間隔20 min對(duì)分散液中DPBF的吸收光譜進(jìn)行測(cè)試。圖2 (a-e)給出了不同粒徑NaYbF4納米晶分散液，不同光照時(shí)間的DPBF的吸收光譜。從光譜中可以看出，無(wú)論粒徑尺寸大小，在980 nm激發(fā)光照射下，NaYbF4納米晶都可以使DPBF吸收光譜產(chǎn)生下降，說明不同尺寸的納米晶均可產(chǎn)生ROS，但發(fā)現(xiàn)不同粒徑納米晶分散液中DPBF濃度的變化速率不同。

圖2 NaYbF4納米晶分散液中DPBF的吸收光譜，其中的NaYbF4納米晶生長(zhǎng)時(shí)間不同(a)10 min；(b)30 min；(c)50 min；(d)70 min；(e)90 minFig.2 The absorption spectra of DPBF in solutions of NaYbF4 nanocrystals with different growth time (a)10 min；(b)30 min；(c)50 min；(d)70 min；(e)90 min

3.2 影響ROS產(chǎn)生速率的機(jī)制研究

圖3 不同尺寸的NaYbF4納米晶分散液中DPBF的消耗速率Fig.3 Consumption rates of DPBF in solutions of NaYbF4 nanocrystals with different sizes

圖4 NaYbF4納米晶的尺寸與DPBF的消耗速率之間的關(guān)系Fig.4 Relationship between consumption rates of DPBF and sizes of NaYbF4 nanocrystals

根據(jù)DPBF的吸收光譜，可計(jì)算ROS產(chǎn)生速率(k)，k正比于ROS產(chǎn)率，ROS產(chǎn)率是評(píng)價(jià)光敏劑性能的重要指標(biāo)[20]。圖3給出了不同尺寸的NaYbF4納米晶分散液的k，隨著納米晶尺寸的變化k也發(fā)生明顯的變化。圖4建立了k和NaYbF4納米晶尺寸之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)納米晶尺寸小于8 nm時(shí)，其k隨著尺寸的增加而逐漸增加，繼續(xù)增大納米晶的尺寸，k開始下降。k很可能受兩種因素的影響，一方面受納米晶比表面積的影響，比表面積越大，Yb3+與O2之間的接觸幾率越高，能量傳遞效率增加，k增大。另一方面受晶體質(zhì)量的影響。當(dāng)生長(zhǎng)時(shí)間較短時(shí)，雖然納米晶尺寸較小，與周圍環(huán)境中氧的接觸幾率增加，但是由于生長(zhǎng)時(shí)間較短，其晶格中的畸變和晶格缺陷較多，導(dǎo)致了多聲子輔助的無(wú)輻射弛豫很多，會(huì)影響Yb3+激發(fā)態(tài)能級(jí)與O2之間的躍遷幾率，進(jìn)而影響k。圖4表明相對(duì)于大尺寸的NaYbF4納米晶，小尺寸NaYbF4納米晶的k較高，這表明小尺寸納米晶的比表面積大，增加了Yb3+與O2的接觸，提高了二者間的能量傳遞效率。同時(shí)，在小尺寸范圍內(nèi)，隨著尺寸的增加，k緩慢增加，很可能由于納米晶尺寸增加，晶體質(zhì)量提高，晶體中的缺陷減少，增加了Yb3+激發(fā)態(tài)能級(jí)向O2之間的躍遷幾率，導(dǎo)致k增加。尺寸大于8 nm時(shí)，k降低明顯，這主要因?yàn)榧{米晶的尺寸增加，減少了Yb3+與O2之間的相互作用機(jī)會(huì)，導(dǎo)致了低的k。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NaYbF4納米晶尺寸在8 nm 左右活性氧產(chǎn)率最高，相對(duì)其它尺寸更適合光動(dòng)力療法應(yīng)用。

4 結(jié) 論

利用熱解法制備NaYbF4納米晶，通過控制納米晶的生長(zhǎng)時(shí)間，可以調(diào)節(jié)納米晶的尺寸。生長(zhǎng)時(shí)間為90 min、70 min、50 min、30 min、10 min時(shí)，NaYbF4納米晶尺寸分別為1 nm、4 nm、8 nm、20 nm、28 nm。進(jìn)一步探究了NaYbF4納米晶尺寸對(duì)其k的影響，結(jié)果表明納米晶尺寸在Yb3+與O2的能量傳遞過程中占主導(dǎo)因素。但晶體生長(zhǎng)中的晶格缺陷通過影響Yb3+激發(fā)態(tài)能級(jí)的輻射性質(zhì)，影響k。當(dāng)NaYbF4納米晶尺寸在8 nm時(shí)，其k最大，相對(duì)其它尺寸更適合開展光動(dòng)力治療。