嚴婷 葉艾竹 江恩利 王玉娟

(貴州省人民醫(yī)院(1.婦科；(2.檢驗科，貴州 貴陽 550002)

上皮性卵巢癌(Epithelial Ovarian Cancer，EOC)作為女性生殖系統(tǒng)中致死率最高，預(yù)后差的一種惡性腫瘤[1]，其發(fā)生發(fā)展機制尚未完全闡明。我們此前的研究發(fā)現(xiàn)，GINS2基因在上皮性卵巢癌組織及細胞株中高表達。GINS2基因又稱Psf2，是定位于16號染色體長臂上2區(qū)4帶，全長1196bp，編碼相對分子質(zhì)量為21 000的蛋白質(zhì)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，GINS2在真核細胞中可以通過各種受體、生長因子和蛋白參與細胞周期的調(diào)控，并對細胞DNA的復(fù)制起始及增殖起到十分關(guān)鍵的作用[3]。GINS2在乳腺癌[4]、白血病[5]、肺癌[6]等惡性腫瘤組織中表達明顯升高，提示GINS2在腫瘤的形成、增殖、轉(zhuǎn)移中起重要作用。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由核苷酸的小分子干擾RNA(small interference RNA，siRNA)誘導細胞同源基因mRNA降解、引發(fā)靶mRNA 降解而導致基因表達沉默的過程。RNAi作用機制具有普遍性、特異性、高效性、位置效應(yīng)等特點，已被廣泛應(yīng)用于基因功能研究[7]。本研究擬構(gòu)建穩(wěn)定干擾人GINS2基因的慢病毒載體，并檢測其感染效率，為進一步研究GINS2在上皮性卵巢癌發(fā)生過程中的作用奠定基礎(chǔ)，旨在探討其作為靶向治療的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 GV115慢病毒重組載體(hU6-MCS-CMV-EGFP)、慢病毒包裝載體pHelper 1.0、pHelper2.0(上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司，GeneChem)，293T細胞株(CBTCCCAS，Shanghai，China)，SKOV3細胞株(CBTCCCAS，Shanghai，China)，DMEM(Hyclone)、胎牛血清(上海微科生化試劑有限公司)，吉凱轉(zhuǎn)染試劑(上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司，GeneChem)、限制性內(nèi)切酶(NEB)、T4DNA連接酶(Fermentas)、Taq酶(Vazyme)、質(zhì)粒DNA提取試劑盒(TIANGEN)、SYBR Real-time PCR 試劑盒(Takara，Dalian，China)、鼠抗Flag抗體(Sigma)，鼠抗GAPDH抗體(Santa-Cruz Biotechnology)，羊抗鼠抗體(Sc-2005，Santa-Cruz Biotechnology)。

1.2 實驗方法

1.2.1 GINS2 RNAi慢病毒表達載體的構(gòu)建 根據(jù)GenBank 注冊的GINS2(NM-016095)序列，根據(jù)RNAi序列設(shè)計原則，以GINS2基因為模板，設(shè)計多個19-21ntRNA干擾靶點序列。經(jīng)設(shè)計軟件評估測定后，選取以下序列作為干擾靶點：GATTAACCTGAAACAAAGA，GC%為31.60%。并使用陰性對照序列，Scramble序列：TTCTCCGAACGTGTCACGT。依據(jù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特點，分別合成2對短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)單鏈，兩端加上AgeI和EcoRI限制性內(nèi)切酶位點。除此之外，在正鏈3’端添加TTTTT終止信號，而反鏈5’端添加終止信號互補序列。設(shè)計好的序列送至上海捷瑞生物工程有限公司合成相應(yīng)的DNA oligo單鏈，退火形成具有粘性末端的DNA雙鏈。然后運用 Fermentas T4連接酶與經(jīng)過限制性內(nèi)切酶AgeI和EcoR I雙酶切后線性化的Hu6-MCS-CMV-EGFP載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至TOP10大腸桿菌感受態(tài)細胞中，菌液均勻涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。選取陽性克隆，PCR鑒定正確的質(zhì)粒送測序。按照EndoFree Maxi Plasmid Kit說明書提取質(zhì)粒，將質(zhì)檢合格的質(zhì)粒進行病毒包裝。

1.2.2 慢病毒顆粒的包裝 轉(zhuǎn)染前24 h，用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細胞。培養(yǎng)24 h后，待細胞融合度達到70%～80%時，將重組慢病毒GV115載體20 μg， pHelper 1.0載體質(zhì)粒15 μg及pHelper2.0載體質(zhì)粒10 μg，與同體積的吉凱轉(zhuǎn)染試劑混合均勻，調(diào)整總體積為1mL，室溫下溫育15 min?；旌弦壕徛尤?93T細胞培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。更換為完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后，收集富含慢病毒顆粒的細胞上清液，離心、過濾取病毒濃縮液。分裝后將病毒濃縮液-80 ℃保存于病毒管中。

1.2.3 慢病毒滴度測定 將293T貼壁細胞鋪板，96孔板，每孔4×104個細胞的密度接種，慢病毒液按10倍濃度稀釋5個濃度，將梯度稀釋的含病毒培養(yǎng)基加入各孔中。4 d之后，觀察熒光表達情況，經(jīng)逐孔稀釋及熒光共聚焦檢測病毒滴度。病毒滴度=熒光細胞數(shù)/病毒原液量=2/(1E-6)=2E+6(TU/μL)=2E+9(TU/mL)。

1.2.4 穩(wěn)定干擾GINS2表達的SKOV3細胞株的建立 選取培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的SKOV3細胞，接種于6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，24 h后每孔加入8 μL滴度為5×108TU/mL的shRNA慢病毒顆粒進行感染，采用含有10%胎牛血清的5A培養(yǎng)基。按照MOI=20，用慢病毒感染SKOV3細胞，感染后12 h，去掉上清液，換上新鮮的完全培養(yǎng)基。感染72 h后熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況，評估病毒對于SKOV3細胞的感染效率。

1.2.5 RT-qPCR檢測GINS2基因mRNA的表達 收集細胞(6孔板80%細胞密度)，采用Trizol法提取總RNA。用M-MLV Reverse Transcriptase(美國Promega公司)進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。采用Real-time Quantitative PCR法檢測GINS2基因mRNA的表達情況。PCR反應(yīng)程序參照說明書進行。熒光實時定量PCR法檢測GINS2的表達。選取GAPDH做內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算GINS2相對表達量。以GAPDH為內(nèi)參目的基因。GINS2引物，F(xiàn)orward：5’-CAGAAATGTCGCCTGCTCC-3’;Reverse：5’-GGATTTCGTCTGCCTTCG-3’，擴增片段大小175bp。以GAPDH為內(nèi)參基因，引物Forward：5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’；Reverse：5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’，擴增片段大小121bp。

1.2.6 Western Blot 檢測GINS2基因蛋白的表達 收集各組細胞，裂解液裂解細胞后提取總蛋白。取上清BCA法測定蛋白濃度。進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。以含5%脫脂牛奶的TBST溶液室溫封閉PVDF膜1 h，加入一抗(鼠抗Flag，鼠抗GAPDH 1∶2 000)4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次10 min。加入羊抗鼠二抗(1∶2 000)室溫下孵育PVDF膜2 h。充分洗滌后，ECL法顯色，曝光成像，記錄實驗結(jié)果，判斷GINS2蛋白的表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 GINS2慢病毒干擾表達載體鑒定 體外合成的寡核苷酸上游單鏈和下游單鏈在體外退火后形成雙鏈DNA，與線性化GV115載體連接，連接產(chǎn)物命名為psc24135。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸感受態(tài)細胞中。取150 μg菌液加入含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。挑取單個菌落為模板，進行PCR擴增，反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s；55 ℃ 30 s； 72 ℃ 30 s，22次循環(huán)； 72 ℃ 5 min。PCR結(jié)束后，取產(chǎn)物行電泳檢測。psc24135電泳結(jié)果顯示：泳道4、5、7、8是連接成功的shGINS2，而泳道6表示連接未成功 (圖1)。由此判斷泳道4、5、7、8為陽性克隆，保存泳道4的結(jié)果，命名為psc24135-1，并進行測序。DNA結(jié)果中顯示shRNA片段已成功插入到Hu6-MCS-CMV-EGFP載體，說明成功構(gòu)建針對GINS2基因的RNA干擾重組質(zhì)粒，對陽性克隆進一步擴增菌液提取質(zhì)粒用于病毒包裝(圖1)。

注：泳道1：陰性對照(ddH2O)，泳道2：空載體自連對照，泳道3： Marker，泳道4～8：單克隆psc24135-1、2、3、4、5。電泳結(jié)果顯示：泳道4、5、7、8是連接成功的shGINS2，而泳道6表示連接未成功。

圖1 干擾載體的陽性克隆鑒定

構(gòu)建的重組表達載體質(zhì)粒經(jīng)DNA直接測序法鑒定，與BLAST軟件比對顯示，插入的片段與GINS2 RNA干擾慢病毒載體質(zhì)粒(psc24135-1)的干擾片段完全相符，見圖2。

注：插入片段序列位于198～254。

圖2 GINS2 RNA干擾慢病毒載體質(zhì)粒的DNA測序結(jié)果

2.2 慢病毒載體感染293T細胞株以及慢病毒的包裝和滴度測定 當293T細胞的生長狀態(tài)達到產(chǎn)生慢病毒實驗的要求時，將GINS2干擾質(zhì)粒、慢病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，48h后收集病毒粗提液進行濃縮，利用熒光法測定此靶點的病毒滴度，結(jié)果為5×108TU/mL，顯示病毒成功包裝，可用于后續(xù)研究。

2.3 穩(wěn)定干擾GINS2基因表達的SKOV3細胞的建立 含有GINS2基因RNA干擾序列的慢病毒對上皮性卵巢癌細胞株SKOV3細胞成功，感染后72 h左右，熒光顯微鏡觀察報告GINS2基因的表達情況，熒光率即為陽性感染率；結(jié)果顯示SKOV3細胞感染效率達到80%，細胞狀態(tài)正常(圖3)。

2.4 重組慢病毒對SKOV3細胞GINS2基因表達及蛋白表達的影響 RT-qPCR的方法和Western Blot法檢測SKOV3細胞中GINS2基因敲減后mRNA的表達量及蛋白表達量，進而判斷靶點的干擾效果。定量PCR結(jié)果可以看出，經(jīng)shRNA慢病毒感染后，與對照組對比，實驗組SKOV3細胞中GINS2基因在mRNA水平的表達量受到抑制(P=0.000 001，P<0.05)，沉默效率達到91.7%(圖4A)。從Western Blot的結(jié)果可以看出，GINS2組未檢測到蛋白，靶點對GINS2基因的外源表達有明顯沉默作用，因而是有效靶點(圖4B)。

注：shCtrl為陰性對照組，shGINS2為shRNA組。4A：RT-PCR檢測mRNA表達豐度，shGINS2組與shCtrl組相比**P<0.05。4B：Western Blot檢測蛋白表達量的變化。

圖4 GINS2基因敲減后mRNA及蛋白表達水平的比較

3 討 論

GINS復(fù)合物(Go，Ichi，Nii，and San; five，one，two，and three in Japanese)是于2003年通過基因篩選的方法首次發(fā)現(xiàn)的一個核酸復(fù)制因子，它在體內(nèi)形成一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在核酸復(fù)制初期結(jié)合到染色體上并在核酸的延伸過程中發(fā)揮重要作用[8-10]。GINS復(fù)合物是一種復(fù)制解旋酶，在移動到復(fù)制叉前打開DNA雙鏈。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠和酵母模型中，GINS復(fù)合體與微型染色體的修復(fù)相關(guān)，調(diào)節(jié)DNA復(fù)制的發(fā)生和發(fā)展。相繼發(fā)現(xiàn)GINS復(fù)合體與人類DNA的復(fù)制相關(guān)[3]。也有文獻表明，DNA復(fù)制相關(guān)蛋白在不同細胞中有不同的作用，如在決定中心體復(fù)制數(shù)量和疾病發(fā)生的不同階段方面，GINS均發(fā)揮了一定功能，特別是與染色體的分離密切相關(guān)[11]。本研究前期結(jié)果顯示，GINS2基因在上皮性卵巢癌組織和細胞株中均高表達，進一步明確GINS2基因在上皮性卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其分子機制將有助于發(fā)展上皮性卵巢癌的治療措施，從而進一步提高患者生存率。

慢病毒為一類逆轉(zhuǎn)錄病毒的總稱，由慢病毒改建而來的載體系統(tǒng)以高效且穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)移效率在基礎(chǔ)和應(yīng)用研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。它能夠?qū)崿F(xiàn)持續(xù)的基因傳遞、將載體穩(wěn)定的整合到宿主基因組;能夠感染分裂和非分裂細胞;載體轉(zhuǎn)導后并不表達病毒蛋白[12]。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達的一種現(xiàn)象，在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。其利用RNA介導，特異性地阻斷和降低目的基因的表達[13]。將慢病毒載體作為RNAi技術(shù)的載體，可以結(jié)合兩者優(yōu)勢，特異性抑制哺乳動物的各類細胞中基因的表達，成為基因功能研究和基因治療的有力手段[7]。

本研究針對GINS2基因設(shè)計的特異性siRNA靶序列，成功構(gòu)建了以GFP為報告基因的GINS2 shRNA慢病毒載體。采用GV115、pHelper 1.0及pHelper2.0三載體包裝系統(tǒng)確保慢病毒載體系統(tǒng)安全性，該系統(tǒng)包括轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒和包膜質(zhì)粒。病毒感染目的細胞不會再感染其他細胞，不會利用宿主細胞產(chǎn)生新的病毒顆粒。GV115載體中含有HIV的逆轉(zhuǎn)錄、包裝、整合元件以及輔助元件，并帶有GFP作為報告基因和puro抗性基因作為抗性標記，用于觀察目的蛋白表達情況和篩選穩(wěn)定感染的細胞株。pHelper 1.0載體中含編碼病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白、特異性的酶和相關(guān)調(diào)節(jié)因子的基因。pHelper2.0載體中含有提供病毒包裝所需要的包膜蛋白的基因。病毒包裝時，將這三種病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入包裝細胞293T，各載體產(chǎn)生病毒各組成蛋白，并包裝成病毒顆粒。

PCR陽性克隆測序結(jié)果表明，GINS2基因成功插入GV115載體并重組為慢病毒載體GV115-GINS2-RNAi。將GV115-GINS2-RNAi質(zhì)粒與病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，結(jié)果顯示，慢病毒可高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)入上皮性卵巢癌SKOV3細胞，感染效率達到80%。證明成功構(gòu)建了GV115-GINS2-RNAi慢病毒載體，并獲得GINS2慢病毒顆粒。病毒滴度可以反映病毒感染靶細胞的能力及效率，是評價包裝細胞分泌感染性病毒顆粒的主要指標。

綜上，本研究采用慢病毒介導RNAi技術(shù)構(gòu)建特異靶向GINS2基因的慢病毒RNA干擾系統(tǒng)，為后續(xù)研究GINS2基因沉默后上皮性卵巢癌細胞生物學功能改變及分子機制的研究打下了堅實的基礎(chǔ)。