張云，林毅鴻，葉揚揚，艾鳳偉

(徐州醫(yī)科大學藥學院，徐州 221004)

姜黃素(curcumin)是從姜科植物郁金、莪術(shù)、姜黃等中藥根莖中提取的一種小分子多酚類物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗突變、抗炎、抗氧化、抗病毒等藥理活性[1-5]，且抗癌譜廣、毒副作用低、不良反應(yīng)小[6]。但由于姜黃素水溶性差，易被氧化降解，體內(nèi)吸收困難，生物半衰期短，從而限制其在臨床上的應(yīng)用[7-8]。以高分子材料包裹疏水藥物形成載藥納米粒，可提高裝載藥物的水溶性、穩(wěn)定性和生物利用度，改善藥物性質(zhì)，達到緩釋、靶向給藥的目的，增加療效，降低毒副作用等[9-11]。

白蛋白是一種內(nèi)源性生物大分子材料，具有無毒性、生物可降解性、無免疫原性及在生物體內(nèi)可代謝為無害的代謝產(chǎn)物等特點[12]。白蛋白納米載體材料主要有牛血白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、卵白蛋白(ovalbumin，OVA)及人血白蛋白(human serum albumin，HSA)等。其中BSA來源豐富、價格低廉且易于純化等被廣泛用于制備白蛋白納米載藥系統(tǒng)。BSA分子中含有的氨基和羧基等功能基團可采用特定的配體對白蛋白納米粒表面進行修飾，半乳糖修飾的牛血清白蛋白(Gal-BSA)可實現(xiàn)荷載藥物肝靶向[13]。筆者在本研究通過BSA結(jié)構(gòu)中氨基和乳糖酸結(jié)構(gòu)中羧基進行酰胺化反應(yīng)合成Gal-BSA，以姜黃素為模型藥物，Gal-BSA為載體材料，采用去溶劑化法制備半乳糖修飾的姜黃素白蛋白納米粒(Gal-BSA NPs)，并考察納米粒的形態(tài)、粒徑分布、Zeta電位、包封率、載藥量、體外釋放等。報道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器 EL104電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，感量：0.1 mg)，F(xiàn)TIR-8400s傅立葉紅外光譜儀(日本島津公司)，PSS 380ZLS激光納米粒度/電位儀(美國Particle Size Sytem公司)，透射電子顯微鏡(H-600，日本日立公司)，UV-2450紫外分光光度儀(日本島津公司)，KQ-500型超聲波清洗器(昆山市超聲儀有限公司)，SHZ-B旋轉(zhuǎn)氣浴恒溫振蕩器(金壇市金分儀器有限責任公司)，F(xiàn)EI Tecnai G2T12透射電鏡儀(美國FEI公司)，25L冷凍干燥機(美國LABCONCO公司)，85-1恒溫磁力攪拌器(國華儀器公司)，TGL-16C高速離心機(上海安亭科學儀器廠)，透析袋(截留相對分子質(zhì)量為2 000和12 000)。

1.2試藥 姜黃素對照品(中國食品藥品檢定研究院，含量>99%，批號：150324)，姜黃素原料(鄭州荔諾生物制品有限公司，含量>98%，批號：20140912)，牛血清白蛋白(上海國藥試劑公司，含量>96%，批號：20150322)，乳糖酸(上海國藥試劑公司，含量≥98.0%，批號：20150218)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，上海國藥試劑公司，含量97.0%～102.0%，批號：20150127)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳酰二亞胺(EDC，上海國藥試劑公司，含量≥99.0%，批號：20150106)，2-嗎啉乙磺酸(MES，阿拉丁，含量≥99%，批號：1406003)，2，4，6-三硝基苯磺酸(Sigma公司，含量5%，批號：1001910376)，碳酸鈉(上海國藥試劑公司，含量≥99.8%，批號：20090102)，磷酸二氫鉀(上海國藥試劑公司，含量≥99.5%，批號：20070405)，磷酸氫二鈉(上海國藥試劑公司，含量≥99%，批號：20060103)，乙二胺四乙酸二鈉(上海國藥試劑公司，含量≥99%，批號：20110312)，聚山梨酯80(上海國藥試劑公司，含量>99%，批號：20100518)無水乙醇(上海國藥試劑公司，含量≥99%，批號：20150827)。

2 方法與結(jié)果

2.1Gal-BSA的合成 將乳糖酸適量(220 mg)溶解于MES溶液10 mL中，用0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至5。加入EDC 220 mg和NHS 110 mg，活化反應(yīng)30 min。然后用0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至8，將BSA160 mg加入上述溶液，500 r·min-1攪拌反應(yīng)48 h，讓乳糖酸交聯(lián)到白蛋白分子表面。所得溶液在透析袋(截留相對分子質(zhì)量12 000)中透析3 d，每天換水3次，冷凍干燥得Gal-BSA。

2.2Gal-BSA的紅外表征 取適量的Gal-BSA、BSA及乳糖酸樣品，分別與溴化鉀(KBr)粉末經(jīng)混勻、研磨、壓片。FTIR-8400S測定各樣品的紅外光譜。見圖1。如圖1a所示，BSA在約1647 cm-1及1541 cm-1處吸收峰分別為酰胺I、II的特征峰；圖1 b為乳糖酸的FTIR譜圖，其中約1743 cm-1處為羰基的吸收峰，約3355 cm-1處為羧基氫的吸收峰；圖1 c為Gal-BSA的FTIR譜圖，其中約1647 cm-1及1541 cm-1處吸收峰相比BSA明顯變強變寬，說明產(chǎn)物中酰胺基團數(shù)目的增加，證實目標產(chǎn)物Gal-BSA的生成。

圖1 BSA(a)、乳糖酸(b)、Gal-BSA(c) 的紅外圖譜

Fig.1InfraredspectrumofBSA(a)，Gal(b)，Gal-BSA(c)

2.3Gal-BSA NPs的制備 采用去溶劑法[14]制備BSA NPs，稱取BSA40 mg溶于10 mmol·L-1氯化鈉溶液2 mL，0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8～9，取適量的姜黃素溶于乙醇1 mL，以0.7～1.0 mL·min-1在磁力攪拌500～600 r·min-1下滴加，按試驗設(shè)計量滴加剩余乙醇，后加入8%戊二醛60 μL，交聯(lián)攪拌24 h，即得黃色BSA NPs的乳狀液。

Gal-BSA NPs的制備與BSA NPs制備相似，取GAL-BSA40 mg溶于10 mmol·L-1氯化鈉溶液2 mL，0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至8～9，取適量的姜黃素溶于乙醇1 mL，以0.7～1.0 mL·min-1在磁力攪拌500～600 r·min-1下滴加，按試驗設(shè)計量滴加剩余乙醇，后加入8%戊二醛60 μL，交聯(lián)攪拌24 h，即得黃色的Gal-BSA NPs乳狀液。

2.4包封率和載藥量的測定

2.4.1姜黃素紫外標準曲線的建立 精密稱取姜黃素對照品5 mg，乙醇溶解并定容到50 mL量瓶中，得100 mg·L-1的儲備液，分別吸取0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL的儲備液置于10 mL量瓶中，乙醇定容，配制濃度為0.5，1，2，4，6，8 mg·L-1的標準溶液，在波長426 nm處測定吸光度(A值)，以A值對姜黃素濃度(C)進行線性回歸，得回歸方程：A=0.1474C+0.0143。

2.4.2Gal-BSA NPs包封率和載藥量的測定 精密移取一定量的Gal-BSA NPs膠體溶液，在12 000 r·min-1下超速離心15 min，精密移取上清液0.5 mL，用乙醇定容至10 mL量瓶，于波長426 nm處測定A值，計算未包封姜黃素的量(WS)。另精密吸取Gal-BSA NPs膠體溶液0.5 mL，用乙醇溶解載藥納米粒定容至50 mL量瓶，波長426 nm處測定A值，計算膠體溶液中姜黃素的總量(WT)。

包封率(entrapment efficiency，EE)、載藥量(drug loading，DL)計算公式如下：EE(%)=(WT-WS)/WT×100%；DL(%)=(WT-WS)/WZ×100%；其中，WT為藥物總量，WS為未包封的藥物總量，WZ為載體材料重量。

2.5Gal-BSA NPs制備工藝優(yōu)化 為了更好地優(yōu)化Gal-BSA NPs的制備工藝，考察Gal-BSA濃度、乙醇滴加體積、pH值等影響因素，見表1。結(jié)果如下：控制Gal-BSA濃度和乙醇體積不變，Gal-BSA溶液的pH值為6～8時，Gal-BSA NPs的粒徑變小，包封率無明顯變化；控制Gal-BSA溶液的pH值和乙醇體積，Gal-BSA濃度為15～40 mg·mL-1時，Gal-BSA NPs的粒徑變大，包封率變大；控制Gal-BSA濃度和pH值，當乙醇的滴加體積為5～10 mL時，Gal-BSA NPs的粒徑變大，包封率無明顯變化；綜合考慮最小粒徑和最大包封率的Gal-BSA NPs優(yōu)化制備工藝為：Gal-BSA濃度為30 mg·mL-1、乙醇滴加體積為5 mL、Gal-BSA的pH值為8。

表1 Gal-BSA NPs的制備影響因素實驗結(jié)果

樣品數(shù)pH值BSA濃度/(mg·mL-1)乙醇體積/mL 粒徑/nm包封率/%16205聚集—27205286.3±103.162.738205246.3±76.964.148405386.0±41.779.458155213.9±76.658.168305267.1±78.378.278208304.3±114.158.9882010370.9±179.269.5

2.6三硝基苯磺酸(TNBS)顯色法測Gal-BSANPs表面氨基修飾度 BSA納米顆粒2 mL高速離心后，重新分散在0.1 mol·L-1碳酸氫鈉鹽緩沖液(pH 值8.5)2 mL中，形成濃度約為0.5 mg·mL-1溶液，移取分散液2 mL，加入0.01%的TNBS水溶液1 mL，混合溶液在37 ℃下500 r·min-1反應(yīng)2 h，12 000 r·min-1離心20 min，取上清液用分光光度計在波長345 nm處測定未反應(yīng)的TNBS。

乳糖酸修飾的BSA納米顆粒2 mL，高速離心后重新分散0.1 mol·L-1碳酸氫鈉鹽緩沖液(pH 值8.5)2 mL中。游離氨基修飾的BSA納米顆粒含量用上述TNBS方法進行測定。通過對半乳糖化后所得到的量與原來游離氨基的量的比較，半乳糖化過程的效率通過半乳糖化的氨基基團的比例計算。

無乳糖酸修飾的BSA用TNBS顯色法測得的A值為0.630，經(jīng)乳糖酸修飾的BSA表面氨基所測得的A值為0.540，空白水溶液測得A值為0.145，即耦聯(lián)于BSA納米粒表面的乳糖酸密度為18.6%。

2.7Gal-BSA NPs外觀形態(tài)與粒徑分布 將納米粒懸液滴加至載有碳膜的銅網(wǎng)上，濾紙吸干液體，室溫下自然干燥，透射電鏡觀察其形態(tài)，結(jié)果見圖2?？梢娂{米粒為邊緣光滑、規(guī)整的球形粒子。

圖2 Gal-BSA NPs透射電鏡、粒徑分布及電位

Fig.2TEMimage,particlesizedistributionandzetapotentialofGal-BSANPs

采用NicompTM380/ZLS型電勢及粒度測定儀測定Gal-BSA NPs的粒徑和Zeta電勢。粒徑測定參數(shù)如下：He-Ne激光(波長635 nm)，折光率和黏度分別為n=1.333和η=0.933 cp，測定溫度23 ℃。Zeta電勢測定參數(shù)如下：He-Ne激光(波長635 nm)，散射角θ=14°，測定溫度23 ℃，結(jié)果粒徑分布(267.1±78.3)nm，Zeta電位在-42.51 mV。

2.8體外釋放度的研究 采用動態(tài)透析法[15-17]考察載藥納米粒的緩釋性能。稱取適量納米粒(含姜黃素約1.5 mg)重新分散在含1%聚山梨酯80的PBS緩沖液(pH值5.9)10 mL中，精密移取溶液7 mL，裝入經(jīng)過處理的透析袋(截留相對分子質(zhì)量12 000)中，兩端用透析袋夾緊，置于含1%聚山梨酯80的PBS緩沖液(pH值5.9)200 mL中，恒溫搖床上震蕩，控制溫度(37.0±0.5)℃，轉(zhuǎn)速80～100 r·min-1，分別于0.25，0.5，1，3，6，9，12，24，36，48 h，取釋放液4 mL，紫外分光光度法測定姜黃素的含量，并迅速補充含1%聚山梨酯80的PBS緩沖液(pH值5.9)4 mL。樣品以含1%聚山梨酯80的PBS緩沖液(pH值5.9)為空白對照，波長426 nm處測定吸光度計算姜黃素含量。取3次實驗的平均值，以釋藥量對時間作圖，繪制載藥納米粒的釋放曲線。結(jié)果見圖3。由圖3知，Cur原料藥在釋放介質(zhì)中釋放較快，8 h的釋放量近100%；而Gal-BSA NPs在 8 h釋藥量為20%，在48 h釋藥量>80%，具有明顯緩釋特征。

圖3 姜黃素與Gal-BSA NPs體外釋藥曲線

Fig.3InvitrodrugreleasecurveofCurandGal-BSANPs

2.9Gal-BSA NPs 體外釋藥模型擬合 分別按零級、一級、Higuchi方程對姜黃素納米粒體外釋藥行為進行擬合，得到擬合方程及相關(guān)系數(shù)，見表2。相關(guān)系數(shù)越大，擬合度越好，零級方程表示藥物恒量釋放即控釋釋放，一級方程表示恒速釋放，Higuchi方程常用來衡量制劑的緩釋性能[18]。由表2可見零級方程擬合的相關(guān)系數(shù)為0.952 3，一級方程擬合的相關(guān)系數(shù)為0.845 3，Higuchi方程的相關(guān)系數(shù)為0.8928，可以得出姜黃素納米粒的體外釋放更符合零級方程的描述，主要為控釋釋放。

表2 體外釋藥模型擬合結(jié)果

Tab.2Fittingresultsofinvitrodrugreleasemodel

擬合類型擬合方程相關(guān)系數(shù)(R2)零級方程Q=0.016 6t+0.083 60.952 3一級方程ln(1-Q)=-0.049 7t-0.055 960.845 3Higuchi方程Q=0.1118t1/2+0.020 10.892 8

3 討論

本研究以姜黃素作為模型藥物，選擇半乳糖修飾的牛血清白蛋白作為載體材料，采用去溶劑法制備姜黃素半乳糖化白蛋白納米粒，單因素考察優(yōu)化處方工藝。本實驗制備的納米粒具有良好的外觀形態(tài)、粒徑分布，提高荷載藥物穩(wěn)定性和溶解度，延長藥物釋放速率。

制備工藝優(yōu)化實驗中主要以納米粒的外觀形態(tài)、粒徑分布和包封率為主要考察指標。選擇去溶劑法制備納米粒，考察載體濃度、乙醇滴加體積、pH值等影響因素，此外，還考察了乙酸乙酯、丙酮等去溶劑對納米粒形成的影響，最后選擇乙醇作為最終的去溶劑，體外溶出實驗中，由于姜黃素在水中的溶解度較低，為了模擬制劑在體內(nèi)的釋放行為，本實驗以含1%聚山梨酯80的PBS緩沖液(pH 值5.91)為釋放介質(zhì)，符合漏槽條件，同時姜黃素在該實驗條件下穩(wěn)定性較好。